Name: single-molecule imaging of lateral mobility and ion channel activity in lipid bilayers using total internal reflection fluorescence (tirf) microscopy
Uploaded: 2023-02-17T14:40:00
Duration: 8 min 55 s
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हम प्रोटीन तैयार करने में मदद के लिए बीट नित्शके और व्यावहारिक चर्चाओं के लिए रॉबिन घोष, माइकल श्विकर्ट (स्टटगार्ट), और मैक्सिमिलन उलब्रिच (फ्रीबर्ग) को धन्यवाद देते हैं। इस काम को स्टटगार्ट रिसर्च सेंटर सिस्टम बायोलॉजी (एसआरसीएसबी) और बाडेन वुर्टेमबर्ग फाउंडेशन (बायोएफएमओ -6 से एसएन) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।

हम हितों के टकराव की घोषणा नहीं करते हैं।

यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल एकल-अणु टीआईआरएफ माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके पार्श्व आयन चैनल आंदोलन और चैनल फ़ंक्शन के बीच परस्पर क्रिया का अध्ययन करने के लिए डीआईबी झिल्ली के उपयोग का परिचय प्रदान करता है। सर्वोत्तम संभव डेटा प्राप्त करने के लिए, अलग-अलग कणों की समय श्रृंखला प्राप्त करने के लिए यथासंभव कई अच्छी तरह से अलग चैनलों के साथ स्थिर डीआईबी झिल्ली की तैयारी महत्वपूर्ण है, जिसका संतोषजनक विश्लेषण किया जा सकता है।
अनुकूलित किए जाने वाले महत्वपूर्ण मापदंडों में लिपिड की पसंद, तेल चरण में लिपिड एकाग्रता और जलीय बूंदों में प्रोटीन और डिटर्जेंट सांद्रता शामिल हैं। नियोजित लिपिड असामान्य हैं, जिसमें वे कम तापमान पर कोई स्पष्ट चरण संक्रमण नहीं दिखाते हैं। डीपीएचपीसी स्थिर झिल्ली प्रणाली40 का उत्पादन करने के लिए आमतौर पर इस्तेमाल किया जाने वाला लिपिड है। सिद्धांत रूप में, कोई भी लिपिड जो कम तापमान पर अपने द्रव वातावरण को बनाए रखता है, इस आवेदन के लिए उपयुक्त हो सकता है। इसके अलावा, लिपिड ऑक्सीकरण के प्रति संवेदनशील नहीं होना चाहिए। झिल्ली टूटने से बचने के लिए बूंदों में डिटर्जेंट एकाग्रता जितना संभव हो उतना कम होना चाहिए। स्थिर झिल्ली और अच्छी प्रोटीन निगमन दर आम तौर पर महत्वपूर्ण मिसेल एकाग्रता (सीएमसी) से नीचे डिटर्जेंट सांद्रता के साथ प्राप्त की जाती है, यह देखते हुए कि झिल्ली प्रोटीन अवक्षेपित नहीं होता है।
यदि डीआईबी झिल्ली विशिष्ट डिटर्जेंट21,41 को सहन नहीं करती है, या यदि प्रोटीन डीआईबी झिल्ली में कम डिटर्जेंट समाधान से एकीकृत नहीं होते हैं, तो प्रोटीन चैनलों को पहले छोटे यूनिलैमेलर लिपिड पुटिकाओं (एसयूवी) में पुनर्गठित किया जा सकता है, जो बाद में बूंद पक्ष से डीआईबी झिल्ली से जुड़े होते हैं, जैसा कि ई कोलाई एमएससीएल42 के लिए सफलतापूर्वक दिखाया गया है। . कभी-कभी, डीआईबी झिल्ली नहीं बनती है क्योंकि तेल चरण में लिपिड एकाग्रता बहुत कम होती है। डीआईबी झिल्ली को फटने से रोकने के लिए, किसी को यह भी पता होना चाहिए कि हाइड्रोगेल और बूंद के बीच आसमाटिक दबाव को सीआईएस से ट्रांस तक सीए2 + -फ्लक्स को प्रभावित किए बिना ठीक से संतुलित किया जाना चाहिए। झिल्ली प्रोटीन के प्रसार का निरीक्षण करने के लिए अनुकूलित अगारोस मोटाई और जाल का आकार महत्वपूर्ण प्रतीत होता है। अगारोस परत के किसी भी सूखने से बचा जाना चाहिए। मोटाई परमाणु बल माइक्रोस्कोपी17 का उपयोग करके निर्धारित की जा सकती है। स्पिन कोटिंग के दौरान अगारोस एकाग्रता, मात्रा और रोटेशन गति को बदलकर, हाइड्रोगेल के जाल आकार और मोटाई को अनुकूलित किया जा सकता है। ध्यान दें, हालांकि, हाइड्रोगेल परत की मोटाई छवि कंट्रास्ट को प्रभावित करती है। डीआईबी में झिल्ली प्रोटीन को पकड़ने के लिए, अगारोस हाइड्रोगेल को कस्टम-संश्लेषित, गैर-क्रॉसलिंक्ड, नी-एनटीए-संशोधित, कम पिघलने वाले अगारोस द्वारा प्रतिस्थापित किया जा सकता है ताकि उन्हें हिस-टैग17 के माध्यम से फंसाया जा सके। अत्यधिक उच्च प्रतिदीप्ति पृष्ठभूमि अक्सर डीआईबी झिल्ली के टूटने के कारण होती है। यह विशेष रूप से बहु-कुएं कक्षों के साथ एक समस्या है, क्योंकि सीए2 + संवेदनशील डाई हाइड्रोगेल में फैलती है। इस मामले में, आसन्न कुओं से बचना चाहिए। झिल्ली के ऊपर सीए2 + संवेदनशील डाई की प्रतिदीप्ति विरंजन एक महत्वपूर्ण सीमित कारक नहीं होना चाहिए, क्योंकि यह टीआईआरएफ एवेनेसेंट क्षेत्र के बाहर बूंद (चित्रा 3 ए) के थोक में उत्तेजित रंगों द्वारा आदान-प्रदान किया जाता है। प्रोटीन के लिए स्थानीयकरण परिशुद्धता धब्बे और पिक्सेल आकार को फिट करने की सटीकता द्वारा दी जाती है।
कमजोर प्रतिदीप्ति संकेत चैनल के माध्यम से कम सीए2 + -फ्लक्स के कारण हो सकते हैं। संभावित कारणों में शामिल हैं: (i) गलत टीआईआरएफ सेटिंग्स (जैसे, लेजर तीव्रता), (ii) झिल्ली के पार आसमाटिक सीए2 + दबाव, या (iii) चैनलों की आंतरिक सीए2 + -पारगम्यता बहुत कम है। पहले मुद्दे से निपटने के लिए, लेजर तीव्रता, टीआईआरएफ कोण और कैमरा लाभ को अनुकूलित करने की आवश्यकता है। बाद के दो मुद्दों को झिल्ली 2,43 में एक विद्युत क्षमता के आवेदन से दूर किया जा सकता है। हालांकि, बाहरी वोल्टेज का अनुप्रयोग परिणाम को विकृत कर सकता है, क्योंकि विद्युत प्रभाव लिगैंड-गेटेड या मेकेनोसेंसिटिव आयन चैनलों के चैनल खोलने को प्रभावित कर सकते हैं जो वास्तव में वोल्टेज-नियंत्रित नहीं हैं। ऐसे चैनलों के उदाहरण माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन ट्रांसलोकेस टीओएम-सीसी27, और इसके चैनल बनाने वाले सबयूनिट टॉम 40 26,44,45,46 हैं। अंत में, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि, वांछित कार्यक्षमता प्राप्त करने के लिए एक विशिष्ट अभिविन्यास में डीआईबी झिल्ली में झिल्ली प्रोटीन डालना मुश्किल है, और मात्रात्मक अध्ययन दुर्लभ47,48 हैं। कुछ मामलों में, एकीकृत प्रोटीन का अभिविन्यास यादृच्छिक है। यह झिल्ली प्रोटीन का अध्ययन करने के लिए एक गंभीर समस्या है, क्योंकि कुछ झिल्ली प्रोटीन झिल्ली के केवल एक तरफ सक्रिय होते हैं।
टीआईआरएफ माइक्रोस्कोपी प्लानर समर्थित झिल्ली49 में एकल-अणु घटनाओं को संबोधित करने के लिए एक शक्तिशाली विधि है। उदाहरणों में चैनल प्रोटीन जैसे α-हेमोलिसिन50, परफ्रिंगोलिसिन ओ51 और ओएमपीजी52 के संयोजन और फोल्डिंग मार्ग स्पष्टीकरण शामिल हैं। इन अध्ययनों में एक अतिरिक्त तकनीक के रूप में फ्रेट शामिल था। इसके अलावा, मेकेनोसेंसिटिव आयन चैनल एमएससीएल के सक्रियण का अध्ययन पहले वर्तमान माप का उपयोग करके समर्थित डीआईबी बाइलेयर42 की यांत्रिक उत्तेजना द्वारा किया गया है। इस काम के आधार पर, भविष्य के अध्ययन यहां वर्णित मंच को एकल-अणु फ्रेट प्रयोगों के साथ जोड़ सकते हैं ताकि ऑप्टिकल तरीके से एकल-अणु स्तर पर मेकेनोसेंसिटिव चैनलों को संबोधितकिया जा सके। बूंद में बफर का इंजेक्शन, आंतरिक डीआईबी मोनोलेयर को खींचना, या अंतर्निहित हाइड्रोगेल के लिए व्यक्तिगत चैनलों के लक्षित बंधन का उपयोग न केवल यांत्रिक रूप से सक्रिय चैनलों के भौतिक तंत्र का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है, जो झिल्ली तनाव और / या वक्रता का जवाब देते हैं जैसा कि एमएससीएल और एमएससीएस, दो-छिद्र डोमेन के + -चैनल, ट्रेक -1, ट्रेक -2, और टीआरएएके, और पीईज़ो (समीक्षा के लिए,53 देखें), लेकिन सेलुलर साइटोस्केलेटन के लिए स्थानीय बंधन भी, जैसा कि स्पर्श-संवेदनशील आयन चैनल एनओएमपीसी54,55 के लिए दिखाया गया है।

वर्तमान प्रोटोकॉल का उद्देश्य यह वर्णन करना है कि बहुलक-समर्थित बूंद-इंटरफ़ेस बाइलेयर (डीआईबी) झिल्ली 1,2,3 में झिल्ली प्रोटीन की झिल्ली गतिशीलता और आयन चैनल पारगम्यता के बीच सहसंबंध का अध्ययन कैसे किया जाए।
वर्तमान तकनीक उन्नत ऑप्टिकल और सतह विश्लेषणात्मक उपकरणों की एक प्रभावशाली सरणी का पूरक है, जैसे कि एकल कण ट्रैकिंग 4,5, प्रतिदीप्ति सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी 6,7, और उच्च गति परमाणु बल माइक्रोस्कोपी 8,9,10। ये झिल्ली की गतिशील संरचना और संरचना में मूल्यवान अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं जो झिल्ली-आधारित प्रतिक्रियाओं को प्रभावित करते हैं 11,12,13. जबकि प्रोटीन की गति और पार्श्व प्रसार झिल्ली में प्रोटीन के स्थानीय घनत्व पर निर्भर करता है, व्यक्तिगत प्रोटीन अणुओं को लिपिड राफ्ट14 और प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन15,16 में भी फंसाया जा सकता है। झिल्ली से बाह्य वातावरण या साइटोसोल में फैले प्रोटीन डोमेन के आधार पर, प्रोटीन गतिशीलता अत्यधिक मोबाइल से पूरी तरह से गतिहीन तक भिन्न हो सकती है। हालांकि, झिल्ली और इसकी परिधीय संरचनाओं की जटिलता के कारण, पार्श्व गतिशीलता और प्रोटीन फ़ंक्शन17 की प्रकृति के बीच परस्पर क्रिया को समझना अक्सर मुश्किल होता है।
डीआईबी झिल्ली झिल्ली प्रोटीन18,19,20,21,22 के बायोफिज़िकल एकल-अणु विश्लेषण के लिए एक कुशल मंच साबित हुआ है। तेल चरण में हाइड्रोगेल-समर्थित सब्सट्रेट्स के साथ जलीय बूंदों के संपर्क के माध्यम से लिपिड स्व-असेंबली द्वारा बनाए जाते हैं। आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले समर्थित लिपिड बाइलेयर (एसएलबी) 1,23,24,25 के समान, डीआईबी उपयुक्त लिगेंड 17 के साथ कार्यात्मक होने पर बहुलक मैट्रिक्स में प्रोटीन के अस्थायी या स्थायी बंधन द्वारा पार्श्व गतिशीलता की स्थानीय ट्यूनिंग की अनुमति देता है। उत्तरार्द्ध एक विषम प्रोटीन वितरण 10 के साथ कोशिका झिल्ली में जैव रासायनिक प्रक्रियाओं के लिए एक मॉडल प्रणाली के रूप में काम करसकता है।
यहां वर्णित प्रयोगात्मक दृष्टिकोण टीआईआरएफ माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके झिल्ली2,22 के निकट निकटता में अलग-अलग चैनलों के माध्यम से सीए2 + आयन प्रवाह को मापने के लिए सीए2 + संवेदनशील रंगों की प्रतिदीप्ति पर निर्भर करता है। यह ऑप्टिकल दृष्टिकोण नमूने की रोशनी को झिल्ली के करीब एक दूरी तक सीमित करता है, जो कि एवेनेसेंट उत्तेजना प्रकाश के भौतिक गुणों के कारण, प्रतिदीप्ति पृष्ठभूमि की महत्वपूर्ण कमी की ओर जाता है। उत्तरार्द्ध एक शर्त है यदि एकल अणुओं का पता लगाने के लिए उच्च स्थानिक और लौकिक संकल्प की आवश्यकता होती है। शास्त्रीय इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल विधियों26,27 के विपरीत, व्यक्तिगत चैनलों के माध्यम से आयन प्रवाह का अध्ययन करने के लिए कोई झिल्ली वोल्टेज की आवश्यकता नहीं होती है। इसके अलावा, विधि को फ्लोरोसेंट रंजक या अणुओं के साथ लेबलिंग की आवश्यकता नहीं होती है जो झिल्ली में चैनलों के पार्श्व आंदोलन में हस्तक्षेप कर सकते हैं।
शास्त्रीय इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी का उपयोग किए बिना एकल अणु स्तर पर झिल्ली में एम्बेडेड प्रोटीन चैनलों का अध्ययन करने के लिए विधि विशेष रूप से उपयोगी है। न्यूरोस्पोरा क्रैसा28,29,30 और ओएमपीएफ से माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन-संचालन चैनल टीओएम-सीसी का उपयोग करते हुए, जो एस्चेरिचिया कोलाई17,31 की बाहरी झिल्ली में छोटे हाइड्रोफिलिक अणुओं के प्रसार का समर्थन करता है, हम बताते हैं कि दो प्रोटीनों की झिल्ली मोबिलिटी और चैनल गतिविधियों का अध्ययन और सहसंबद्ध कैसे किया जा सकता है। हम सुझाव देते हैं कि यह दृष्टिकोण, हालांकि टीओएम-सीसी और ओएमपीएफ के लिए अनुकूलित है, अन्य प्रोटीन चैनलों पर आसानी से लागू किया जा सकता है।

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	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850356C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x Oil objective Apochromat N.A. 1.49</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRD01991</td>
			<td>TIRF microscope&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Hoffmann modulation contrast objective NA 0.25&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Microscope to assess DIB membrane formation&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x objective N.A. 0.25</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRL00102</td>
			<td>TIRF microscope&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40x Hoffmann modulation contrast objective NA 0.55</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Microscope to assess DIB membrane formation&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>488 nm laser, 100 mW&#160;&#160;</td>
			<td>Visitron</td>
			<td></td>
			<td>TIRF microscope&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive tape</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#196;kta pure&#160;&#160;</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td></td>
			<td>Protein purification system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford assay kit, Pierce</td>
			<td>Thermo Fisher&#160;</td>
			<td>23236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Roth</td>
			<td>5239.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chelax 100 resin</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>143-2832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>MC1024452500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis cassettes Slide-A-Lyzer 20 k MWCO</td>
			<td>Thermo Fisher&#160;</td>
			<td>87735</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DIB chamber&#160;</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
			<td>PMMA chamber for DIB membranes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital power meter and energy console</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PM100D</td>
			<td>Laser power meter&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Roth&#160;</td>
			<td>4720.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double distilled H2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse TS 100 Hoffmann modulation contrast microscope&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Microscope to assess DIB membrane formation&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Roth</td>
			<td>8042.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMCCD camera iXon Ultra 897</td>
			<td>Andor</td>
			<td></td>
			<td>TIRF microscope&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>32205-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixed angle rotor Ti70</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-8, CalciFluorTM</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>SC-362561</td>
			<td>Ca2+-sensitive dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>French press cell disruption homogenizer</td>
			<td>Igneus</td>
			<td>Igneus 40000 psi</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP filter</td>
			<td>AHF</td>
			<td></td>
			<td>Filter seeting used for excitation of DIB-membranes by epifluorescence with white light source&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>4878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips 40 mm x 24 mm x 0.13 mm</td>
			<td>Roth</td>
			<td>1870.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3783.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe 10 mL</td>
			<td>Roth</td>
			<td>X033.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe 100 mL</td>
			<td>Roth</td>
			<td>X049.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe 500 mL</td>
			<td>Roth</td>
			<td>EY49.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating block&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Thermomixer comfort</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating plate</td>
			<td>Minitube&#160;</td>
			<td>HT200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Roth&#160;</td>
			<td>9205.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexadcane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>296317</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>His Trap HP 1 mL</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>29051021</td>
			<td>Ni-NTA column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1.04716.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>10314243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KLM spin coater&#160;</td>
			<td>Schaefer Tec</td>
			<td>SCV-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>List medical L/M-3P-A vertical pipette puller</td>
			<td>Artisan Technology Group</td>
			<td>57761-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low melting point agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>A9414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M8 Stereomicroscope</td>
			<td>Wild</td>
			<td></td>
			<td>Stereomicrosope&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab&#160;</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>R2022a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroFil pipette tips</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MF34G-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 gas</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3957.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoliter 2010 injector&#160;</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>Nanoliter 2010&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-dodecyl-b-D-maltoside</td>
			<td>Glycon Biochemicals</td>
			<td>D97002-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA agarose, non-crosslinked</td>
			<td>Cube Biotech</td>
			<td>124115393</td>
			<td>Custom made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements AR software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MQS31100/MQS42560/MQS42580/MQS42780/MQS41930</td>
			<td>Imaging software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-octyl-polyoxyethylene</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>40530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O2 gas</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethylsulfonyl fluoride</td>
			<td>Roth&#160;</td>
			<td>6367.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photodiode sensor&#160; Si, 400 - 1100 nm, 500 mW</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>S130C</td>
			<td>Sensor for laser power meter&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner</td>
			<td>Diener Electronics</td>
			<td>Zepto</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Preparative ultracentrifuge Optima</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quad-band TIRF-filter 446/523/600/677 HC</td>
			<td>AHF</td>
			<td></td>
			<td>Filter setting used for excitation of DIB-membranes with 488 nm laser&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resource Q 1 mL</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>17117701</td>
			<td>Anion exchange column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon oil AR 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Roth</td>
			<td>2326.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super LoLux camera</td>
			<td>JVC</td>
			<td></td>
			<td>Stereomicrosope&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermoshaker</td>
			<td>Gerhardt</td>
			<td>THL 500/1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ti-E Fluorescence microscope&#160;&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MEA53100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9090.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Roth</td>
			<td>8952.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic bath&#160;</td>
			<td>Bandelin Sonorex</td>
			<td>RK 100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaccum pump</td>
			<td>Vacuubrand</td>
			<td>MD 4C NT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White light source for epifluorescence illumination (100 W)</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MBF72655</td>
			<td>TIRF microscope&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Roth</td>
			<td>2363.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-molecule imaging of lateral mobility and ion channel activity in lipid bilayers using total internal reflection fluorescence (tirf) microscopy

उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग तकनीकों से पता चला है कि कई आयन चैनल स्थिर नहीं हैं, लेकिन अत्यधिक गतिशील प्रक्रियाओं के अधीन हैं, जिसमें छिद्र बनाने और सहायक सबयूनिट्स, पार्श्व प्रसार और अन्य प्रोटीनों के साथ क्लस्टरिंग का क्षणिक संबंध शामिल है। हालांकि, पार्श्व प्रसार और कार्य के बीच संबंध खराब समझा जाता है। इस समस्या से निपटने के लिए, हम वर्णन करते हैं कि कैसे समर्थित लिपिड झिल्ली में व्यक्तिगत चैनलों की पार्श्व गतिशीलता और गतिविधि की निगरानी की जा सकती है और कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति (टीआईआरएफ) माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके सहसंबद्ध किया जा सकता है। बूंद इंटरफ़ेस बाइलेयर (डीआईबी) तकनीक का उपयोग करके अल्ट्राथिन हाइड्रोगेल सब्सट्रेट पर झिल्ली बनाई जाती है। अन्य प्रकार के मॉडल झिल्ली की तुलना में, इन झिल्लियों में यांत्रिक रूप से मजबूत और अत्यधिक संवेदनशील विश्लेषणात्मक तकनीकों के लिए उपयुक्त होने का लाभ है। यह प्रोटोकॉल झिल्ली के करीब निकटता में सीए2 + संवेदनशील डाई के प्रतिदीप्ति उत्सर्जन को देखकर एकल चैनलों के माध्यम से सीए2 + आयन प्रवाह को मापता है। शास्त्रीय एकल-अणु ट्रैकिंग दृष्टिकोण के विपरीत, कोई फ्लोरोसेंट संलयन प्रोटीन या लेबल, जो झिल्ली में पार्श्व आंदोलन और कार्य में हस्तक्षेप कर सकता है, की आवश्यकता नहीं होती है। प्रोटीन के संवहन परिवर्तनों से जुड़े आयन प्रवाह में संभावित परिवर्तन केवल झिल्ली में प्रोटीन पार्श्व गति के कारण होते हैं। प्रतिनिधि परिणाम माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन ट्रांसलोकेशन चैनल टीओएम-सीसी और बैक्टीरियल चैनल ओएमपीएफ का उपयोग करके दिखाए जाते हैं। ओएमपीएफ के विपरीत, टीओएम-सीसी की गेटिंग आणविक कारावास और पार्श्व प्रसार की प्रकृति के प्रति बहुत संवेदनशील है। इसलिए, समर्थित ड्रॉपलेट-इंटरफ़ेस बाइलेयर पार्श्व प्रसार और आयन चैनलों के कार्य के बीच की कड़ी को चिह्नित करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण हैं।

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Single-Molecule Imaging of Lateral Mobility and Ion Channel Activity in Lipid Bilayers using Total Internal Reflection Fluorescence TIRF Microscopy Video (Video) | JoVE

यह प्रोटोकॉल बताता है कि व्यक्तिगत आयन चैनलों को ट्रैक करने और समर्थित लिपिड झिल्ली में उनकी गतिविधि निर्धारित करने के लिए टीआईआरएफ माइक्रोस्कोपी का उपयोग कैसे करें, जिससे पार्श्व झिल्ली आंदोलन और चैनल फ़ंक्शन के बीच परस्पर क्रिया को परिभाषित किया जा सके। यह वर्णन करता है कि झिल्ली कैसे तैयार करें, डेटा रिकॉर्ड करें और परिणामों का विश्लेषण करें।

कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति (टीआईआरएफ) माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके लिपिड बाइलेयर में पार्श्व गतिशीलता और आयन चैनल गतिविधि की एकल-अणु इमेजिंग

High-resolution imaging techniques have shown that many ion channels are not static, but subject to highly dynamic processes, including the transient ...

आयन चैनल जैविक झिल्ली में स्थिर नहीं हैं। यहां हम पार्श्व झिल्ली प्रसार और आयन चैनल फ़ंक्शन के बीच की कड़ी को उजागर करने के लिए एक एकल अणु ऑप्टिकल दृष्टिकोण प्रस्तुत करते हैं। अन्य तरीकों पर इस तकनीक का मुख्य लाभ यह है कि प्रोटीन की फ्लोरोसेंट लेबलिंग जो उनके पार्श्व आंदोलन और कार्य में हस्तक्षेप कर सकती है, की आवश्यकता नहीं है।विधि को किसी भी झिल्ली प्रोटीन चैनल पर लागू किया जा सकता है जहां संगठन और कार्य के लिए मुक्त या प्रतिबंधित प्रसार महत्वपूर्ण है। शुरू करने के लिए, डीपीएचपीसी स्टॉक समाधान के 380 माइक्रोलीटर को कांच की शीशी में स्थानांतरित करें, और लिपिड ऑक्सीकरण को रोकने के लिए आर्गन या नाइट्रोजन गैस के साथ लिपिड स्टॉक समाधान को ओवरले करें। कार्बनिक विलायक के वाष्पीकरण से बचने के लिए सबसे कम संभव गैस प्रवाह का उपयोग करें जिसमें लिपिड घुल जाते हैं, या शीशी से विलायक स्प्रे के छींटे पड़ते हैं।लिपिड नमूने को नाइट्रोजन की एक धारा के तहत सुखाएं और रात भर तेल मुक्त वैक्यूम पंप का उपयोग करके वैक्यूम के तहत लिपिड नमूने से शेष कार्बनिक विलायक को हटा दें। 9.5 मिलीग्राम प्रति मिलीलीटर की अंतिम लिपिड एकाग्रता में एक मिलीलीटर पिपेट का उपयोग करके हेक्साडेकेन और सिलिकॉन तेल की समान मात्रा जोड़कर एक हेक्साडेकेन सिलिकॉन तेल समाधान में लिपिड फिल्म को भंग करें। कुछ ग्लास कवरलिप्स को स्टेनलेस स्टील कवरस्लिप होल्डर में रखें और उन्हें अल्ट्रासोनिक क्लीनर में एसीटोन के साथ लगभग 10 मिनट के लिए ग्लास बीकर में साफ करें।कवरलिप्स को डबल विआयनीकृत पानी से धोएं और उन्हें नाइट्रोजन की धारा के नीचे सुखाएं। इसके अलावा, पांच मिनट के लिए ऑक्सीजन के साथ प्लाज्मा क्लीनर में एक कवरस्लिप को साफ और हाइड्रोफिलाइज करें। एक स्पिन कोटर पर प्लाज्मा-उपचारित कवरस्लिप को माउंट करें और 30 सेकंड के लिए 3,000 आरपीएम पर 200 माइक्रोलीटर पिपेट के साथ धीरे-धीरे गर्म 0.75% कम पिघलने वाले अगारोस के 140 माइक्रोलीटर जोड़कर अगारोस की एक उप-माइक्रोमीटर मोटी फिल्म के साथ कवरस्लिप को कोट करें।तुरंत पीएमएमए कक्ष के नीचे की ओर अगारोस हाइड्रोगेल की पतली परत के साथ स्पिन-लेपित कवरस्लिप संलग्न करें। सुनिश्चित करें कि अगारोस हाइड्रोगेल ऊपर की ओर इंगित करता है। कवरस्लिप के किनारों को पारदर्शी चिपकने वाला टेप के साथ पीएमएमए माइक्रो-मशीन डिवाइस पर ठीक करें, और डिवाइस को 35 डिग्री सेल्सियस तक गर्म गर्म प्लेट पर रखें।हवा के बुलबुले बनाए बिना कक्ष के इनलेट में 2.5% अगारोस समाधान के 200 माइक्रोलीटर सावधानीपूर्वक डालें। पीएमएमए कक्ष के कुओं में स्पिन-लेपित अगारोस के निर्जलीकरण से बचने के लिए अगारोस तेल इंटरफ़ेस पर लिपिड मोनोलेयर गठन शुरू करने के लिए लिपिड तेल समाधान के लगभग 60 माइक्रोलीटर के साथ पीएमएमए कक्ष के कुओं को तुरंत कवर करें। डिवाइस को लगभग दो घंटे के लिए 35 डिग्री सेल्सियस पर गर्म प्लेट पर रखें।एक बूंद इनक्यूबेशन कक्ष में कई सूक्ष्म निर्मित कुओं में से प्रत्येक में लिपिड हेक्साडेकेन सिलिकॉन तेल समाधान के लगभग 20 माइक्रोलीटर रखें। ऊर्ध्वाधर या क्षैतिज माइक्रोपिपेट पुलर का उपयोग करके लगभग 20 माइक्रोमीटर के टिप ओपनिंग व्यास के साथ एक माइक्रोकेशिका ग्लास सुई तैयार करें। सुई को लगभग पांच माइक्रोलीटर जलीय इंजेक्शन समाधान से भरें जिसमें 8.8 मिलीमोलर एचईपीईएस, फ्लोरोसेंट डाई के सात माइक्रोमोलर, फ्लू -8, 400 माइक्रोमोलर ईडीटीए, 1.32 मोलर पोटेशियम क्लोराइड और 30 नैनोमोलर टीओएम कोर कॉम्प्लेक्स या वैकल्पिक रूप से 20 नैनोमोलर ओएमपीएफ शामिल हैं।पीजो-संचालित नैनोइंजेक्टर पर जलीय इंजेक्शन समाधान के साथ सुई को माउंट करें और नैनोइंजेक्टर का उपयोग करके लिपिड हेक्साडेकेन सिलिकॉन तेल समाधान से भरे बूंद इनक्यूबेशन कक्ष में जलीय बूंदों के 100 से 200 नैनोलीटर को कुओं में इंजेक्ट करें। 35 डिग्री सेल्सियस तक गर्म गर्म प्लेट पर पीएमएमए और ड्रॉपलेट इनक्यूबेशन कक्षों को बनाए रखते हुए लगभग दो घंटे के लिए ड्रॉपलेट ऑयल इंटरफेस पर एक लिपिड मोनोलेयर के गठन की अनुमति दें। 10 माइक्रोलीटर डिस्पोजेबल पॉलीप्रोपाइलीन टिप के साथ एकल-चैनल माइक्रोलीटर पिपेट का उपयोग करके बूंद इनक्यूबेशन कक्ष के कुओं से व्यक्तिगत जलीय बूंदों को मैन्युअल रूप से पीएमएमए कक्ष के कुओं में स्थानांतरित करें।बूंदों और अगारोस हाइड्रोगेल के बीच एक लिपिड बाइलेयर बनाने के लिए बूंदों को हाइड्रोगेल-ऑयल इंटरफेस पर लिपिड मोनोलेयर पर डूबने दें। एक उल्टे प्रकाश माइक्रोस्कोप के नमूना धारक पर ड्रॉपलेट इंटरफ़ेस बाइलेयर या डीआईबी झिल्ली के साथ पीएमएमए कक्ष को माउंट करें, और 10x हॉफमैन मॉड्यूलेशन कंट्रास्ट उद्देश्य का उपयोग करके झिल्ली गठन का आकलन करें। यदि डीआईबी झिल्ली का गठन हुआ है, तो एपिफ्लोरेसेंस रोशनी के लिए पारंपरिक प्रकाश स्रोत, 488 नैनोमीटर लेजर और लगभग 0.16 माइक्रोमीटर के पिक्सेल आकार को प्राप्त करने के लिए एक बैक-इल्युमिनेटेड इलेक्ट्रॉन गुणा सीसीडी कैमरा से लैस टीआईआरएफ माइक्रोस्कोप के नमूना धारक पर पीएमएमए कक्ष माउंट करें।जीएफपी फिल्टर सेट का उपयोग करके उच्च तीव्रता प्रकाश स्रोत के साथ एपिफ्लोरेसेंस रोशनी के तहत 10 एक्स आवर्धन उद्देश्य के साथ डीआईबी झिल्ली के किनारे पर ध्यान केंद्रित करें। जीएफपी फिल्टर सेट का उपयोग करके उच्च तीव्रता प्रकाश स्रोत के साथ एपिफ्लोरेसेंस रोशनी के तहत 100x NA 1.49 एपोक्रोमैटिक तेल TIRF उद्देश्य के साथ उच्च आवर्धन पर डीआईबी झिल्ली के एक ही किनारे पर ध्यान केंद्रित करें। जीएफपी से क्वाड बैंड टीआईआरएफ फ़िल्टर सेट में फ़िल्टर सेटिंग बदलें, 488 नैनोमीटर लेजर पर स्विच करें, और उद्देश्य लेंस पर लेजर की तीव्रता सेट करें।एकल आयन चैनलों की कल्पना करने के लिए, टीआईआरएफ कोण और ईएम सीसीडी कैमरा लाभ को समायोजित करें ताकि डीआईबी झिल्ली में खुले आयन चैनल अंधेरे पृष्ठभूमि पर उच्च कंट्रास्ट फ्लोरोसेंट स्पॉट के रूप में दिखाई दें, और सिग्नल टू बैकग्राउंड अनुपात अधिकतम तक पहुंच जाए। सुनिश्चित करें कि एकल आयन चैनलों के माध्यम से कैल्शियम आयन प्रवाह के अनुरूप धब्बे फोकस में रहते हैं और केंद्र में उच्च तीव्रता के साथ एक गोल आकार रखते हैं और धीरे-धीरे परिधि की ओर कम होते हैं। जांचें कि फ्लोरोसेंट स्पॉट यह सुनिश्चित करने के लिए फोकस में हैं कि आयन चैनल डीआईबी झिल्ली में पुनर्गठित हुए हैं और झिल्ली विमान में पार्श्व रूप से आगे बढ़ रहे हैं।अंत में, झिल्ली छवियों की एक श्रृंखला रिकॉर्ड करें जो व्यक्तिगत आयन चैनलों की खुली-बंद स्थिति की स्थिति और निगरानी की उचित ट्रैकिंग की अनुमति देती है। पार्श्व गतिशीलता के प्रकार और चैनल गतिविधि की स्थिति को निर्धारित करने के लिए, पर्याप्त रूप से लंबे और अच्छी तरह से नमूना प्रक्षेपपथ प्राप्त करें। न्यूरोस्पोरा क्रैसा टीओएम-सीसी की क्रायो ईएम संरचना यहां दिखाई गई है।एन.क्रैसा दाग से माइटोकॉन्ड्रिया जिसमें टीओएम 22 होता है, जिसमें 6-हिस टैग होता है, को डीडीएम में घुलनशील किया गया था और निकल एनटीए आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी और आयन एक्सचेंज क्रोमैटोग्राफी के अधीन किया गया था। तुलना के लिए उपयोग किए जाने वाले पृथक टीओएम-सीसी क्रिस्टल संरचना के एसडीएस-पेज और शुद्ध ई.कोलाई ओएमपीएफ के एसडीएस-पेज यहां दिखाए गए हैं। टीओएम-सीसी के संबंधित प्रक्षेपवक्र में फ्लोरोसेंट आयाम ट्रेस इंगित करता है कि टीओएम-सीसी की खुली-बंद चैनल गतिविधि परिसर की पार्श्व झिल्ली गतिशीलता से संबंधित है।आयाम ट्रेस तीन पारगम्यता अवस्थाओं को प्रदर्शित करता है: चलती चैनलों के अनुरूप पूरी तरह से खुली स्थिति, मध्यवर्ती पारगम्यता स्थिति, और गैर-चलती चैनलों के अनुरूप बंद चैनल स्थिति। टीओएम-सीसी मध्यवर्ती अवस्था में अपनी औसत स्थिति के चारों ओर लगभग प्लस/माइनस 60 नैनोमीटर तक लड़खड़ाता है। ओएमपीएफ के संबंधित प्रक्षेपवक्र में फ्लोरोसेंट आयाम ट्रेस यहां दिखाए गए हैं।ओएमपीएफ टीओएम-सीसी की तुलना में केवल एक तीव्रता स्तर का खुलासा करता है, भले ही यह गति में हो या फंसा हुआ हो। फंसे हुए अणुओं की समय अवधि के अनुरूप प्रक्षेपवक्र खंडों को ग्रे में चिह्नित किया जाता है। ध्यान देने योग्य एक महत्वपूर्ण बात यह है कि यह विधि एक बरकरार झिल्ली वातावरण में एकल झिल्ली प्रोटीन का विश्लेषण करती है।झिल्ली प्रोटीन की गतिशीलता निकट भविष्य में वैज्ञानिक अध्ययन के लिए एक क्षितिज बनी रहेगी। हम उम्मीद करते हैं कि हमारी विधि इस क्षेत्र में महत्वपूर्ण योगदान देगी।

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Single-Molecule Imaging of Lateral Mobility and Ion Channel Activity in Lipid Bilayers using Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopy

Detergent-free Ultrafast Reconstitution of Membrane Proteins into Lipid Bilayers Using Fusogenic Complementary-charged Proteoliposomes.

Detergent-free Ultrafast Reconstitution of Membrane Proteins into Lipid Bilayers Using Fusogenic Complementary-charged Proteoliposomes. Video (Video) | JoVE

डिटर्जेंट-मुक्त Ultrafast Bilayers में झिल्ली प्रोटीन का पुनर्गठन Fusogenic पूरक का उपयोग कर Proteoliposomes आरोप लगाया ।

Detergents are indispensable for delivery of membrane proteins into 30-100 nm small unilamellar vesicles, while more complex, larger model lipid bilayers ...

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers Video (Video) | JoVE

इन विट्रो में स्व का पुनर्गठन-समर्थित लिपिड Bilayers पर प्रोटीन पैटर्न का आयोजन

Many aspects of the fundamental spatiotemporal organization of cells are governed by reaction-diffusion type systems. In vitro reconstitution of such ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator Video (Video) | JoVE

अपव्यय Microgravimetry फॉस्फोलिपिड बाइंडिंग प्रोटीन की बाइंडिंग गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए Annexin A2 करने के लिए ठोस-समर्थित लिपिड Bilayers एक क्वार्ट्ज प्रतिध्वनि का उपयोग

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy

Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy Video (Video) | JoVE

मानव लिपिड के प्रति संवेदनशील कटियन चैनल TRPC3 के एकल कण क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा संरचनात्मक निर्धारण के लिए अभिव्यक्ति और शुद्धि

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium ...

Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules

Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules Video (Video) | JoVE

एकल अणु ट्रैकिंग माइक्रोस्कोपी - Cytosolic अणु के विविध राज्यों का निर्धारण करने के लिए एक उपकरण

Single-molecule localization microscopy probes the position and motions of individual molecules in living cells with tens of nanometer spatial and ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation Video (Video) | JoVE

एकल अणु अवलोकन के लिए डीएनए Origami Nanostructures पर Dynein और Kinesin मोटर एनसेंबल्स का उत्पादन

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

High-Throughput Total Internal Reflection Fluorescence and Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy Using a Photonic Chip

High-Throughput Total Internal Reflection Fluorescence and Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy Using a Photonic Chip Video (Video) | JoVE

उच्च थ्रूपुट कुल आंतरिक प्रतिबिंब फ्लोरेसेंस और डायरेक्ट स्टोचेस्टिक ऑप्टिकल पुनर्निर्माण माइक्रोस्कोपी एक फोटोनिक चिप का उपयोग कर

Total internal reflection fluorescence (TIRF) is commonly used in single molecule localization based super-resolution microscopy as it gives enhanced ...

Conventional BODIPY Conjugates for Live-Cell Super-Resolution Microscopy and Single-Molecule Tracking

Conventional BODIPY Conjugates for Live-Cell Super-Resolution Microscopy and Single-Molecule Tracking Video (Video) | JoVE

लाइव-सेल सुपर-रेजोल्यूशन माइक्रोस्कोपी और एकल-अणु ट्रैकिंग के लिए पारंपरिक बॉडीपी कंजूगेट्स

Single molecule localization microscopy (SMLM) techniques overcome the optical diffraction limit of conventional fluorescence microscopy and can resolve ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH Video (Video) | JoVE

एकल अणु मछली द्वारा ट्रांसक्रिप्शनल एक्टिव एलील्स का एकल सेल विश्लेषण

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

Single Molecule Fluorescence Energy Transfer Study of Ribosome Protein Synthesis

Single Molecule Fluorescence Energy Transfer Study of Ribosome Protein Synthesis Video (Video) | JoVE

रिबोसोम प्रोटीन संश्लेषण का एकल अणु फ्लोरेसेंस एनर्जी ट्रांसफर अध्ययन

The ribosome is a large ribonucleoprotein complex that assembles proteins processively along mRNA templates. The diameter of the ribosome is approximately ...