Name: single-molecule imaging of lateral mobility and ion channel activity in lipid bilayers using total internal reflection fluorescence (tirf) microscopy
Uploaded: 2023-02-17T14:40:00
Duration: 8 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-Molecule Imaging of Lateral Mobility and Ion Channel Activity in Lipid Bilayers using Total Internal Reflection Fluorescence TIRF Microscopy Video at J

Ringraziamo Beate Nitschke per il suo aiuto nella preparazione delle proteine e Robin Ghosh, Michael Schweikert (Stoccarda) e Maximilan Ulbrich (Friburgo) per le discussioni approfondite. Questo lavoro è stato sostenuto dal Centro di ricerca di Stoccarda Systems Biology (SRCSB) e da una sovvenzione della Fondazione Baden Württemberg (BiofMO-6 to SN).

Non dichiariamo conflitti di interesse.

Il protocollo qui presentato fornisce un'introduzione all'uso delle membrane DIB per studiare l'interazione tra il movimento laterale del canale ionico e la funzione del canale utilizzando la microscopia TIRF a singola molecola. Per ottenere i migliori dati possibili, la preparazione di membrane DIB stabili con il maggior numero possibile di canali ben separati è fondamentale per ottenere serie temporali di singole particelle, che possono essere analizzate in modo soddisfacente.
I parametri critici da ottimizzare includono la scelta dei lipidi, la concentrazione lipidica nella fase oleosa e le concentrazioni proteiche e detergenti nelle goccioline acquose. I lipidi impiegati sono insoliti, in quanto non mostrano una chiara transizione di fase a basse temperature. DPhPC è un lipide comunemente usato per produrre sistemi di membrana stabili40. In linea di principio, qualsiasi lipide che mantiene il suo ambiente fluido a basse temperature può essere adatto per questa applicazione. Inoltre, il lipide non dovrebbe essere sensibile all'ossidazione. La concentrazione di detergente nelle goccioline deve essere la più bassa possibile per evitare la rottura della membrana. Membrane stabili e buoni tassi di incorporazione proteica sono generalmente raggiunti con concentrazioni di detergente inferiori alla concentrazione critica di micelle (cmc), dato che la proteina di membrana non precipita.
Se le membrane DIB non tollerano detergenti specifici21,41, o se le proteine non si integrano da soluzione detergente bassa nelle membrane DIB, i canali proteici possono prima essere ricostituiti in piccole vescicole lipidiche unilamellari (SUV), che vengono poi fuse alle membrane DIB dal lato goccioline, come è stato dimostrato con successo per E. coli MscL 42 . A volte, le membrane DIB non si formano perché la concentrazione lipidica nella fase oleosa è troppo bassa. Per evitare che le membrane DIB scoppino, si dovrebbe anche essere consapevoli che la pressione osmotica tra l'idrogel e la goccia deve essere bilanciata con precisione senza influenzare eccessivamente il flusso di Ca2+ da cis a trans. Lo spessore dell'agarosio ottimizzato e la dimensione delle maglie sembrano essere cruciali per osservare la diffusione delle proteine di membrana. Qualsiasi essiccazione dello strato di agarosio dovrebbe essere evitata. Lo spessore può essere determinato utilizzando la microscopia a forza atomica17. Variando la concentrazione, il volume e la velocità di rotazione dell'agarosio durante il rivestimento di rotazione, è possibile ottimizzare la dimensione e lo spessore della maglia dell'idrogel. Si noti, tuttavia, che lo spessore dello strato di idrogel influisce sul contrasto dell'immagine. Per catturare le proteine di membrana nei DIB, l'idrogel di agarosio può essere sostituito da agarosio sintetizzato su misura, non reticolato, modificato con Ni-NTA, a basso punto di fusione per intrappolarle tramite un His-tag17. Un fondo di fluorescenza eccessivamente elevato è spesso causato dalla rottura delle membrane DIB. Questo è particolarmente un problema con le camere multi-pozzetto, poiché il colorante sensibile al Ca2+ si diffonde nell'idrogel. In questo caso, i pozzi adiacenti dovrebbero essere evitati. Lo sbiancamento a fluorescenza del colorante sensibile al Ca2+ sopra la membrana non dovrebbe essere un fattore limitante significativo, poiché viene scambiato da coloranti non eccitati nella maggior parte della goccia (Figura 3A) al di fuori del campo evanescente TIRF. La precisione di localizzazione della proteina è data dall'accuratezza dell'adattamento delle macchie e dalla dimensione dei pixel.
Segnali di fluorescenza deboli possono essere causati da un basso flusso di Ca2+ attraverso il canale. Le possibili ragioni includono: (i) impostazioni TIRF imprecise (ad esempio, intensità laser), (ii) la pressione osmotica di Ca 2+ attraverso la membrana, o (iii) la permeabilità intrinseca al Ca2+ dei canali è troppo bassa. Per far fronte al primo problema, l'intensità del laser, l'angolo TIRF e il guadagno della fotocamera devono essere ottimizzati. Questi ultimi due problemi possono essere superati applicando un potenziale elettrico attraverso la membrana 2,43. Tuttavia, l'applicazione di tensioni esterne può distorcere il risultato, poiché gli effetti elettrici possono influenzare l'apertura del canale di canali ionici ligando-dipendenti o meccanosensibili che in realtà non sono controllati in tensione. Esempi di tali canali sono la proteina mitocondriale translocasi TOM-CC27 e la sua subunità di formazione dei canali Tom40 26,44,45,46. Infine, va notato che, inserire proteine di membrana nelle membrane DIB in un orientamento specifico per ottenere una funzionalità desiderata è complicato, e gli studi quantitativi sono rari47,48. In alcuni casi, l'orientamento delle proteine integrate è casuale. Questo è un problema serio per lo studio delle proteine di membrana, perché alcune proteine di membrana sono attivate solo su un lato della membrana.
La microscopia TIRF è un potente metodo per affrontare eventi di singole molecole nelle membrane planari supportate49. Gli esempi includono l'assemblaggio e la delucidazione del percorso di ripiegamento di proteine canale come α-emolisina50, perfringolisina O 51 e OmpG52. Questi studi includevano FRET come tecnica aggiuntiva. Inoltre, l'attivazione del canale ionico meccanosensibile MscL è stata precedentemente studiata mediante stimolazione meccanica di bistrati DIB supportati42 utilizzando misure di corrente. Sulla base di questo lavoro, studi futuri potrebbero combinare la piattaforma qui descritta con esperimenti FRET a singola molecola per affrontare i canali meccanosensibili a livello di singola molecola in modo ottico17. L'iniezione di tampone nella goccia, l'allungamento del monostrato DIB interno o il legame mirato di singoli canali all'idrogel sottostante possono essere utilizzati per studiare ulteriormente non solo il meccanismo fisico dei canali attivati meccanicamente, che rispondono alla tensione e/o alla curvatura della membrana come mostrato per MscL e MscS, il dominio a due pori K+-canali, TREK-1, TREK-2, e TRAAK, e PIEZO (per la revisione, vedi53), ma anche legame locale al citoscheletro cellulare, come mostrato per il canale ionico sensibile al tocco NOMPC54,55.

Il presente protocollo si propone di descrivere come studiare la correlazione tra mobilità di membrana e permeabilità dei canali ionici di proteine di membrana in membrane a doppio strato (DIB) supportate da polimeri 1,2,3.
La presente tecnica integra una serie impressionante di strumenti analitici ottici e di superficie avanzati, come il tracciamento di singole particelle4,5, la spettroscopia di correlazione di fluorescenza 6,7 e la microscopia a forza atomica ad alta velocità 8,9,10. Questi forniscono preziose informazioni sulla composizione dinamica e sulla struttura delle membrane che influenzano le reazioni basate sulla membrana11,12,13. Mentre il movimento e la diffusione laterale delle proteine dipendono dalla densità locale delle proteine nella membrana, le singole molecole proteiche possono anche essere intrappolate nelle zattere lipidiche14 e dalle interazioni proteina-proteina15,16. A seconda dei domini proteici che sporgono dalla membrana nell'ambiente extracellulare o citosol, la mobilità delle proteine può variare da altamente mobile a completamente immobile. Tuttavia, a causa della complessità della membrana e delle sue strutture periferiche, è spesso difficile decifrare l'interazione tra la natura della mobilità laterale e la funzione proteica17.
Le membrane DIB hanno dimostrato di essere una piattaforma efficiente per l'analisi biofisica di singole molecole delle proteine di membrana 18,19,20,21,22. Sono formati dall'autoassemblaggio lipidico attraverso il contatto di goccioline acquose con substrati supportati da idrogel in fase lipido/oleosa. Analogamente ai doppi strati lipidici supportati (SLB) comunemente usati1,23,24,25, i DIB consentono la regolazione locale della mobilità laterale mediante legame temporaneo o permanente delle proteine alla matrice polimerica quando funzionalizzati con ligandi adatti17. Quest'ultimo può servire come sistema modello per i processi biochimici nelle membrane cellulari con una distribuzione proteica eterogenea10.
L'approccio sperimentale qui descritto si basa sulla fluorescenza dei coloranti sensibili al Ca 2+ per misurare il flusso ionico Ca 2+ attraverso singoli canali in prossimità della membrana 2,22 utilizzando la microscopia TIRF. Questo approccio ottico limita l'illuminazione del campione a una distanza vicina alla membrana, che, a causa delle proprietà fisiche della luce di eccitazione evanescente, porta ad una significativa riduzione del fondo di fluorescenza. Quest'ultimo è un prerequisito se è richiesta un'elevata risoluzione spaziale e temporale per la rilevazione di singole molecole. A differenza dei classici metodi elettrofisiologici26,27, non sono necessarie tensioni di membrana per studiare il flusso ionico attraverso i singoli canali. Inoltre, il metodo non richiede l'etichettatura con coloranti fluorescenti o molecole che potrebbero interferire con il movimento laterale dei canali nella membrana.
Il metodo è particolarmente utile per studiare i canali proteici incorporati nella membrana a livello di singola molecola senza utilizzare l'elettrofisiologia classica. Utilizzando il canale conduttore di proteine mitocondriali TOM-CC di Neurospora crassa28,29,30 e OmpF, che supporta la diffusione di piccole molecole idrofile attraverso la membrana esterna di Escherichia coli17,31, illustriamo come le mobilità di membrana e le attività del canale delle due proteine possono essere studiate e correlate. Suggeriamo che questo approccio, sebbene ottimizzato per TOM-CC e OmpF, possa essere facilmente applicato ad altri canali proteici.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850356C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x Oil objective Apochromat N.A. 1.49</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRD01991</td>
			<td>TIRF microscope&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Hoffmann modulation contrast objective NA 0.25&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Microscope to assess DIB membrane formation&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x objective N.A. 0.25</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRL00102</td>
			<td>TIRF microscope&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40x Hoffmann modulation contrast objective NA 0.55</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Microscope to assess DIB membrane formation&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>488 nm laser, 100 mW&#160;&#160;</td>
			<td>Visitron</td>
			<td></td>
			<td>TIRF microscope&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive tape</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#196;kta pure&#160;&#160;</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td></td>
			<td>Protein purification system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford assay kit, Pierce</td>
			<td>Thermo Fisher&#160;</td>
			<td>23236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Roth</td>
			<td>5239.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chelax 100 resin</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>143-2832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>MC1024452500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis cassettes Slide-A-Lyzer 20 k MWCO</td>
			<td>Thermo Fisher&#160;</td>
			<td>87735</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DIB chamber&#160;</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
			<td>PMMA chamber for DIB membranes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital power meter and energy console</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PM100D</td>
			<td>Laser power meter&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Roth&#160;</td>
			<td>4720.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double distilled H2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse TS 100 Hoffmann modulation contrast microscope&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Microscope to assess DIB membrane formation&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Roth</td>
			<td>8042.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMCCD camera iXon Ultra 897</td>
			<td>Andor</td>
			<td></td>
			<td>TIRF microscope&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>32205-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixed angle rotor Ti70</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-8, CalciFluorTM</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>SC-362561</td>
			<td>Ca2+-sensitive dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>French press cell disruption homogenizer</td>
			<td>Igneus</td>
			<td>Igneus 40000 psi</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP filter</td>
			<td>AHF</td>
			<td></td>
			<td>Filter seeting used for excitation of DIB-membranes by epifluorescence with white light source&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>4878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips 40 mm x 24 mm x 0.13 mm</td>
			<td>Roth</td>
			<td>1870.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3783.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe 10 mL</td>
			<td>Roth</td>
			<td>X033.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe 100 mL</td>
			<td>Roth</td>
			<td>X049.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe 500 mL</td>
			<td>Roth</td>
			<td>EY49.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating block&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Thermomixer comfort</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating plate</td>
			<td>Minitube&#160;</td>
			<td>HT200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Roth&#160;</td>
			<td>9205.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexadcane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>296317</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>His Trap HP 1 mL</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>29051021</td>
			<td>Ni-NTA column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1.04716.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>10314243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KLM spin coater&#160;</td>
			<td>Schaefer Tec</td>
			<td>SCV-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>List medical L/M-3P-A vertical pipette puller</td>
			<td>Artisan Technology Group</td>
			<td>57761-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low melting point agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>A9414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M8 Stereomicroscope</td>
			<td>Wild</td>
			<td></td>
			<td>Stereomicrosope&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab&#160;</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>R2022a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroFil pipette tips</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MF34G-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 gas</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3957.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoliter 2010 injector&#160;</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>Nanoliter 2010&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-dodecyl-b-D-maltoside</td>
			<td>Glycon Biochemicals</td>
			<td>D97002-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA agarose, non-crosslinked</td>
			<td>Cube Biotech</td>
			<td>124115393</td>
			<td>Custom made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements AR software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MQS31100/MQS42560/MQS42580/MQS42780/MQS41930</td>
			<td>Imaging software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-octyl-polyoxyethylene</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>40530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O2 gas</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethylsulfonyl fluoride</td>
			<td>Roth&#160;</td>
			<td>6367.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photodiode sensor&#160; Si, 400 - 1100 nm, 500 mW</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>S130C</td>
			<td>Sensor for laser power meter&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner</td>
			<td>Diener Electronics</td>
			<td>Zepto</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Preparative ultracentrifuge Optima</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quad-band TIRF-filter 446/523/600/677 HC</td>
			<td>AHF</td>
			<td></td>
			<td>Filter setting used for excitation of DIB-membranes with 488 nm laser&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resource Q 1 mL</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>17117701</td>
			<td>Anion exchange column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon oil AR 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Roth</td>
			<td>2326.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super LoLux camera</td>
			<td>JVC</td>
			<td></td>
			<td>Stereomicrosope&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermoshaker</td>
			<td>Gerhardt</td>
			<td>THL 500/1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ti-E Fluorescence microscope&#160;&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MEA53100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9090.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Roth</td>
			<td>8952.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic bath&#160;</td>
			<td>Bandelin Sonorex</td>
			<td>RK 100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaccum pump</td>
			<td>Vacuubrand</td>
			<td>MD 4C NT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White light source for epifluorescence illumination (100 W)</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MBF72655</td>
			<td>TIRF microscope&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Roth</td>
			<td>2363.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-molecule imaging of lateral mobility and ion channel activity in lipid bilayers using total internal reflection fluorescence (tirf) microscopy

Le tecniche di imaging ad alta risoluzione hanno dimostrato che molti canali ionici non sono statici, ma soggetti a processi altamente dinamici, tra cui l'associazione transitoria di subunità ausiliarie e di formazione dei pori, la diffusione laterale e il raggruppamento con altre proteine. Tuttavia, la relazione tra diffusione laterale e funzione è poco conosciuta. Per affrontare questo problema, descriviamo come la mobilità laterale e l'attività dei singoli canali nelle membrane lipidiche supportate possono essere monitorate e correlate utilizzando la microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale (TIRF). Le membrane sono fabbricate su un substrato di idrogel ultrasottile utilizzando la tecnica DIB (Droplet Interface Bilayer). Rispetto ad altri tipi di membrane modello, queste membrane hanno il vantaggio di essere meccanicamente robuste e adatte a tecniche analitiche altamente sensibili. Questo protocollo misura il flusso ionico Ca 2+ attraverso singoli canali osservando l'emissione di fluorescenza di un colorante sensibile al Ca2+ in prossimità della membrana. A differenza dei classici approcci di tracciamento a singola molecola, non sono necessarie proteine o etichette di fusione fluorescenti, che possono interferire con il movimento laterale e la funzione nella membrana. Possibili cambiamenti nel flusso ionico associati a cambiamenti conformazionali della proteina sono dovuti solo al movimento laterale della proteina nella membrana. I risultati rappresentativi sono mostrati utilizzando il canale di traslocazione proteica mitocondriale TOM-CC e il canale batterico OmpF. A differenza di OmpF, il gating di TOM-CC è molto sensibile al confinamento molecolare e alla natura della diffusione laterale. Quindi, i doppi strati di interfaccia goccia supportati sono un potente strumento per caratterizzare il legame tra diffusione laterale e la funzione dei canali ionici.

La registrazione ottica a canale singolo senza elettrodi in tempo reale rivela l'interazione tra il movimento laterale delle proteine e la funzione dei singoli canali ionici nelle membrane DIB. La ricostituzione del complesso del nucleo mitocondriale TOM (Figura 1A) in una membrana DIB (Figura 4D) illustra una forte correlazione temporale tra mobilità laterale e permeabilità ionica (Figura 5A). Il gating TOM-CC sembra essere sensibile alla modalità di movimento laterale17. I canali mobili mostrano il flusso di Ca2+ attraverso i loro pori e alte intensità del punto di fluorescenza. Le molecole intrappolate e non in movimento mostrano intensità di fluorescenza basse e medie. Per il poro generale di importazione proteica dei mitocondri TOM-CC, questo approccio a singola molecola ha rivelato una forte correlazione temporale tra mobilità laterale e permeabilità ionica, suggerendo che il canale TOM-CC ha proprietà meccanosensibili17. Un arresto laterale delle molecole di TOM-CC che si muovono liberamente è accompagnato da una chiusura parziale o completa del canale TOM-CC. L'imaging delle membrane DIB con OmpF (Figura 1E e Figura 4F), che è quasi completamente incorporato nella membrana, non mostra effetti stop-and-go (Figura 5B). Gli arresti casuali di OmpF non sono associati a un cambiamento di intensità e, quindi, alla chiusura dei suoi pori. Sulla base dei segnali di fluorescenza38, l'accuratezza posizionale dei singoli canali può essere stimata nell'intervallo tra 5 e 10 nm. Tuttavia, va notato che questa precisione non può essere raggiunta se i canali oscillano leggermente a causa dell'ancoraggio mobile con l'idrogel di agarosio, come mostrato, ad esempio, per le molecole TOM-CC in uno stato intermedio con uno spostamento medio delle radici di 120 nm (Figura 5A).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64970/64970fig01.jpg"> Figura 1: Isolamento di TOM-CC. (A) Struttura criogenica EM di N. crassa TOM-CC30,39. I mitocondri di un ceppo di N. crassa contenente un Tom22 con un tag 6xHis sono stati solubilizzati in DDM e sottoposti a cromatografia di affinità Ni-NTA (B) e cromatografia a scambio anionico (C). (D) SDS-PAGE di TOM-CC isolato. (E) Struttura cristallina (PDB, 1OPF) e (F) SDS-PAGE di E. coli purificato OmpF. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64970/64970fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64970/64970fig02.jpg"> Figura 2: Diagramma di flusso dell'assemblaggio della camera in PMMA. Fase 1: Un vetrino di copertura è rivestito con un idrogel di agarosio. Fase 2: Il coprislip rivestito di spin è montato in una camera di microscopia PMMA personalizzata. Fase 3: L'ulteriore agarosio a basso punto di fusione viene aggiunto nella porta di ingresso della camera PMMA su una piastra calda a 35 °C. Fase 4: I monostrati lipidici si formano attorno alle goccioline acquose in un'interfaccia tampone/olio (a sinistra) e sull'interfaccia idrogel/olio di agarosio (a destra). Fase 5: Le singole goccioline acquose vengono pipettate nei pozzetti della camera PMMA per formare un doppio strato lipidico al contatto dei due monostrati lipidici. Fase 6: La formazione delle membrane DIB è convalidata dalla microscopia a contrasto a modulazione di Hofmann. Fase 7: Le immagini delle aree selezionate delle membrane DIB con canali ionici inseriti vengono acquisite mediante microscopia TIRF. Verde: 0,75% agarosio; giallo: 2,5% agarosio contenente ioni Ca2+ ; magenta: fase lipidica/oleosa; blu scuro: tampone acquoso contenente colorante e proteine sensibili al Ca2+. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64970/64970fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64970/64970fig03.jpg"> Figura 3: Setup sperimentale. (A) Rappresentazione schematica di una membrana DIB in un pozzetto PMMA. Il doppio strato poggia su un film di agarosio ultrasottile allo 0,75% per consentire l'imaging TIRF del flusso di Ca 2+ attraverso un canale ionico nel tempo utilizzando un colorante di fluorescenza sensibile al Ca2+ (Fluo-8) in trans. (B) Il flusso Ca2+ è controllato esclusivamente dalla pressione osmotica da cis a trans. Ciò consente sia la determinazione della posizione nella membrana che lo stato aperto-chiuso del canale. Il canale mostrato qui è il canale conduttore proteico TOM-CC dei mitocondri di N. crassa 30. (C) Traiettoria di un singolo canale TOM-CC. Verde: canale mobile; giallo: canale non mobile. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64970/64970fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64970/64970fig04.jpg"> Figura 4: Imaging di TOM-CC e OmpF nelle membrane DIB . (A) Membrana DIB ripresa mediante microscopia a contrasto a modulazione di Hoffmann che mostra l'area di contatto a doppio strato tra l'idrogel e la goccia. (B) Membrana DIB rotta ripresa come in (A). Freccia, bordo della camera in PMMA. (C) Membrana DIB ripresa mediante microscopia TIRF senza canali proteici. (D) Membrana DIB con TOM-CC ricostituito, ripresa mediante microscopia TIRF. I quadrati bianchi segnano punti di alta (SH), intermedia (SI) e bassa (SL) intensità. (E) L'adattamento del profilo di intensità di fluorescenza dei tre punti contrassegnati in (A) alle funzioni gaussiane bidimensionali rivela la posizione dei singoli TOM-CC e il flusso Ca2+ attraverso il canale. (F) Membrana DIB con OmpF ricostituito. (G) Adattamento gaussiano dello spot fluorescente contrassegnato in (F). In contrasto con il complesso proteico a due pori β barile TOM-CC, l'OmpF a tre pori β barile rivela solo uno stato di permeabilità. Dimensione pixel, 0,16 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64970/64970fig04large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64970/64970fig05.jpg"> Figura 5: L'attività del canale è correlata alla mobilità laterale di TOM-CC. (A) La traccia di ampiezza fluorescente (in alto) e la traiettoria corrispondente (in basso) di TOM-CC indicano che l'attività del canale aperto-chiuso di TOM-CC è correlata alla mobilità laterale della membrana del complesso. La traiettoria visualizza tre stati di permeabilità. Verde: stato completamente aperto; giallo: stato di permeabilità intermedio; rosso: stato del canale chiuso; stella rossa: TOM-CC nello stato intermedio oscilla intorno alla sua posizione media di circa ±60 nm. Le precisioni posizionali37 basate sui segnali di fluorescenza negli stati completamente aperto e intermedio variano tra 5 nm e 10 nm. (B) Traccia di ampiezza fluorescente (in alto) e traiettoria corrispondente (in basso) di OmpF. OmpF rivela solo un livello di intensità, indipendentemente dal fatto che sia in movimento o intrappolato. I segmenti di traiettoria corrispondenti ai periodi di tempo delle molecole intrappolate sono contrassegnati in grigio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64970/64970fig05large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Buffer </td>
			<td colspan="3">Concentrazioni di reagenti</td>
			<td>Volume</td>
		</tr><tr><td>A1*</td>
			<td colspan="3">20 mM Tris-HCl pH 8,5, 0,1 % (p/v) di n-dodecil-β-D-maltoside (DDM), 10% (v/v) di glicerolo, 300 mM di NaCl e 1 mM di fenilmetilsulfonile fluoruro (PMSF)</td>
			<td>100 ml</td>
		</tr><tr><td>A2*</td>
			<td colspan="3">20 mM Tris-HCl pH 8,5, 0,1% (p/v) DDM, 10% (v/v) glicerolo, 1 M Imidazolo e 1 mM PMSF</td>
			<td>100 ml</td>
		</tr><tr><td>B1*</td>
			<td colspan="3">20 mM HEPES pH 7,2, 0,1% (p/v) DDM, 2% (v/v) dimetilsolfossido (DMSO)</td>
			<td>100 ml</td>
		</tr><tr><td>B2*</td>
			<td colspan="3">20 mM HEPES pH 7,2, 0,1% (p/v) DDM, 1 M KCl, 2% (v/v) dimetilsolfossido (DMSO)</td>
			<td>100 ml</td>
		</tr><tr><td colspan="5">* Degasare e passare attraverso un filtro da 0,22 μm prima dell'uso.</td>
		</tr></tbody></table>Tabella 1: Soluzioni tampone per l'isolamento TOM-CC.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Buffer </td>
			<td colspan="3">Concentrazioni di reagenti</td>
			<td>Volume</td>
		</tr><tr><td>LB*</td>
			<td colspan="3">1% (p/v) di triptone, 1% (p/v) di estratto di lievito NaCl e 0,5% (p/v)</td>
			<td>1100 ml</td>
		</tr><tr><td>C1</td>
			<td colspan="3">2 mM MgCl2 e ~750 unità DNAse e 50 mM Tris-HCl pH 7,5</td>
			<td>20 ml</td>
		</tr><tr><td>C2</td>
			<td colspan="3">50 mM Tris-HCl, pH 7,5</td>
			<td>50 ml</td>
		</tr><tr><td>C3</td>
			<td colspan="3">4% (p/v) di sodio dodecilsolfato (SDS), 2 mM β-mercaptoetanolo e 50 mM Tris-HCl pH 7,5</td>
			<td>50 ml</td>
		</tr><tr><td>C4</td>
			<td colspan="3">2% (p/v) SDS, 500 mM NaCl e 50 mM Tris-HCl pH 7,5</td>
			<td>50 ml</td>
		</tr><tr><td>C5</td>
			<td colspan="3">0,5% (p/v) ottile poliossietilene (ottile POE), 1 mM EDTA e 20 mM Tris pH 8,5</td>
			<td>1000 ml</td>
		</tr><tr><td colspan="5">* Sterilizzare prima dell'uso.</td>
		</tr></tbody></table>Tabella 2: Soluzioni tampone per l'isolamento di OmpF.

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Single-Molecule Imaging of Lateral Mobility and Ion Channel Activity in Lipid Bilayers using Total Internal Reflection Fluorescence TIRF Microscopy Video (Video) | JoVE

Questo protocollo descrive come utilizzare la microscopia TIRF per tracciare i singoli canali ionici e determinare la loro attività nelle membrane lipidiche supportate, definendo così l'interazione tra il movimento laterale della membrana e la funzione del canale. Descrive come preparare le membrane, registrare i dati e analizzare i risultati.

Imaging a singola molecola della mobilità laterale e dell'attività dei canali ionici in doppi strati lipidici mediante microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale (TIRF)

High-resolution imaging techniques have shown that many ion channels are not static, but subject to highly dynamic processes, including the transient ...

I canali ionici non sono statici nelle membrane biologiche. Qui presentiamo un approccio ottico a singola molecola per svelare il legame tra diffusione laterale della membrana e funzione del canale ionico. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ad altri metodi è che non è richiesta la marcatura fluorescente delle proteine che potrebbero interferire con il loro movimento laterale e la loro funzione.Il metodo può essere applicato a qualsiasi canale proteico di membrana in cui la diffusione libera o limitata è importante per l'organizzazione e la funzione. Per iniziare, trasferire 380 microlitri della soluzione madre DPhPC in una fiala di vetro e sovrapporre la soluzione madre lipidica con argon o azoto gassoso per prevenire l'ossidazione dei lipidi. Utilizzare il flusso di gas più basso possibile per evitare l'evaporazione del solvente organico in cui i lipidi sono sciolti o gli spruzzi degli spray di solvente dal flaconcino.Asciugare il campione lipidico sotto un flusso di azoto e rimuovere il solvente organico rimanente dal campione lipidico sotto vuoto utilizzando una pompa per vuoto oil-free durante la notte. Sciogliere il film lipidico in una soluzione di olio di silicone esadecano aggiungendo volumi uguali di esadecano e olio di silicone utilizzando una pipetta da un millilitro per una concentrazione lipidica finale di 9,5 milligrammi per millilitro. Posizionare alcuni coprivetrini in un portavetrini in acciaio inossidabile e pulirli in un becher di vetro per circa 10 minuti con acetone in un pulitore ad ultrasuoni.Risciacquare i coprivetrini con acqua doppia deionizzata e asciugarli sotto un getto di azoto. Inoltre, pulire e idrofilizzare un coprivetrino in un detergente al plasma con ossigeno per cinque minuti. Montare un coprislip trattato al plasma su uno spin coater e rivestire il coprislip con un film di agarosio spesso sub-micrometro aggiungendo lentamente 140 microlitri di agarosio riscaldato a 0,75% a basso punto di fusione con una pipetta da 200 microlitri a 3.000 RPM per 30 secondi.Attaccare immediatamente il coprislip rivestito di spin con lo strato sottile dell'idrogel di agarosio sul lato inferiore della camera PMMA. Assicurarsi che l'idrogel di agarosio punti verso l'alto. Fissare i bordi del coprislip al dispositivo microlavorato in PMMA con nastro adesivo trasparente e posizionare il dispositivo su una piastra riscaldata a 35 gradi Celsius.Versare con cura 200 microlitri di soluzione di agarosio al 2,5% nell'ingresso della camera senza creare bolle d'aria. Coprire immediatamente i pozzetti della camera PMMA con circa 60 microlitri di soluzione di olio lipidico per avviare la formazione di monostrato lipidico all'interfaccia dell'olio di agarosio per evitare la disidratazione dell'agarosio rivestito di spin nei pozzetti della camera PMMA. Posizionare il dispositivo su una piastra riscaldante a 35 gradi Celsius per circa due ore.Posizionare circa 20 microlitri di soluzione lipidica di olio di silicone esadecano in ciascuno dei numerosi pozzetti microfabbricati in una camera di incubazione delle goccioline. Preparare un ago di vetro microcapillare con un diametro di apertura della punta di circa 20 micrometri utilizzando un estrattore di micropipette verticale o orizzontale. Riempire l'ago con circa cinque microlitri di soluzione acquosa per iniezione contenente 8,8 millimolari HEPES, sette micromolari di un colorante fluorescente, Fluo-8, 400 micromolari EDTA, 1,32 molari di cloruro di potassio e 30 nanomolari TOM core complex o in alternativa 20 nanomolari OMPF.Montare l'ago con la soluzione di iniezione acquosa su un nanoiniettore piezoelettrico e iniettare da 100 a 200 nanolitri di goccioline acquose nei pozzetti nella camera di incubazione delle goccioline riempita con soluzione di olio di silicone lipidico esadecano utilizzando il nanoiniettore. Consentire la formazione di un monostrato lipidico all'interfaccia dell'olio di goccioline per circa due ore mantenendo le camere di incubazione del PMMA e delle goccioline su una piastra riscaldata a 35 gradi Celsius. Trasferire manualmente le singole goccioline acquose dai pozzetti della camera di incubazione delle goccioline nei pozzetti della camera PMMA utilizzando una pipetta microlitro a canale singolo con una punta in polipropilene monouso da 10 microlitri.Lasciare che le goccioline affondino sui monostrati lipidici alle interfacce idrogel-olio per formare un doppio strato lipidico tra le goccioline e l'idrogel di agarosio. Montare la camera PMMA con le membrane a doppio strato o DIB con interfaccia a goccia sul supporto del campione di un microscopio a luce invertita e valutare la formazione della membrana utilizzando un obiettivo di contrasto di modulazione Hoffman 10x. Se si sono formate membrane DIB, montare la camera PMMA sul supporto del campione di un microscopio TIRF dotato di una sorgente luminosa convenzionale per l'illuminazione dell'epifluorescenza, un laser a 488 nanometri e una telecamera CCD retroilluminata con moltiplicazione elettronica per ottenere una dimensione dei pixel di circa 0,16 micrometri.Focalizzare il bordo di una membrana DIB con un obiettivo di ingrandimento 10x sotto l'illuminazione a epifluorescenza con una sorgente luminosa ad alta intensità utilizzando un set di filtri GFP. Messa a fuoco fine dello stesso bordo della membrana DIB ad alto ingrandimento con un obiettivo TIRF di olio apocromatico 100x NA 1.49, sempre sotto illuminazione ad epifluorescenza con una sorgente luminosa ad alta intensità utilizzando un set di filtri GFP. Modificare l'impostazione del filtro da GFP al set di filtri TIRF quad band, accendere il laser a 488 nanometri e impostare l'intensità del laser sull'obiettivo.Per visualizzare singoli canali ionici, regolare l'angolo TIRF e il guadagno della telecamera CCD EM in modo che i canali ionici aperti nella membrana DIB appaiano come punti fluorescenti ad alto contrasto su uno sfondo scuro e il rapporto segnale/sfondo raggiunga il massimo. Assicurarsi che i punti corrispondenti al flusso di ioni calcio attraverso singoli canali ionici rimangano a fuoco e abbiano una forma rotonda con alta intensità al centro e gradualmente decrescente verso la periferia. Controllare che i punti fluorescenti siano a fuoco per assicurarsi che i canali ionici si siano ricostituiti nelle membrane DIB e si muovano lateralmente nel piano della membrana.Infine, registrare una serie di immagini a membrana che consentono il corretto tracciamento della posizione e il monitoraggio dello stato aperto-chiuso dei singoli canali ionici. Per determinare il tipo di mobilità laterale e lo stato dell'attività del canale, acquisire traiettorie sufficientemente lunghe e ben campionate. La struttura criogenica EM di Neurospora crassa TOM-CC è mostrata qui.I mitocondri di una colorazione di N.crassa contenente un TOM 22 con un tag 6-His sono stati solubilizzati in DDM e sottoposti a cromatografia di affinità NTA di nichel e cromatografia a scambio anionico. SDS-PAGE della struttura cristallina TOM-CC isolata e SDS-PAGE dell'OMPF purificato di E.coli utilizzato per il confronto sono mostrati qui. La traccia di ampiezza fluorescente nella traiettoria corrispondente di TOM-CC indica che l'attività del canale aperto-chiuso di TOM-CC è correlata con la mobilità laterale della membrana del complesso.La traccia di ampiezza visualizza tre stati di permeabilità: stato completamente aperto corrispondente ai canali in movimento, stato di permeabilità intermedio e stato del canale chiuso corrispondente ai canali non mobili. TOM-CC nello stato intermedio oscilla intorno alla sua posizione media di circa più / meno 60 nanometri. La traccia di ampiezza fluorescente nella traiettoria corrispondente di OMPF è mostrata qui.OMPF rivela solo un livello di intensità rispetto a TOM-CC, indipendentemente dal fatto che sia in movimento o intrappolato. I segmenti di traiettoria corrispondenti ai periodi di tempo delle molecole intrappolate sono contrassegnati in grigio. Una cosa importante da notare è che questo metodo analizza le proteine di singola membrana in un ambiente di membrana intatto.La dinamica delle proteine di membrana rimarrà un orizzonte per gli studi scientifici nel prossimo futuro. Ci aspettiamo che il nostro metodo contribuisca in modo significativo a questo campo.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Single-Molecule Imaging of Lateral Mobility and Ion Channel Activity in Lipid Bilayers using Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopy

Detergent-free Ultrafast Reconstitution of Membrane Proteins into Lipid Bilayers Using Fusogenic Complementary-charged Proteoliposomes.

Detergent-free Ultrafast Reconstitution of Membrane Proteins into Lipid Bilayers Using Fusogenic Complementary-charged Proteoliposomes. Video (Video) | JoVE

Privo di detersivo ultraveloce ricostituzione delle proteine di membrana in lipidici utilizzando fusogena proteoliposomi complementari a carico.

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Ricerca

Biochimica

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In Vitro Ricostituzione di Self-Organizing pattern proteico su lipidici supportati

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The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

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