Name: single-molecule imaging of lateral mobility and ion channel activity in lipid bilayers using total internal reflection fluorescence (tirf) microscopy
Uploaded: 2023-02-17T14:40:00
Duration: 8 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-Molecule Imaging of Lateral Mobility and Ion Channel Activity in Lipid Bilayers using Total Internal Reflection Fluorescence TIRF Microscopy Video at J

אנו מודים לביאטה ניטשקה על עזרתה בהכנת חלבונים ולרובין גוש, מיכאל שוויקרט (שטוטגרט) ומקסימיליאן אולבריך (פרייבורג) על דיונים מעמיקים. עבודה זו נתמכה על ידי מרכז המחקר שטוטגרט ביולוגיה של מערכות (SRCSB) ומענק מקרן באדן וירטמברג (BiofMO-6 to SN).

אנחנו לא מצהירים על ניגוד עניינים.

הפרוטוקול המוצג כאן מספק מבוא לשימוש בקרומי DIB כדי לחקור את יחסי הגומלין בין תנועת תעלת יונים צידית ותפקוד התעלה באמצעות מיקרוסקופ TIRF של מולקולה יחידה. כדי להשיג את הנתונים הטובים ביותר האפשריים, הכנת ממברנות DIB יציבות עם כמה שיותר ערוצים מופרדים היטב היא חיונית להשגת סדרות זמן של חלקיקים בודדים, אשר ניתן לנתח באופן משביע רצון.
פרמטרים קריטיים שיש לייעל כוללים את בחירת השומנים, ריכוז השומנים בשלב השמן, וריכוזי החלבונים וחומרי הניקוי בטיפות המימיות. השומנים המשמשים הם יוצאי דופן, בכך שהם אינם מראים מעבר פאזה ברור בטמפרטורות נמוכות. DPhPC הוא ליפיד נפוץ לייצור מערכות קרום יציבות40. באופן עקרוני, כל שומנים אשר שומרים על הסביבה הנוזלית שלהם בטמפרטורות נמוכות עשויים להתאים ליישום זה. בנוסף, השומנים לא צריכים להיות רגישים לחמצון. ריכוז חומר הניקוי בטיפות צריך להיות נמוך ככל האפשר כדי למנוע קרע בממברנה. ממברנות יציבות ושיעורי שילוב חלבון טובים מושגים בדרך כלל עם ריכוזי חומרי ניקוי מתחת לריכוז המיצלה הקריטי (cmc), בהתחשב בכך שחלבון הממברנה אינו מזרז.
אם קרומי DIB אינם סובלים דטרגנטים ספציפיים21,41, או אם החלבונים אינם משתלבים מתמיסת דטרגנטים נמוכה בקרומי DIB, ניתן תחילה להרכיב מחדש את תעלות החלבון לשלפוחיות שומנים חד-למלריות קטנות (SUV), אשר לאחר מכן מאוחות לקרומי DIB מצד הטיפה, כפי שהוכח בהצלחה עבור E. coli MscL 42 . לעיתים, קרומי DIB אינם נוצרים מכיוון שריכוז השומנים בשלב השמן נמוך מדי. כדי למנוע התפוצצות של קרומי DIB, יש גם להיות מודעים לכך שהלחץ האוסמוטי בין ההידרוג'ל לטיפה חייב להיות מאוזן במדויק מבלי להשפיע על שטף Ca2+ מסיס לטרנס יתר על המידה. נראה שעובי האגרוז האופטימלי וגודל הרשת חיוניים לצפייה בדיפוזיה של חלבוני הממברנה. יש להימנע מכל ייבוש של שכבת האגרוז. ניתן לקבוע את העובי באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי17. על ידי שינוי ריכוז האגרוז, הנפח ומהירות הסיבוב במהלך ציפוי הסחיטה, ניתן לייעל את גודל ועובי הרשת של ההידרוג'ל. שים לב, עם זאת, שעובי שכבת ההידרוג'ל משפיע על ניגודיות התמונה. כדי ללכוד חלבוני ממברנה ב-DIBs, ניתן להחליף את הידרוג'ל האגרוז באגרוז מסונתז בהתאמה אישית, ללא הצלבה, בשינוי Ni-NTA ובהתכה נמוכה כדי ללכוד אותם באמצעות His-tag17. רקע פלואורסצנטי גבוה מדי נגרם לעתים קרובות על ידי קרע של קרום DIB. זו בעיה במיוחד עם תאים מרובי בארות, מכיוון שהצבע הרגיש Ca2+ מתפזר לתוך ההידרוג'ל. במקרה זה, יש להימנע מבארות סמוכות. הלבנה פלואורסצנטית של הצבע הרגיש Ca2+ מעל הממברנה לא אמורה להיות גורם מגביל משמעותי, שכן היא מוחלפת על-ידי צבעים לא מעוררים בחלק הארי של הטיפה (איור 3A) מחוץ לשדה האוונסצנטי של TIRF. דיוק הלוקליזציה של החלבון ניתן על ידי דיוק התאמת הכתמים וגודל הפיקסלים.
אותות פלואורסצנטיים חלשים יכולים להיגרם על ידי שטף Ca2+ נמוך דרך הערוץ. סיבות אפשריות כוללות: (i) הגדרות TIRF לא מדויקות (למשל, עוצמת לייזר), (ii) לחץ Ca 2+ אוסמוטי על פני הממברנה, או (iii) החדירות הפנימית של Ca2+ של התעלות נמוכה מדי. כדי להתמודד עם הבעיה הראשונה, עוצמת הלייזר, זווית TIRF ורווח המצלמה צריכים להיות אופטימליים. ניתן להתגבר על שתי הבעיות האחרונות על ידי יישום פוטנציאל חשמלי על פני הממברנה 2,43. עם זאת, יישום מתחים חיצוניים יכול לעוות את התוצאה, שכן אפקטים חשמליים יכולים להשפיע על פתיחת התעלה של תעלות יונים מגודרות ליגנד או מכנורגישות שלמעשה אינן מבוקרות מתח. דוגמאות לתעלות כאלה הן טרנסלוקאז החלבון המיטוכונדריאלי TOM-CC27, ותת-היחידה יוצרת-הערוצים שלו Tom40 26,44,45,46. לבסוף, יש לציין כי, החדרת חלבוני ממברנה לתוך ממברנות DIB בכיוון מסוים כדי להשיג פונקציונליות רצויה היא מסובכת, ומחקרים כמותיים הם נדירים47,48. במקרים מסוימים, הכיוון של החלבונים המשולבים הוא אקראי. זוהי בעיה רצינית לחקר חלבוני ממברנה, מכיוון שחלבוני ממברנה מסוימים מופעלים רק בצד אחד של הממברנה.
מיקרוסקופ TIRF הוא שיטה רבת עוצמה לטיפול באירועים של מולקולה בודדת בממברנות נתמכות מישוריות49. דוגמאות לכך כוללות הבהרת מסלול הרכבה וקיפול של חלבוני תעלה כגון α-המוליזין50, פרפרינגוליזין O 51 ו-OmpG52. מחקרים אלה כללו FRET כטכניקה נוספת. בנוסף, הפעלת תעלת היונים המכנורגישה MscL נחקרה בעבר על ידי גירוי מכני של DIB bilayers42 נתמך באמצעות מדידות נוכחיות. בהתבסס על עבודה זו, מחקרים עתידיים יוכלו לשלב את הפלטפורמה המתוארת כאן עם ניסויי FRET של מולקולה בודדת כדי לטפל בתעלות רגישות למכנו ברמת המולקולה הבודדת באופן אופטי17. הזרקת חיץ לתוך הטיפה, מתיחת החד-שכבה הפנימית של DIB, או קשירה ממוקדת של תעלות בודדות להידרוג'ל הבסיסי יכולה לשמש למחקר נוסף לא רק את המנגנון הפיזיקלי של תעלות המופעלות מכנית, המגיבות למתח ו/או עקמומיות הממברנה כפי שמוצג עבור MscL ו-MscS, תחום שתי הנקבוביות K+-channels, TREK-1, TREK-2, ו-TRAAK, ו-PIEZO (לסקירה, ראו53), אך גם קשירה מקומית לשלד התאיים, כפי שמוצג עבור תעלת היונים הרגישה למגע NOMPC54,55.

הפרוטוקול הנוכחי נועד לתאר כיצד לחקור את המתאם בין ניידות הממברנה לבין חדירות תעלות היונים של חלבוני ממברנה בממברנות דו-שכבתיות של ממשק טיפות (DIB) 1,2,3 הנתמכות על ידי פולימרים.
הטכניקה הנוכחית משלימה מערך מרשים של כלים אנליטיים אופטיים ופני שטח מתקדמים, כגון מעקב אחר חלקיקים בודדים 4,5, ספקטרוסקופיית מתאם פלואורסצנטי6,7 ומיקרוסקופ כוח אטומי במהירות גבוהה 8,9,10. אלה מספקים תובנות חשובות לגבי ההרכב והמבנה הדינמיים של ממברנות המשפיעות על תגובות מבוססות קרום11,12,13. בעוד התנועה והדיפוזיה הצידית של חלבונים תלויה בצפיפות המקומית של חלבונים בקרום, מולקולות חלבון בודדות יכולות להילכד גם ברפסודות שומנים14 ובאינטראקציות חלבון-חלבון15,16. בהתאם לתחומי החלבונים הבולטים מהממברנה לסביבה החוץ תאית או הציטוזול, ניידות החלבונים יכולה להשתנות מניידות גבוהה לחוסר תנועה לחלוטין. עם זאת, בשל מורכבות הממברנה והמבנים ההיקפיים שלה, לעתים קרובות קשה לפענח את יחסי הגומלין בין אופי הניידות הצידית לבין תפקוד החלבונים17.
ממברנות DIB הוכיחו את עצמן כפלטפורמה יעילה לאנליזות ביופיזיקליות של מולקולות בודדות של חלבוני ממברנה 18,19,20,21,22. הם נוצרים על ידי הרכבה עצמית של שומנים באמצעות מגע של טיפות מימיות עם מצעים נתמכי הידרוג'ל בשלב שומנים/שמן. בדומה לדו-שכבות השומנים הנתמכות הנפוצות (SLBs)1,23,24,25, DIBs מאפשרים כוונון מקומי של הניידות הצידית על ידי קשירה זמנית או קבועה של חלבונים למטריצה הפולימרית כאשר הם מתפקדים עם ליגנדות מתאימות17. האחרון יכול לשמש מערכת מודל לתהליכים ביוכימיים בקרום התא עם התפלגות חלבון הטרוגנית10.
הגישה הניסויית המתוארת כאן מסתמכת על הפלואורסצנטיות של צבעים רגישים ל-Ca 2+ כדי למדוד את שטף היונים Ca 2+ דרך תעלות בודדות בסמיכות לממברנה 2,22 באמצעות מיקרוסקופ TIRF. גישה אופטית זו מגבילה את הארה של הדגימה למרחק קרוב לממברנה, אשר, בשל התכונות הפיזיות של אור העירור האוונסנטי, מוביל להפחתה משמעותית של הרקע הפלואורסצנטי. האחרון הוא תנאי מוקדם אם נדרשת רזולוציה מרחבית וזמנית גבוהה לזיהוי מולקולות בודדות. בניגוד לשיטות אלקטרופיזיולוגיות קלאסיות26,27, אין צורך במתחי ממברנה כדי לחקור שטף יונים דרך תעלות בודדות. יתר על כן, השיטה אינה דורשת סימון בצבעים פלואורסצנטיים או במולקולות שעלולות להפריע לתנועה הרוחבית של התעלות בקרום.
השיטה שימושית במיוחד לחקר תעלות חלבונים המשובצות בממברנה ברמת המולקולה הבודדת ללא שימוש באלקטרופיזיולוגיה קלאסית. באמצעות שימוש בערוץ מוליך חלבון מיטוכונדריאלי TOM-CC מ-Neurospora crassa28,29,30 ו-OmpF, התומך בדיפוזיה של מולקולות הידרופיליות קטנות על פני הממברנה החיצונית של Escherichia coli17,31, אנו מדגימים כיצד ניתן לחקור ולהתאים את ניידות הממברנה ופעילויות התעלה של שני החלבונים. אנו מציעים כי גישה זו, למרות שהיא מותאמת ל- TOM-CC ו- OmpF, יכולה להיות מיושמת בקלות על תעלות חלבון אחרות.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850356C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x Oil objective Apochromat N.A. 1.49</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRD01991</td>
			<td>TIRF microscope&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Hoffmann modulation contrast objective NA 0.25&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Microscope to assess DIB membrane formation&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x objective N.A. 0.25</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRL00102</td>
			<td>TIRF microscope&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40x Hoffmann modulation contrast objective NA 0.55</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Microscope to assess DIB membrane formation&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>488 nm laser, 100 mW&#160;&#160;</td>
			<td>Visitron</td>
			<td></td>
			<td>TIRF microscope&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive tape</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#196;kta pure&#160;&#160;</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td></td>
			<td>Protein purification system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford assay kit, Pierce</td>
			<td>Thermo Fisher&#160;</td>
			<td>23236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Roth</td>
			<td>5239.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chelax 100 resin</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>143-2832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>MC1024452500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis cassettes Slide-A-Lyzer 20 k MWCO</td>
			<td>Thermo Fisher&#160;</td>
			<td>87735</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DIB chamber&#160;</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
			<td>PMMA chamber for DIB membranes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital power meter and energy console</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PM100D</td>
			<td>Laser power meter&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Roth&#160;</td>
			<td>4720.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double distilled H2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse TS 100 Hoffmann modulation contrast microscope&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Microscope to assess DIB membrane formation&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Roth</td>
			<td>8042.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMCCD camera iXon Ultra 897</td>
			<td>Andor</td>
			<td></td>
			<td>TIRF microscope&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>32205-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixed angle rotor Ti70</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-8, CalciFluorTM</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>SC-362561</td>
			<td>Ca2+-sensitive dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>French press cell disruption homogenizer</td>
			<td>Igneus</td>
			<td>Igneus 40000 psi</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP filter</td>
			<td>AHF</td>
			<td></td>
			<td>Filter seeting used for excitation of DIB-membranes by epifluorescence with white light source&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>4878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips 40 mm x 24 mm x 0.13 mm</td>
			<td>Roth</td>
			<td>1870.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3783.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe 10 mL</td>
			<td>Roth</td>
			<td>X033.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe 100 mL</td>
			<td>Roth</td>
			<td>X049.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe 500 mL</td>
			<td>Roth</td>
			<td>EY49.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating block&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Thermomixer comfort</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating plate</td>
			<td>Minitube&#160;</td>
			<td>HT200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Roth&#160;</td>
			<td>9205.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexadcane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>296317</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>His Trap HP 1 mL</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>29051021</td>
			<td>Ni-NTA column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1.04716.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>10314243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KLM spin coater&#160;</td>
			<td>Schaefer Tec</td>
			<td>SCV-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>List medical L/M-3P-A vertical pipette puller</td>
			<td>Artisan Technology Group</td>
			<td>57761-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low melting point agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>A9414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M8 Stereomicroscope</td>
			<td>Wild</td>
			<td></td>
			<td>Stereomicrosope&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab&#160;</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>R2022a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroFil pipette tips</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MF34G-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 gas</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3957.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoliter 2010 injector&#160;</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>Nanoliter 2010&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-dodecyl-b-D-maltoside</td>
			<td>Glycon Biochemicals</td>
			<td>D97002-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA agarose, non-crosslinked</td>
			<td>Cube Biotech</td>
			<td>124115393</td>
			<td>Custom made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements AR software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MQS31100/MQS42560/MQS42580/MQS42780/MQS41930</td>
			<td>Imaging software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-octyl-polyoxyethylene</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>40530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O2 gas</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethylsulfonyl fluoride</td>
			<td>Roth&#160;</td>
			<td>6367.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photodiode sensor&#160; Si, 400 - 1100 nm, 500 mW</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>S130C</td>
			<td>Sensor for laser power meter&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner</td>
			<td>Diener Electronics</td>
			<td>Zepto</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Preparative ultracentrifuge Optima</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quad-band TIRF-filter 446/523/600/677 HC</td>
			<td>AHF</td>
			<td></td>
			<td>Filter setting used for excitation of DIB-membranes with 488 nm laser&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resource Q 1 mL</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>17117701</td>
			<td>Anion exchange column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon oil AR 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Roth</td>
			<td>2326.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super LoLux camera</td>
			<td>JVC</td>
			<td></td>
			<td>Stereomicrosope&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermoshaker</td>
			<td>Gerhardt</td>
			<td>THL 500/1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ti-E Fluorescence microscope&#160;&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MEA53100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9090.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Roth</td>
			<td>8952.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic bath&#160;</td>
			<td>Bandelin Sonorex</td>
			<td>RK 100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaccum pump</td>
			<td>Vacuubrand</td>
			<td>MD 4C NT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White light source for epifluorescence illumination (100 W)</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MBF72655</td>
			<td>TIRF microscope&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Roth</td>
			<td>2363.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-molecule imaging of lateral mobility and ion channel activity in lipid bilayers using total internal reflection fluorescence (tirf) microscopy

טכניקות הדמיה ברזולוציה גבוהה הראו כי תעלות יונים רבות אינן סטטיות, אלא נתונות לתהליכים דינמיים ביותר, כולל שיוך חולף של תת-יחידות יוצרות נקבוביות ותת-יחידות עזר, דיפוזיה צידית והתקבצות עם חלבונים אחרים. עם זאת, הקשר בין דיפוזיה צידית לתפקוד אינו מובן היטב. כדי לגשת לבעיה זו, אנו מתארים כיצד ניתן לנטר ולהתאים ניידות ופעילות צידית של ערוצים בודדים בקרומי שומנים נתמכים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי של השתקפות פנימית כוללת (TIRF). הממברנות מיוצרות על מצע הידרוג'ל דק במיוחד בטכניקת DIB (ראשי תיבות של droplet interface bilayer). בהשוואה לסוגים אחרים של ממברנות מודל, לממברנות אלה יש את היתרון של היותן חזקות מבחינה מכנית ומתאימות לטכניקות אנליטיות רגישות במיוחד. פרוטוקול זה מודד שטף יונים Ca 2+ דרך תעלות בודדות על ידי צפייה בפלואורסצנטיות של צבע רגיש Ca2+ בסמיכות לממברנה. בניגוד לגישות מעקב קלאסיות של מולקולות בודדות, אין צורך בחלבוני היתוך פלואורסצנטיים או בתוויות, שיכולים להפריע לתנועה הרוחבית ולתפקוד בקרום. שינויים אפשריים בשטף היונים הקשורים לשינויים קונפורמטיביים של החלבון נובעים רק מתנועה צידית של החלבון בקרום. תוצאות מייצגות מוצגות באמצעות ערוץ טרנסלוקציה של חלבון מיטוכונדריאלי TOM-CC וערוץ החיידקים OmpF. בניגוד ל-OmpF, ה-gating של TOM-CC רגיש מאוד לכליאה מולקולרית ולאופי הדיפוזיה הצידית. לפיכך, דו-שכבות נתמכות של ממשק טיפות הן כלי רב עוצמה לאפיון הקשר בין דיפוזיה צידית לבין תפקוד תעלות יונים.

הקלטה אופטית חד-ערוצית אופטית נטולת אלקטרודות בזמן אמת חושפת את יחסי הגומלין בין תנועת חלבונים צידית לבין תפקודן של תעלות יונים בודדות בקרומי DIB. הרכבה מחדש של קומפלקס ליבת TOM מיטוכונדריאלי (איור 1A) לתוך קרום DIB (איור 4D) מדגימה מתאם זמני חזק בין ניידות צידית וחדירות יונים (איור 5A). נראה כי ה-TOM-CC רגיש למצב התנועה הצידית17. תעלות נעות מראות שטף Ca2+ דרך הנקבוביות שלהם ועוצמות נקודות פלואורסצנטיות גבוהות. מולקולות לכודות שאינן נעות מראות עוצמות פלואורסצנטיות נמוכות ובינוניות. עבור נקבובית יבוא החלבונים הכללית של המיטוכונדריה TOM-CC, גישה זו של מולקולה בודדת חשפה מתאם זמני חזק בין ניידות צידית וחדירות יונים, מה שמרמז על כך שלערוץ TOM-CC יש תכונות רגישות למכנו17. עצירה צידית של מולקולות TOM-CC הנעות בחופשיות מלווה בסגירה חלקית או מלאה של ערוץ TOM-CC. הדמיה של ממברנות DIB עם OmpF (איור 1E ואיור 4F), אשר מוטמעות כמעט במלואן בקרום, לא מראה השפעות עצירה וסע (איור 5B). עצירות אקראיות של OmpF אינן קשורות לשינוי בעוצמה, ולכן, עם סגירת הנקבוביות שלה. בהתבסס על אותות פלואורסצנטיים38, ניתן להעריך את דיוק המיקום של הערוצים הבודדים בטווח שבין 5 ל -10 ננומטר. עם זאת, יש לציין כי דיוק זה אינו יכול להיות מושג אם התעלות מתנודדות מעט עקב עיגון נייד עם הידרוג'ל אגרוז, כפי שמוצג, למשל, עבור מולקולות TOM-CC במצב ביניים עם תזוזה ממוצעת של שורש של 120 ננומטר (איור 5A).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64970/64970fig01.jpg"> איור 1: בידוד של TOM-CC. (A) מבנה Cryo EM של N. crassa TOM-CC30,39. מיטוכונדריה מזן N. crassa המכיל Tom22 עם תג 6xHis היו מסיסים ב-DDM ועברו כרומטוגרפיית זיקה Ni-NTA (B) וכרומטוגרפיית חילופי אניון (C). (D) SDS-PAGE של TOM-CC מבודד. (E) מבנה גבישי (PDB, 1OPF) ו-(F) SDS-PAGE של E. coli OmpF מטוהר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64970/64970fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64970/64970fig02.jpg"> איור 2: תרשים זרימה של הרכבת תא PMMA. שלב 1: כיסוי זכוכית מצופה בהידרוג'ל אגרוז. שלב 2: הכיסוי המצופה בספין מותקן בתא מיקרוסקופיית PMMA בהתאמה אישית. שלב 3: אגרוז נמס נמוך נוסף מתווסף ליציאת הכניסה של תא PMMA על פלטה חמה של 35 מעלות צלזיוס. שלב 4: חד-שכבות ליפידים נוצרות סביב טיפות מימיות בממשק חיץ/שמן (משמאל) ובממשק אגרוז הידרוג'ל/שמן (מימין). שלב 5: טיפות מימיות בודדות מוחדרות לבארות של תא PMMA כדי ליצור דו-שכבה ליפידית במגע של שתי החד-שכבות השומנים. שלב 6: היווצרות קרומי DIB מאומתת על ידי מיקרוסקופ ניגודיות אפנון הופמן. שלב 7: תמונות של אזורים נבחרים של ממברנות DIB עם תעלות יונים שהוחדרו נרכשות במיקרוסקופ TIRF. ירוק: 0.75% אגרוז; צהוב: 2.5% אגרוז המכיל יוני Ca2+ ; מגנטה: שלב השומנים/שמן; כחול כהה: חיץ טיפות מימי המכיל צבע וחלבון רגישים ל-Ca2+. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64970/64970fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64970/64970fig03.jpg"> איור 3: מערך ניסויי. (A) ייצוג סכמטי של קרום DIB בבאר PMMA. הדו-שכבה נשענת על סרט אגרוז דק במיוחד של 0.75% כדי לאפשר הדמיה של שטף Ca 2+ דרך תעלת יונים לאורך זמן באמצעות צבע פלואורסצנטי רגיש ל-Ca2+ (Fluo-8) בטרנס. (B) שטף Ca2+ נשלט באופן בלעדי על ידי הלחץ האוסמוטי מסיס לטרנס. זה מאפשר הן את קביעת המיקום בממברנה והן את המצב הפתוח-סגור של התעלה. התעלה המוצגת כאן היא הערוץ מוליך החלבונים TOM-CC של N. crassa mitochondria30. (C) מסלול של ערוץ TOM-CC יחיד. ירוק: ערוץ נע; צהוב: ערוץ שאינו זז. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64970/64970fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64970/64970fig04.jpg"> איור 4: הדמיה של TOM-CC ו-OmpF בקרומי DIB. (A) קרום DIB שצולם על ידי מיקרוסקופ ניגודיות אפנון הופמן המראה את אזור המגע הדו-שכבתי בין ההידרוג'ל לטיפה. (B) קרום DIB שבור בתמונה כמו ב-(A). חץ, קצה תא PMMA. (C) קרום DIB שצולם במיקרוסקופ TIRF ללא תעלות חלבון. (D) קרום DIB עם TOM-CC משוחזר, מצולם במיקרוסקופ TIRF. הריבועים הלבנים מסמנים כתמים בעוצמה גבוהה (SH), בינונית (SI) ונמוכה (SL). (E) התאמת פרופיל עוצמת הפלואורסצנטיות של שלושת הכתמים המסומנים ב-(A) לפונקציות גאוס דו-ממדיות חושפת את המיקום של TOM-CCs בודדים ושטף Ca2+ דרך התעלה. (F) קרום DIB עם OmpF משוחזר. (G) התאמה גאוסיאנית של הכתם הפלואורסצנטי המסומן ב-(F). בניגוד לקומפלקס החלבון הדו-נקבובי β-חבית TOM-CC, ה-OmpF בעל שלוש הנקבוביות β-חבית חושף מצב חדירות אחד בלבד. גודל פיקסל, 0.16 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64970/64970fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64970/64970fig05.jpg"> איור 5: פעילות הערוץ מתואמת עם ניידות צידית של TOM-CC. (A) עקבות המשרעת הפלואורסצנטית (למעלה) והמסלול המקביל (למטה) של TOM-CC מצביעים על כך שפעילות הערוץ הפתוח-סגור של TOM-CC מתואמת עם ניידות הממברנה הצידית של המתחם. המסלול מציג שלושה מצבי חדירות. ירוק: מצב פתוח לחלוטין; צהוב: מצב חדירות ביניים; אדום: מצב ערוץ סגור; כוכב אדום: TOM-CC במצב הביניים מתנדנד סביב מיקומו הממוצע בכ-±60 ננומטר. דיוקי המיקום37 המבוססים על אותות הפלואורסצנטיים במצבים הפתוחים והבינוניים המלאים נעים בין 5 ננומטר ל -10 ננומטר. (B) עקבות משרעת פלואורסצנטית (למעלה) ומסלול מקביל (למטה) של OmpF. OmpF חושף רמת עוצמה אחת בלבד, בין אם הוא בתנועה או לכוד. קטעי המסלול המתאימים לפרקי הזמן של מולקולות לכודות מסומנים באפור. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64970/64970fig05large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>מאגר </td>
			<td colspan="3">ריכוזי מגיבים</td>
			<td>נפח</td>
		</tr><tr><td>A1*</td>
			<td colspan="3">20 mM Tris-HCl pH 8.5, 0.1% (w/v) n-דודציל-β-D-מלטוזיד (DDM), 10% (v/v) גליצרול, 300 mM NaCl ו-1 mM פנילמתיל-סולפוניל פלואוריד (PMSF)</td>
			<td>100 מ"ל</td>
		</tr><tr><td>A2*</td>
			<td colspan="3">20 mM Tris-HCl pH 8.5, 0.1% (w/v) DDM, 10% (v/v) גליצרול, 1 M Imidazole ו 1 mM PMSF</td>
			<td>100 מ"ל</td>
		</tr><tr><td>ב1*</td>
			<td colspan="3">20 mM HEPES pH 7.2, 0.1% (עם v) DDM, 2% (v/v) dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>100 מ"ל</td>
		</tr><tr><td>B2*</td>
			<td colspan="3">20 mM HEPES pH 7.2, 0.1% (w/v) DDM, 1 M KCl, 2% (v/v) dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>100 מ"ל</td>
		</tr><tr><td colspan="5">* מסירים את הגז ועוברים דרך מסנן 0.22 מיקרומטר לפני השימוש.</td>
		</tr></tbody></table>טבלה 1: פתרונות חיץ לבידוד TOM-CC.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>מאגר </td>
			<td colspan="3">ריכוזי מגיבים</td>
			<td>נפח</td>
		</tr><tr><td>ליברות*</td>
			<td colspan="3">1% (w/v) טריפטון, 1% (w/v) NaCl ו-0.5% (w/v) תמצית שמרים</td>
			<td>1100 מ"ל</td>
		</tr><tr><td>ג1</td>
			<td colspan="3">2 mM MgCl2, ו~ 750 יחידות DNAse ו- 50 mM Tris-HCl pH 7.5</td>
			<td>20 מ"ל</td>
		</tr><tr><td>ג2</td>
			<td colspan="3">50 מ"מ Tris-HCl, pH 7.5</td>
			<td>50 מ"ל</td>
		</tr><tr><td>ג3</td>
			<td colspan="3">4% (w/v) נתרן דודציל סולפט (SDS), 2 mM β-מרקפטואתנול ו-50 mM Tris-HCl pH 7.5</td>
			<td>50 מ"ל</td>
		</tr><tr><td>ג4</td>
			<td colspan="3">2% (עם v) SDS, 500 mM NaCl ו- 50 mM Tris-HCl pH 7.5</td>
			<td>50 מ"ל</td>
		</tr><tr><td>ג5</td>
			<td colspan="3">0.5% (w/v) אוקטיל-פוליאתילן (octyl POE), 1 mM EDTA ו-20 mM Tris pH 8.5</td>
			<td>1000 מ"ל</td>
		</tr><tr><td colspan="5">* יש לעקר לפני השימוש.</td>
		</tr></tbody></table>טבלה 2: פתרונות חיץ לבידוד OmpF.

Watch this Scientific Journal Video about Single-Molecule Imaging of Lateral Mobility and Ion Channel Activity in Lipid Bilayers using Total Internal Reflection Fluorescence TIRF Microscopy Video at J

Single-Molecule Imaging of Lateral Mobility and Ion Channel Activity in Lipid Bilayers using Total Internal Reflection Fluorescence TIRF Microscopy Video (Video) | JoVE

פרוטוקול זה מתאר כיצד להשתמש במיקרוסקופ TIRF כדי לעקוב אחר תעלות יונים בודדות ולקבוע את פעילותן בקרומי שומנים נתמכים, ובכך להגדיר את יחסי הגומלין בין תנועת הממברנה הצידית לתפקוד הערוץ. הוא מתאר כיצד להכין את הממברנות, לרשום את הנתונים ולנתח את התוצאות.

הדמיה של מולקולה בודדת של תנועתיות צידית ופעילות תעלות יונים בשכבות שומנים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי של השתקפות פנימית כוללת (TIRF)

High-resolution imaging techniques have shown that many ion channels are not static, but subject to highly dynamic processes, including the transient ...

תעלות יונים אינן סטטיות בקרומים ביולוגיים. כאן אנו מציגים גישה אופטית של מולקולה בודדת לפענוח הקשר בין דיפוזיית הממברנה הצידית לבין תפקוד תעלת היונים. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות אחרות הוא שאין צורך בתיוג פלואורסצנטי של חלבונים העלולים להפריע לתנועתם הצידית ולתפקודם.השיטה יכולה להיות מיושמת על כל תעלת חלבון ממברנה שבה דיפוזיה חופשית או מוגבלת חשובה לארגון ולתפקוד. כדי להתחיל, להעביר 380 מיקרוליטר של תמיסת מלאי DPhPC לתוך בקבוקון זכוכית, ולכסות את תמיסת מלאי השומנים עם גז ארגון או חנקן כדי למנוע חמצון השומנים. השתמשו בזרימת הגז הנמוכה ביותר האפשרית כדי למנוע אידוי של הממס האורגני שבו מומסים השומנים, או התזת תרסיסי הממס מהבקבוקון.יבשו את דגימת השומנים תחת זרם של חנקן והסירו את הממס האורגני שנותר מדגימת השומנים תחת ואקום באמצעות משאבת ואקום נטולת שמן למשך הלילה. ממיסים את שכבת השומנים בתמיסת שמן סיליקון הקסדקני על ידי הוספת נפחים שווים של שמן הקסדקן וסיליקון באמצעות פיפטה של מיליליטר אחד לריכוז שומנים סופי של 9.5 מיליגרם למיליליטר. הכניסו חלק מכיסויי הזכוכית למחזיק כיסויי נירוסטה ונקו אותם בכוס זכוכית למשך כ-10 דקות עם אצטון בחומר ניקוי אולטרסוני.שטפו את הכיסויים במים כפולים שעברו דה-יוניזציה וייבשו אותם תחת זרם של חנקן. יתר על כן, לנקות hydrophylize כיסוי להחליק ב פלזמה שואב עם חמצן במשך חמש דקות. הרכיבו כיסוי שטופל בפלזמה על מעיל מסתובב וציפו את הכיסוי בסרט עבה תת-מיקרומטר של אגרוז על ידי הוספה איטית של 140 מיקרוליטר של אגרוז נמס נמוך 0.75% מחומם עם פיפטה של 200 מיקרוליטר ב -3, 000 סל"ד למשך 30 שניות.חברו מיד את הכיסוי המצופה בספין עם השכבה הדקה של הידרוג'ל האגרוז לחלק התחתון של תא PMMA. ודא כי הידרוג'ל agarose מצביע כלפי מעלה. קבע את קצוות הכיסוי למכשיר PMMA במיקרו-מכונה באמצעות סרט הדבקה שקוף, והנח את המכשיר על פלטה חמה המחוממת ל-35 מעלות צלזיוס.בזהירות לשפוך 200 מיקרוליטר של 2.5% תמיסת agarose לתוך הכניסה של החדר מבלי ליצור בועות אוויר. כסו מיד את הבארות של תא PMMA בכ -60 מיקרוליטר של תמיסת שמן השומנים כדי ליזום היווצרות חד-שכבתית שומנים בממשק שמן האגרוז כדי למנוע התייבשות של האגרוז המצופה ספין בבארות של תא PMMA. הניחו את המכשיר על פלטה חמה בחום של 35 מעלות למשך כשעתיים.הניחו כ-20 מיקרוליטר של תמיסת שמן סיליקון הקסדקן ליפידי בכל אחת מכמה בארות מיקרו-מפוברקות בתא דגירה טיפתי. הכינו מחט זכוכית מיקרוקפילרית בקוטר פתיחת קצה של כ-20 מיקרומטר באמצעות מושך מיקרופיפטה אנכי או אופקי. מלאו את המחט בכחמישה מיקרוליטרים של תמיסת הזרקה מימית המכילה HEPES 8.8 מילימולרי, שבעה מיקרומולרים של צבע פלואורסצנטי, Fluo-8, 400 מיקרומולרי EDTA, 1.32 אשלגן כלורי מולארי וקומפלקס ליבת TOM 30 ננו-מולרית או לחילופין 20 ננו-מולארי OMPF.הרכיבו את המחט עם תמיסת ההזרקה המימית על ננו-מזרק מונע פיאזו והזריקו 100 עד 200 ננוליטר של טיפות מימיות לתוך הבארות בתא הדגירה של הטיפות המלא בתמיסת שמן סיליקון הקסדקני שומנים באמצעות ננו-מזרק. אפשר היווצרות חד-שכבה ליפידית בממשק שמן הטיפות למשך כשעתיים על ידי שמירה על תאי הדגירה PMMA וטיפות על פלטה חמה מחוממת ל-35 מעלות צלזיוס. העבר ידנית טיפות מימיות בודדות מהבארות של תא הדגירה של הטיפות לתוך הבארות של תא PMMA באמצעות פיפטה מיקרוליטר חד-ערוצית עם קצה פוליפרופילן חד פעמי של 10 מיקרוליטר.אפשרו לטיפות לשקוע על החד-שכבות השומניות בממשקי שמן ההידרוג'ל וליצור דו-שכבה ליפידית בין הטיפות לבין האגרוז הידרוג'ל. הרכיבו את תא ה-PMMA עם הממברנות הדו-שכבתיות של ממשק הטיפות או DIB על מחזיק הדגימה של מיקרוסקופ אור הפוך, והעריכו את היווצרות הממברנה באמצעות יעד ניגודיות אפנון הופמן 10x. אם נוצרו ממברנות DIB, הרכיבו את תא ה-PMMA על מחזיק הדגימה של מיקרוסקופ TIRF המצויד במקור אור קונבנציונלי להארה אפיפלואורסצנטית, לייזר 488 ננומטר ומצלמת CCD עם תאורה אחורית המכפילה אלקטרונים כדי להשיג גודל פיקסל של כ-0.16 מיקרומטר.מקד את הקצה של קרום DIB עם יעד הגדלה של פי 10 תחת תאורה אפיפלואורסצנטית עם מקור אור בעוצמה גבוהה באמצעות ערכת מסנן GFP. מיקוד עדין באותו קצה של קרום DIB בהגדלה גבוהה עם 100x NA 1.49 שמן אפוכרומטי TIRF מטרה, שוב תחת תאורה אפיפלואורסצנטית עם מקור אור בעוצמה גבוהה באמצעות סט מסנן GFP. שנה את הגדרת המסנן מ- GFP לערכת המסננים TIRF בעלת ארבעת תחומי הפסים, הפעל את הלייזר בגודל 488 ננומטר והגדר את עוצמת הלייזר על עדשת המטרה.כדי להמחיש ערוצי יונים בודדים, כוונן את זווית ה-TIRF ואת הרווח של מצלמת EM CCD כך שתעלות היונים הפתוחות בקרום DIB יופיעו ככתמים פלואורסצנטיים בעלי ניגודיות גבוהה על רקע כהה, ויחס האות לרקע יגיע למקסימום. יש לוודא שהכתמים המתאימים לשטף יוני הסידן דרך תעלות יונים בודדות נשארים בפוקוס ובעלי צורה עגולה בעוצמה גבוהה במרכז ויורדת בהדרגה לכיוון הפריפריה. בדקו שהכתמים הפלואורסצנטיים נמצאים בפוקוס כדי לוודא שתעלות היונים נוצרו מחדש בקרומי DIB והן נעות לרוחב במישור הממברנה.לבסוף, להקליט סדרה של תמונות ממברנה המאפשר מעקב נאות של המיקום וניטור של המצב הפתוח-סגור של תעלות יונים בודדות. כדי לקבוע את סוג הניידות הרוחבית ואת מצב פעילות הערוץ, לרכוש מסלולים ארוכים מספיק מדגם היטב. מבנה Cryo EM של Neurospora crassa TOM-CC מוצג כאן.מיטוכונדריה מכתם N.crassa המכיל TOM 22 עם תג 6-His היו מסיסים ב-DDM ונחשפו לכרומטוגרפיית זיקה של ניקל NTA וכרומטוגרפיית החלפת אניון. SDS-PAGE של מבנה גבישי TOM-CC מבודד ו-SDS-PAGE של E.coli OMPF מטוהר המשמש להשוואה מוצגים כאן. עקבות המשרעת הפלואורסצנטית במסלול המתאים של TOM-CC מצביעות על כך שפעילות הערוץ הפתוח-סגור של TOM-CC מתואמת עם ניידות הממברנה הצידית של המתחם.מעקב המשרעת מציג שלושה מצבי חדירות: מצב פתוח לחלוטין המתאים לערוצים נעים, מצב חדירות ביניים ומצב ערוץ סגור המתאים לערוצים שאינם נעים. TOM-CC במצב הביניים מתנדנד סביב מיקומו הממוצע בכפלוס/מינוס 60 ננומטר. עקבות המשרעת הפלואורסצנטית במסלול המתאים של OMPF מוצגות כאן.OMPF חושף רק רמת עוצמה אחת בהשוואה ל- TOM-CC, ללא קשר אם הוא בתנועה או לכוד. קטעי המסלול המתאימים לפרקי הזמן של מולקולות לכודות מסומנים באפור. דבר אחד חשוב לשים לב אליו הוא ששיטה זו מנתחת חלבוני ממברנה בודדים בסביבת ממברנה שלמה.הדינמיקה של חלבוני הממברנה תישאר אופק למחקרים מדעיים בעתיד הנראה לעין. אנו מצפים שהשיטה שלנו תתרום לתחום זה באופן משמעותי.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Single-Molecule Imaging of Lateral Mobility and Ion Channel Activity in Lipid Bilayers using Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopy

Detergent-free Ultrafast Reconstitution of Membrane Proteins into Lipid Bilayers Using Fusogenic Complementary-charged Proteoliposomes.

Detergent-free Ultrafast Reconstitution of Membrane Proteins into Lipid Bilayers Using Fusogenic Complementary-charged Proteoliposomes. Video (Video) | JoVE

ללא דטרגנט מרביים להתחדשות ומבנה של קרום חלבונים לתוך השומנים Bilayers באמצעות Fusogenic משלימים טעונה Proteoliposomes.

Detergents are indispensable for delivery of membrane proteins into 30-100 nm small unilamellar vesicles, while more complex, larger model lipid bilayers ...

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers Video (Video) | JoVE

במבחנה בנייתו מחדש של דפוסי חלבון ב- Bilayers הנתמכים השומנים ארגון-עצמי

Many aspects of the fundamental spatiotemporal organization of cells are governed by reaction-diffusion type systems. In vitro reconstitution of such ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator Video (Video) | JoVE

Microgravimetry dissipative ללמוד את הדינמיקה איגוד של פוספוליפיד איגוד חלבון Annexin A2 כדי Bilayers השומנים הנתמכות על-ידי מוצק באמצעות מהוד קוורץ

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy

Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy Video (Video) | JoVE

הביטוי ולטיהור TRPC3 האדם רגיש השומנים הקטיון ערוץ לקביעת מבניים על-ידי הקפאה יחיד-חלקיקים-מיקרוסקופ

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium ...

Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules

Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules Video (Video) | JoVE

מיקרוסקופ מעקב חד-מולקולה-כלי לקביעת המדינות התפוצבניות של מולקולות ציטוסולג

Single-molecule localization microscopy probes the position and motions of individual molecules in living cells with tens of nanometer spatial and ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation Video (Video) | JoVE

ייצור Dynein וקינסין הרכבים מוטוריים ב-DNA אוריגמי ננו מבנים עבור תצפית מולקולה אחת

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

High-Throughput Total Internal Reflection Fluorescence and Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy Using a Photonic Chip

High-Throughput Total Internal Reflection Fluorescence and Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy Using a Photonic Chip Video (Video) | JoVE

כולל תפוקה גבוהה של השתקפות פנימית ומיקרוסקופ שחזור אופטי סטוכסטי אופטיים באמצעות שבב פוטוני

Total internal reflection fluorescence (TIRF) is commonly used in single molecule localization based super-resolution microscopy as it gives enhanced ...

Conventional BODIPY Conjugates for Live-Cell Super-Resolution Microscopy and Single-Molecule Tracking

Conventional BODIPY Conjugates for Live-Cell Super-Resolution Microscopy and Single-Molecule Tracking Video (Video) | JoVE

קונבנציונלי BODIPY מעלה שערים עבור מיקרוסקופ ברזולוציה גבוהה ומעקב יחיד מולקולה

Single molecule localization microscopy (SMLM) techniques overcome the optical diffraction limit of conventional fluorescence microscopy and can resolve ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH Video (Video) | JoVE

ניתוח תא יחיד של אללים פעילים בתעתיק על ידי מולקולה אחת FISH

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

Single Molecule Fluorescence Energy Transfer Study of Ribosome Protein Synthesis

Single Molecule Fluorescence Energy Transfer Study of Ribosome Protein Synthesis Video (Video) | JoVE

מולקולה בודדת פלואורסצנטית העברת אנרגיה מחקר של סינתזת חלבון ריבוזום

The ribosome is a large ribonucleoprotein complex that assembles proteins processively along mRNA templates. The diameter of the ribosome is approximately ...