Name: single-molecule imaging of lateral mobility and ion channel activity in lipid bilayers using total internal reflection fluorescence (tirf) microscopy
Uploaded: 2023-02-17T14:40:00
Duration: 8 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-Molecule Imaging of Lateral Mobility and Ion Channel Activity in Lipid Bilayers using Total Internal Reflection Fluorescence TIRF Microscopy Video at J

Agradecemos a Beate Nitschke por sua ajuda com a preparação de proteínas e a Robin Ghosh, Michael Schweikert (Stuttgart) e Maximilan Ulbrich (Freiburg) por discussões perspicazes. Este trabalho foi apoiado pelo Centro de Pesquisa em Biologia de Sistemas de Stuttgart (SRCSB) e uma bolsa da Fundação Baden Württemberg (BiofMO-6 para SN).

Declaramos a inexistência de conflitos de interesse.

O protocolo aqui apresentado fornece uma introdução ao uso de membranas DIB para estudar a interação entre o movimento do canal iônico lateral e a função do canal usando microscopia TIRF de molécula única. Para obter os melhores dados possíveis, a preparação de membranas DIB estáveis com o maior número possível de canais bem separados é crucial para a obtenção de séries temporais de partículas individuais, que podem ser analisadas satisfatoriamente.
Os parâmetros críticos a serem otimizados incluem a escolha do lipídio, a concentração de lipídios na fase oleosa e as concentrações de proteína e detergente nas gotículas aquosas. Os lipídios empregados são incomuns, pois não apresentam transição de fase clara em baixas temperaturas. O DPhPC é um lipídio comumente usado para produzir sistemas de membrana estáveis40. Em princípio, qualquer lipídio que mantenha seu ambiente fluido em baixas temperaturas pode ser adequado para esta aplicação. Além disso, o lipídio não deve ser sensível à oxidação. A concentração de detergente nas gotículas deve ser a mais baixa possível para evitar a ruptura da membrana. Membranas estáveis e boas taxas de incorporação de proteínas são geralmente alcançadas com concentrações de detergente abaixo da concentração micelar crítica (CMC), uma vez que a proteína de membrana não precipita.
Se as membranas de DIB não tolerarem detergentes específicos21,41, ou se as proteínas não se integrarem a partir de solução de baixo detergente às membranas de DIB, os canais proteicos podem primeiro ser reconstituídos em pequenas vesículas lipídicas unilamelares (SUVs), que são então fundidas às membranas de DIB do lado da gota, como foi demonstrado com sucesso para E. coli MscL 42 . Às vezes, as membranas de DIB não se formam porque a concentração de lipídios na fase oleosa é muito baixa. Para evitar o rompimento das membranas de DIB, deve-se também estar ciente de que a pressão osmótica entre o hidrogel e a gotícula deve ser precisamente equilibrada sem afetar o fluxo de Ca2+ de cis para trans excessivamente. A espessura e a malha otimizadas da agarose parecem ser cruciais para observar a difusão das proteínas de membrana. Qualquer ressecamento da camada de agarose deve ser evitado. A espessura pode ser determinada por microscopia de força atômica17. Variando a concentração, o volume e a velocidade de rotação de agarose durante o revestimento de spin, o tamanho da malha e a espessura do hidrogel podem ser otimizados. Note, no entanto, que a espessura da camada de hidrogel afeta o contraste da imagem. Para capturar proteínas de membrana em DIBs, o hidrogel de agarose pode ser substituído por agarose de baixo derretimento sintetizado, não reticulado, modificado por Ni-NTA e de baixo derretimento para aprisioná-los através de um His-tag17. Um fundo de fluorescência excessivamente alto é frequentemente causado pela ruptura das membranas DIB. Isso é particularmente um problema com câmaras de poços múltiplos, já que o corante sensível ao Ca2+ se difunde para o hidrogel. Neste caso, poços adjacentes devem ser evitados. O clareamento por fluorescência do corante sensível ao Ca2+ acima da membrana não deve ser um fator limitante significativo, pois é trocado por corantes não excitados na maior parte da gotícula (Figura 3A) fora do campo evanescente do TIRF. A precisão de localização para a proteína é dada pela precisão de ajuste dos pontos e do tamanho do pixel.
Sinais de fluorescência fracos podem ser causados pelo baixo fluxo de Ca2+ através do canal. Possíveis razões incluem: (i) configurações imprecisas de TIRF (por exemplo, intensidade do laser), (ii) a pressão osmótica de Ca 2+ através da membrana ou (iii) a permeabilidade intrínseca de Ca2+ dos canais é muito baixa. Para lidar com o primeiro problema, a intensidade do laser, o ângulo TIRF e o ganho da câmera precisam ser otimizados. As duas últimas questões podem ser superadas com a aplicação de um potencial elétrico através da membrana 2,43. No entanto, a aplicação de tensões externas pode distorcer o resultado, pois efeitos elétricos podem influenciar a abertura do canal de canais iônicos ligados ao ligante ou mecanossensíveis que, na verdade, não são controlados por tensão. Exemplos de tais canais são a proteína mitocondrial translocase TOM-CC27, e sua subunidade formadora de canais Tom40 26,44,45,46. Finalmente, deve-se notar que a inserção de proteínas de membrana em membranas DIB em uma orientação específica para alcançar a funcionalidade desejada é complicada, e estudos quantitativos são raros47,48. Em alguns casos, a orientação das proteínas integradas é aleatória. Este é um problema sério para o estudo de proteínas de membrana, porque certas proteínas de membrana são ativadas em apenas um lado da membrana.
A microscopia TIRF é um método poderoso para abordar eventos de molécula única em membranas planares suportadas49. Exemplos incluem a montagem e elucidação da via de dobramento de proteínas do canal como α-hemolisina 50, perfringolisina O51 e OmpG52. Esses estudos incluíram o FRET como técnica adicional. Além disso, a ativação do canal iônico mecanossensível MscL foi previamente estudada por estimulação mecânica de bicamadas DIB suportadas42 usando medidas de corrente. Com base neste trabalho, estudos futuros poderiam combinar a plataforma aqui descrita com experimentos de FRET de molécula única para abordar canais mecanossensíveis em nível de molécula única de forma óptica17. A injeção de tampão na gota, o estiramento da monocamada DIB interna ou a ligação direcionada de canais individuais ao hidrogel subjacente podem ser usados para estudar mais detalhadamente não apenas o mecanismo físico dos canais ativados mecanicamente, que respondem à tensão e/ou curvatura da membrana, como mostrado para MscL e MscS, os canais K+ de domínio de dois poros, TREK-1, TREK-2, e TRAAK, e PIEZO (para revisão, ver53), mas também ligação local ao citoesqueleto celular, como mostrado para o canal iônico sensível ao toque NOMPC54,55.

O presente protocolo tem como objetivo descrever como estudar a correlação entre a mobilidade da membrana e a permeabilidade do canal iônico de proteínas de membrana em membranas de bicamada de interface gota-gota (DIB) suportada por polímero 1,2,3.
A presente técnica complementa uma impressionante gama de ferramentas ópticas e analíticas de superfície avançadas, tais como rastreamento de partículas únicas 4,5, espectroscopia de correlação de fluorescência6,7 e microscopia de força atômica de alta velocidade 8,9,10. Estes fornecem informações valiosas sobre a composição dinâmica e a estrutura das membranas que influenciam as reações baseadas em membranas11,12,13. Enquanto o movimento e a difusão lateral das proteínas dependem da densidade local das proteínas na membrana, moléculas proteicas individuais também podem ser aprisionadas em jangadas lipídicas14 e por interações proteína-proteína15,16. Dependendo dos domínios proteicos que se projetam da membrana para o meio extracelular ou citosol, a mobilidade da proteína pode variar de altamente móvel a completamente imóvel. No entanto, devido à complexidade da membrana e de suas estruturas periféricas, muitas vezes é difícil decifrar a interação entre a natureza da mobilidade lateral e a função proteica17.
As membranas DIB têm se mostrado uma plataforma eficiente para análises biofísicas de moléculas únicas de proteínas de membrana 18,19,20,21,22. São formados pela automontagem lipídica através do contato de gotículas aquosas com substratos suportados em hidrogel em fase lipídica/oleosa. À semelhança das bicamadas lipídicas suportadas (BCLs) comumente utilizadas1,23,24,25, as DIBs permitem sintonia local da mobilidade lateral pela ligação temporária ou permanente de proteínas à matriz polimérica quando funcionalizadas com ligantes adequados17. Este último pode servir como sistema modelo para processos bioquímicos em membranas celulares com distribuição heterogênea deproteínas10.
A abordagem experimental aqui descrita baseia-se na fluorescência de corantes sensíveis ao Ca 2+ para medir o fluxo do íon Ca 2+ através de canais individuais próximos à membrana 2,22 usando microscopia TIRF. Esta abordagem óptica limita a iluminação da amostra a uma distância próxima à membrana, o que, devido às propriedades físicas da luz de excitação evanescente, leva a uma redução significativa da fluorescência de fundo. Este último é um pré-requisito se alta resolução espacial e temporal for necessária para a detecção de moléculas únicas. Ao contrário dos métodos eletrofisiológicos clássicos26,27, não são necessárias tensões de membrana para estudar o fluxo iônico através de canais individuais. Além disso, o método não requer marcação com corantes fluorescentes ou moléculas que possam interferir com o movimento lateral dos canais na membrana.
O método é particularmente útil para estudar canais de proteínas embutidas na membrana no nível de uma única molécula sem usar eletrofisiologia clássica. Usando o canal condutor de proteínas mitocondriais TOM-CC de Neurospora crassa28,29,30 e OmpF, que suporta a difusão de pequenas moléculas hidrofílicas através da membrana externa de Escherichia coli17,31, ilustramos como as mobilidades da membrana e as atividades de canal das duas proteínas podem ser estudadas e correlacionadas. Sugerimos que esta abordagem, embora otimizada para TOM-CC e OmpF, pode ser prontamente aplicada a outros canais de proteína.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850356C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x Oil objective Apochromat N.A. 1.49</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRD01991</td>
			<td>TIRF microscope&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Hoffmann modulation contrast objective NA 0.25&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Microscope to assess DIB membrane formation&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x objective N.A. 0.25</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRL00102</td>
			<td>TIRF microscope&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40x Hoffmann modulation contrast objective NA 0.55</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Microscope to assess DIB membrane formation&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>488 nm laser, 100 mW&#160;&#160;</td>
			<td>Visitron</td>
			<td></td>
			<td>TIRF microscope&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive tape</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#196;kta pure&#160;&#160;</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td></td>
			<td>Protein purification system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford assay kit, Pierce</td>
			<td>Thermo Fisher&#160;</td>
			<td>23236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Roth</td>
			<td>5239.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chelax 100 resin</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>143-2832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>MC1024452500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis cassettes Slide-A-Lyzer 20 k MWCO</td>
			<td>Thermo Fisher&#160;</td>
			<td>87735</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DIB chamber&#160;</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
			<td>PMMA chamber for DIB membranes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital power meter and energy console</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PM100D</td>
			<td>Laser power meter&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Roth&#160;</td>
			<td>4720.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double distilled H2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse TS 100 Hoffmann modulation contrast microscope&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Microscope to assess DIB membrane formation&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Roth</td>
			<td>8042.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMCCD camera iXon Ultra 897</td>
			<td>Andor</td>
			<td></td>
			<td>TIRF microscope&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>32205-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixed angle rotor Ti70</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-8, CalciFluorTM</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>SC-362561</td>
			<td>Ca2+-sensitive dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>French press cell disruption homogenizer</td>
			<td>Igneus</td>
			<td>Igneus 40000 psi</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP filter</td>
			<td>AHF</td>
			<td></td>
			<td>Filter seeting used for excitation of DIB-membranes by epifluorescence with white light source&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>4878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips 40 mm x 24 mm x 0.13 mm</td>
			<td>Roth</td>
			<td>1870.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3783.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe 10 mL</td>
			<td>Roth</td>
			<td>X033.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe 100 mL</td>
			<td>Roth</td>
			<td>X049.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe 500 mL</td>
			<td>Roth</td>
			<td>EY49.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating block&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Thermomixer comfort</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating plate</td>
			<td>Minitube&#160;</td>
			<td>HT200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Roth&#160;</td>
			<td>9205.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexadcane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>296317</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>His Trap HP 1 mL</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>29051021</td>
			<td>Ni-NTA column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1.04716.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>10314243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KLM spin coater&#160;</td>
			<td>Schaefer Tec</td>
			<td>SCV-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>List medical L/M-3P-A vertical pipette puller</td>
			<td>Artisan Technology Group</td>
			<td>57761-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low melting point agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>A9414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M8 Stereomicroscope</td>
			<td>Wild</td>
			<td></td>
			<td>Stereomicrosope&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab&#160;</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>R2022a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroFil pipette tips</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MF34G-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 gas</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3957.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoliter 2010 injector&#160;</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>Nanoliter 2010&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-dodecyl-b-D-maltoside</td>
			<td>Glycon Biochemicals</td>
			<td>D97002-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA agarose, non-crosslinked</td>
			<td>Cube Biotech</td>
			<td>124115393</td>
			<td>Custom made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements AR software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MQS31100/MQS42560/MQS42580/MQS42780/MQS41930</td>
			<td>Imaging software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-octyl-polyoxyethylene</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>40530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O2 gas</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethylsulfonyl fluoride</td>
			<td>Roth&#160;</td>
			<td>6367.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photodiode sensor&#160; Si, 400 - 1100 nm, 500 mW</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>S130C</td>
			<td>Sensor for laser power meter&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner</td>
			<td>Diener Electronics</td>
			<td>Zepto</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Preparative ultracentrifuge Optima</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quad-band TIRF-filter 446/523/600/677 HC</td>
			<td>AHF</td>
			<td></td>
			<td>Filter setting used for excitation of DIB-membranes with 488 nm laser&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resource Q 1 mL</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>17117701</td>
			<td>Anion exchange column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon oil AR 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Roth</td>
			<td>2326.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super LoLux camera</td>
			<td>JVC</td>
			<td></td>
			<td>Stereomicrosope&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermoshaker</td>
			<td>Gerhardt</td>
			<td>THL 500/1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ti-E Fluorescence microscope&#160;&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MEA53100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9090.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Roth</td>
			<td>8952.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic bath&#160;</td>
			<td>Bandelin Sonorex</td>
			<td>RK 100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaccum pump</td>
			<td>Vacuubrand</td>
			<td>MD 4C NT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White light source for epifluorescence illumination (100 W)</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MBF72655</td>
			<td>TIRF microscope&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Roth</td>
			<td>2363.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-molecule imaging of lateral mobility and ion channel activity in lipid bilayers using total internal reflection fluorescence (tirf) microscopy

Técnicas de imagem de alta resolução têm mostrado que muitos canais iônicos não são estáticos, mas sujeitos a processos altamente dinâmicos, incluindo a associação transitória de subunidades auxiliares e formadoras de poros, difusão lateral e agrupamento com outras proteínas. No entanto, a relação entre difusão lateral e função é pouco compreendida. Para abordar este problema, descrevemos como a mobilidade lateral e a atividade de canais individuais em membranas lipídicas suportadas podem ser monitoradas e correlacionadas usando microscopia de fluorescência por reflexão interna total (TIRF). As membranas são fabricadas sobre um substrato hidrogel ultrafino usando a técnica de bicamada de interface de gotículas (DIB). Em comparação com outros tipos de membranas modelo, essas membranas têm a vantagem de serem mecanicamente robustas e adequadas para técnicas analíticas altamente sensíveis. Este protocolo mede o fluxo de íons Ca 2+ através de canais únicos, observando a emissão de fluorescência de um corante sensível ao Ca2+ em estreita proximidade com a membrana. Em contraste com as abordagens clássicas de rastreamento de molécula única, não são necessárias proteínas ou marcadores de fusão fluorescente, que podem interferir com o movimento lateral e a função na membrana. Possíveis alterações no fluxo iônico associadas a mudanças conformacionais da proteína são devidas apenas ao movimento lateral da proteína na membrana. Resultados representativos são mostrados usando o canal de translocação de proteínas mitocondriais TOM-CC e o canal bacteriano OmpF. Em contraste com OmpF, o fechamento do TOM-CC é muito sensível ao confinamento molecular e à natureza da difusão lateral. Assim, as bicamadas suportadas de interface gota-gota são uma ferramenta poderosa para caracterizar a ligação entre a difusão lateral e a função dos canais iônicos.

A gravação óptica de canal único sem eletrodos em tempo real revela a interação entre o movimento lateral da proteína e a função de canais iônicos individuais em membranas DIB. A reconstituição do complexo mitocondrial TOM core (Figura 1A) em uma membrana DIB (Figura 4D) ilustra uma forte correlação temporal entre mobilidade lateral e permeabilidade iônica (Figura 5A). O gating TOM-CC parece ser sensível ao modo de movimento lateral17. Canais móveis mostram fluxo de Ca2+ através de seus poros e altas intensidades de ponto de fluorescência. Moléculas aprisionadas e não móveis apresentam baixas e médias intensidades de fluorescência. Para o poro geral de importação de proteínas da mitocôndria TOM-CC, esta abordagem de molécula única revelou uma forte correlação temporal entre mobilidade lateral e permeabilidade iônica, sugerindo que o canal TOM-CC tem propriedades mecanossensíveis17. Uma parada lateral de moléculas de TOM-CC em movimento livre é acompanhada por um fechamento parcial ou completo do canal de TOM-CC. A aquisição de imagens das membranas DIB com OmpF (Figura 1E e Figura 4F), que está quase totalmente embutida na membrana, não mostra efeitos stop-and-go (Figura 5B). As paradas aleatórias da OmpF não estão associadas a uma mudança de intensidade e, portanto, ao fechamento de seus poros. Com base nos sinais de fluorescência38, a precisão posicional dos canais individuais pode ser estimada na faixa entre 5 e 10 nm. No entanto, deve-se notar que essa precisão não pode ser alcançada se os canais oscilarem ligeiramente devido à ancoragem móvel com o hidrogel de agarose, como mostrado, por exemplo, para as moléculas TOM-CC em um estado intermediário com um deslocamento médio da raiz de 120 nm (Figura 5A).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64970/64970fig01.jpg"> Figura 1: Isolamento do TOM-CC. (A) Estrutura Cryo EM de N. crassa TOM-CC30,39. Mitocôndrias de uma cepa de N. crassa contendo Tom22 com tag 6xHis foram solubilizadas em DDM e submetidas à cromatografia de afinidade Ni-NTA (B) e cromatografia de troca iônica (C). (D) SDS-PAGE do TOM-CC isolado. (E) Estrutura cristalina (PDB, 1OPF) e (F) SDS-PAGE de E. coli OmpF purificada. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64970/64970fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64970/64970fig02.jpg"> Figura 2: Fluxograma de montagem da câmara de PMMA. Passo 1: Uma tampa de vidro é revestida com um hidrogel de agarose. Passo 2: A tampa revestida por spin é montada em uma câmara de microscopia de PMMA feita sob medida. Passo 3: Agarose adicional de baixo derretimento é adicionada à porta de entrada da câmara de PMMA em uma placa quente de 35 °C. Passo 4: As monocamadas lipídicas são formadas em torno de gotículas aquosas em uma interface tampão/óleo (esquerda) e na interface hidrogel/óleo de agarose (direita). Passo 5: Gotículas aquosas individuais são pipetadas nos poços da câmara de PMMA para formar uma bicamada lipídica ao entrar em contato com as duas monocamadas lipídicas. Passo 6: A formação das membranas DIB é validada pela microscopia de contraste modulada de Hofmann. Passo 7: Imagens de áreas selecionadas das membranas DIB com canais iônicos inseridos são adquiridas por microscopia TIRF. Verde: 0,75% agarose; amarelo: 2,5% de agarose contendo íons Ca2+ ; magenta: fase lipídica/oleosa; azul escuro: tampão aquoso de gotículas contendo corante e proteína sensíveis ao Ca2+. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64970/64970fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64970/64970fig03.jpg"> Figura 3: Montagem experimental. (A) Representação esquemática de uma membrana DIB em um poço de PMMA. A bicamada repousa sobre um filme ultrafino de agarose a 0,75% para permitir a obtenção de imagens TIRF do fluxo de Ca 2+ através de um canal iônico ao longo do tempo usando um corante de fluorescência sensível ao Ca 2+ (Fluo-8) em trans. (B) O fluxo de Ca2+ é controlado exclusivamente pela pressão osmótica de cis para trans. Isso permite tanto a determinação da posição na membrana quanto do estado aberto-fechado do canal. O canal mostrado aqui é o canal condutor de proteínas TOM-CC da mitocôndria de N. crassa 30. (C) Trajetória de um único canal TOM-CC. Verde: canal móvel; amarelo: canal não móvel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64970/64970fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64970/64970fig04.jpg"> Figura 4: Imagem TOM-CC e OmpF em membranas DIB. (A) Membrana DIB fotografada por microscopia de contraste modulada de Hoffmann mostrando a área de contato bicamada entre o hidrogel e a gota. (B) Membrana DIB quebrada como em (A). Seta, borda da câmara de PMMA. (C) Membrana DIB imageada por microscopia TIRF sem canais proteicos. (D) Membrana DIB com TOM-CC reconstituída, imageada por microscopia TIRF. Os quadrados brancos marcam pontos de alta (SH), intermediária (SI) e baixa (SL) intensidade. (E) O ajuste do perfil de intensidade de fluorescência dos três pontos marcados em (A) às funções gaussianas bidimensionais revela a posição dos TOM-CCs individuais e o fluxo de Ca2+ através do canal. (F) Membrana DIB com OmpF reconstituído. (G) Encaixe gaussiano da mancha fluorescente marcada em (F). Em contraste com o complexo proteico de β barris de dois poros TOM-CC, o OmpF de β de três poros revela apenas um estado de permeabilidade. Tamanho do pixel, 0,16 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64970/64970fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64970/64970fig05.jpg"> Figura 5: A atividade do canal correlaciona-se com a mobilidade lateral do TOM-CC. (A) O traçado de amplitude fluorescente (superior) e o trajeto correspondente (inferior) do TOM-CC indicam que a atividade do canal aberto-fechado do TOM-CC correlaciona-se com a mobilidade da membrana lateral do complexo. A trajetória apresenta três estados de permeabilidade. Verde: estado totalmente aberto; amarelo: estado intermediário de permeabilidade; vermelho: estado do canal fechado; estrela vermelha: TOM-CC no estado intermediário oscila em torno de sua posição média em cerca de ±60 nm. As precisões posicionais37 baseadas nos sinais de fluorescência nos estados totalmente aberto e intermediário variam entre 5 nm e 10 nm. (B) Traçado de amplitude fluorescente (superior) e trajetória correspondente (inferior) de OmpF. OmpF revela apenas um nível de intensidade, independentemente de estar em movimento ou preso. Os segmentos de trajetória correspondentes aos períodos de tempo das moléculas aprisionadas são marcados em cinza. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64970/64970fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Buffer </td>
			<td colspan="3">Concentrações de reagentes</td>
			<td>Volume</td>
		</tr><tr><td>A1*</td>
			<td colspan="3">Tris-HCl 20 mM pH 8,5, 0,1 % (p/v) n-dodecil-β-D-maltosídeo (DDM), 10% (v/v) glicerol, NaCl 300 mM e fluoreto de fenilmetilsulfonila (PMSF) 1 mM</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr><tr><td>A2*</td>
			<td colspan="3">Tris-HCl 20 mM pH 8,5, DDM 0,1% (p/v), glicerol 10% (v/v), imidazol 1 M e PMSF 1 mM</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr><tr><td>B1*</td>
			<td colspan="3">20 mM HEPES pH 7,2, 0,1% (p/v) DDM, 2% (v/v) dimetilsulfóxido (DMSO)</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr><tr><td>B2*</td>
			<td colspan="3">20 mM HEPES pH 7,2, 0,1% (p/v) DDM, 1 M KCl, 2% (v/v) dimetilsulfóxido (DMSO)</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr><tr><td colspan="5">* Desgaseifique e passe por um filtro de 0,22 μm antes de usar.</td>
		</tr></tbody></table>Tabela 1: Soluções tampão para isolamento TOM-CC.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Buffer </td>
			<td colspan="3">Concentrações de reagentes</td>
			<td>Volume</td>
		</tr><tr><td>LB*</td>
			<td colspan="3">1% (p/v) de triptona, 1% (p/v) de NaCl e 0,5% (p/v) de extrato de levedura</td>
			<td>1100 mL</td>
		</tr><tr><td>C1</td>
			<td colspan="3">2 mM MgCl2, e ~750 unidades DNAse e 50 mM Tris-HCl pH 7,5</td>
			<td>20 mL</td>
		</tr><tr><td>C2</td>
			<td colspan="3">50 mM Tris-HCl, pH 7,5</td>
			<td>50 mL</td>
		</tr><tr><td>C3</td>
			<td colspan="3">4% (p/v) de dodecil sulfato de sódio (SDS), 2 mM β-mercaptoetanol e 50 mM Tris-HCl pH 7,5</td>
			<td>50 mL</td>
		</tr><tr><td>C4</td>
			<td colspan="3">SDS 2% (p/v), NaCl 500 mM e Tris-HCl 50 mM pH 7,5</td>
			<td>50 mL</td>
		</tr><tr><td>C5</td>
			<td colspan="3">0,5% (p/v) de octil polioxietileno (octil POE), 1 mM EDTA e 20 mM Tris pH 8,5</td>
			<td>1000 mL</td>
		</tr><tr><td colspan="5">* Esterilizar antes de usar.</td>
		</tr></tbody></table>Tabela 2: Soluções tampão para isolamento de OmpF.

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Single-Molecule Imaging of Lateral Mobility and Ion Channel Activity in Lipid Bilayers using Total Internal Reflection Fluorescence TIRF Microscopy Video (Video) | JoVE

Este protocolo descreve como usar a microscopia TIRF para rastrear canais iônicos individuais e determinar sua atividade em membranas lipídicas suportadas, definindo assim a interação entre o movimento da membrana lateral e a função do canal. Ele descreve como preparar as membranas, registrar os dados e analisar os resultados.

Imagem de molécula única da mobilidade lateral e atividade do canal iônico em bicamadas lipídicas usando microscopia de fluorescência por reflexão interna total (TIRF)

High-resolution imaging techniques have shown that many ion channels are not static, but subject to highly dynamic processes, including the transient ...

Os canais iônicos não são estáticos nas membranas biológicas. Aqui apresentamos uma abordagem óptica de molécula única para desvendar a ligação entre a difusão da membrana lateral e a função do canal iônico. A principal vantagem desta técnica sobre outros métodos é que a marcação fluorescente de proteínas que possam interferir com seu movimento lateral e função não é necessária.O método pode ser aplicado a qualquer canal de proteína de membrana onde a difusão livre ou restrita é importante para a organização e função. Para começar, transfira 380 microlitros da solução estoque de DPhPC para um frasco de vidro e sobreponha a solução de estoque lipídico com argônio ou gás nitrogênio para evitar a oxidação lipídica. Use o menor fluxo de gás possível para evitar a evaporação do solvente orgânico no qual os lipídios são dissolvidos ou respingos dos sprays de solvente do frasco para injetáveis.Secar a amostra lipídica sob uma corrente de nitrogênio e remover o solvente orgânico restante da amostra lipídica sob vácuo usando uma bomba de vácuo isenta de óleo durante a noite. Dissolva o filme lipídico em uma solução de óleo de silicone hexadecano adicionando volumes iguais de hexadecano e óleo de silicone usando uma pipeta de um mililitro para uma concentração lipídica final de 9,5 miligramas por mililitro. Coloque algumas tampas de vidro em um suporte de deslizamento de aço inoxidável e limpe-as em um copo de vidro por cerca de 10 minutos com acetona em um limpador ultrassônico.Enxágue as lamínulas com água duplamente deionizada e seque-as sob uma corrente de nitrogênio. Além disso, limpe e hidrofilize uma tampa em um limpador de plasma com oxigênio por cinco minutos. Monte uma lamínula tratada com plasma em um revestidor de spin e cubra a lamínula com uma película de agarose de espessura sub-micrômetro adicionando lentamente 140 microlitros de agarose aquecida 0,75% de baixa fusão com uma pipeta de 200 microlitros a 3.000 RPM por 30 segundos.Fixe imediatamente a lamínula revestida por spin com a fina camada do hidrogel de agarose à parte inferior da câmara de PMMA. Certifique-se de que o hidrogel de agarose aponta para cima. Fixe as bordas da tampa no dispositivo microusinado de PMMA com fita adesiva transparente e coloque o dispositivo em uma placa quente aquecida a 35 graus Celsius.Despeje cuidadosamente 200 microlitros de solução de agarose a 2,5% na entrada da câmara sem criar bolhas de ar. Cobrir imediatamente os poços da câmara de PMMA com cerca de 60 microlitros da solução de óleo lipídico para iniciar a formação de monocamada lipídica na interface óleo de agarose para evitar a desidratação da agarose revestida por spin nos poços da câmara de PMMA. Coloque o dispositivo em uma placa quente a 35 graus Celsius por cerca de duas horas.Coloque cerca de 20 microlitros de solução de óleo de silicone hexadecano lipídico em cada um dos vários poços microfabricados em uma câmara de incubação de gotículas. Prepare uma agulha de vidro microcapilar com um diâmetro de abertura da ponta de cerca de 20 micrômetros usando um puxador de micropipeta vertical ou horizontal. Encher a agulha com cerca de cinco microlitros de solução aquosa de injeção contendo 8,8 milimolares de HEPES, sete micromolares de um corante fluorescente, Fluo-8, 400 EDTA micromolares, cloreto de potássio 1,32 molar e complexo de núcleo TOM nanomolar 30 ou, alternativamente, 20 OMPF nanomolares.Monte a agulha com a solução de injeção aquosa em um nanoinjetor piezo-acionado e injete 100 a 200 nanolitros de gotículas aquosas nos poços na câmara de incubação de gotículas preenchida com solução de óleo de silicone hexadecano lipídico usando o nanoinjetor. Permitir a formação de uma monocamada lipídica na interface óleo de gotícula por cerca de duas horas, mantendo as câmaras de incubação de PMMA e gotículas em uma placa quente aquecida a 35 graus Celsius. Transfira manualmente gotículas aquosas individuais dos poços da câmara de incubação de gotículas para os poços da câmara de PMMA usando uma pipeta de microlitro de canal único com uma ponta de polipropileno descartável de 10 microlitros.Deixe as gotículas afundarem nas monocamadas lipídicas nas interfaces hidrogel-óleo para formar uma bicamada lipídica entre as gotículas e o hidrogel de agarose. Monte a câmara de PMMA com as membranas de bicamada ou DIB de interface de gotículas no porta-amostra de um microscópio de luz invertida e avalie a formação da membrana usando uma objetiva de contraste de modulação Hoffman de 10x. Se as membranas DIB se formaram, monte a câmara de PMMA no porta-amostras de um microscópio TIRF equipado com uma fonte de luz convencional para iluminação de epifluorescência, um laser de 488 nanômetros e uma câmera CCD multiplicadora de elétrons retroiluminados para atingir um tamanho de pixel de cerca de 0,16 micrômetros.Focalize a borda de uma membrana DIB com uma objetiva de aumento de 10x sob iluminação de epifluorescência com uma fonte de luz de alta intensidade usando um conjunto de filtros GFP. Focalize fino a mesma borda da membrana DIB em alta magnificação com uma objetiva TIRF de óleo apocromático 100x NA 1,49, novamente sob iluminação de epifluorescência com uma fonte de luz de alta intensidade usando um conjunto de filtros GFP. Altere a configuração do filtro de GFP para o conjunto de filtros TIRF quad band, ligue o laser de 488 nanômetros e defina a intensidade do laser na lente objetiva.Para visualizar canais de íons únicos, ajuste o ângulo TIRF e o ganho da câmera EM CCD para que os canais de íons abertos na membrana DIB apareçam como pontos fluorescentes de alto contraste em um fundo escuro, e a relação sinal/fundo atinja um máximo. Certifique-se de que os pontos correspondentes ao fluxo de íons cálcio através de canais iônicos únicos permaneçam em foco e tenham uma forma redonda com alta intensidade no centro e diminuindo gradualmente em direção à periferia. Verifique se os pontos fluorescentes estão em foco para garantir que os canais iônicos se reconstituíram nas membranas DIB e estão se movendo lateralmente no plano da membrana.Finalmente, registre uma série de imagens de membrana que permitam o rastreamento adequado da posição e o monitoramento do estado aberto-fechado dos canais iônicos individuais. Para determinar o tipo de mobilidade lateral e o estado de atividade do canal, adquira trajetórias suficientemente longas e bem amostradas. A estrutura Cryo EM de Neurospora crassa TOM-CC é mostrada aqui.Mitocôndrias de uma coloração de N.crassa contendo um TOM 22 com um tag de 6-His foram solubilizadas em DDM e submetidas à cromatografia de afinidade por níquel NTA e cromatografia de troca aniônica. SDS-PAGE da estrutura cristalina isolada de TOM-CC e SDS-PAGE de E.coli OMPF purificada usados para comparação são mostrados aqui. O traço de amplitude fluorescente na trajetória correspondente do TOM-CC indica que a atividade do canal aberto-fechado do TOM-CC correlaciona-se com a mobilidade da membrana lateral do complexo.O traço de amplitude exibe três estados de permeabilidade: estado totalmente aberto correspondente a canais móveis, estado de permeabilidade intermediário e estado de canal fechado correspondente a canais não móveis. O TOM-CC no estado intermediário oscila em torno de sua posição média em cerca de 60 nanômetros mais/menos. O traço de amplitude fluorescente na trajetória correspondente do OMPF é mostrado aqui.O OMPF revela apenas um nível de intensidade em comparação ao TOM-CC, independentemente de estar em movimento ou preso. Os segmentos de trajetória correspondentes aos períodos de tempo das moléculas aprisionadas são marcados em cinza. Uma coisa importante a notar é que este método analisa proteínas de membrana única em um ambiente de membrana intacta.A dinâmica das proteínas de membrana continuará a ser um horizonte para estudos científicos num futuro próximo. Esperamos que nosso método contribua significativamente para este campo.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Single-Molecule Imaging of Lateral Mobility and Ion Channel Activity in Lipid Bilayers using Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopy

Detergent-free Ultrafast Reconstitution of Membrane Proteins into Lipid Bilayers Using Fusogenic Complementary-charged Proteoliposomes.

Detergent-free Ultrafast Reconstitution of Membrane Proteins into Lipid Bilayers Using Fusogenic Complementary-charged Proteoliposomes. Video (Video) | JoVE

Livre de detergente ultra reconstituição das proteínas de membrana em lípidos Bilayers usando Fusogenic Proteoliposomes complementares carregada.

Detergents are indispensable for delivery of membrane proteins into 30-100 nm small unilamellar vesicles, while more complex, larger model lipid bilayers ...

Bioquímica

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers Video (Video) | JoVE

In Vitro Reconstituição de auto-organização padrões de proteína na Bilayers do Lipid suportados

Many aspects of the fundamental spatiotemporal organization of cells are governed by reaction-diffusion type systems. In vitro reconstitution of such ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator Video (Video) | JoVE

Microgravimetry dissipativo para estudar a dinâmica da vinculação do fosfolipídeo proteína anexina A2 para Bilayers do Lipid com suporte sólido usando um ressonador de quartzo

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy

Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy Video (Video) | JoVE

Expressão e purificação de TRPC3 os humanos sensíveis lipídico cação canal para determinação estrutural por microscopia de Single-particle Cryo-elétron

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium ...

Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules

Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules Video (Video) | JoVE

Microscopia de seguimento da único-molécula-uma ferramenta para determinar os Estados diffusive de moléculas cytosolic

Single-molecule localization microscopy probes the position and motions of individual molecules in living cells with tens of nanometer spatial and ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation Video (Video) | JoVE

Produção de conjuntos de motor de dynein e de Kinesin em nanostructures do ADN origami para a única observação da molécula

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

High-Throughput Total Internal Reflection Fluorescence and Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy Using a Photonic Chip

High-Throughput Total Internal Reflection Fluorescence and Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy Using a Photonic Chip Video (Video) | JoVE

Fluorescência de reflexão interna total de alta taxa de transferência e microscopia de reconstrução óptica estocástica direta usando um chip fotônico

Total internal reflection fluorescence (TIRF) is commonly used in single molecule localization based super-resolution microscopy as it gives enhanced ...

Conventional BODIPY Conjugates for Live-Cell Super-Resolution Microscopy and Single-Molecule Tracking

Conventional BODIPY Conjugates for Live-Cell Super-Resolution Microscopy and Single-Molecule Tracking Video (Video) | JoVE

Conjugados BODIPY convencionais para microscopia de super-resolução de células vivas e rastreamento de moléculas únicas

Single molecule localization microscopy (SMLM) techniques overcome the optical diffraction limit of conventional fluorescence microscopy and can resolve ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH Video (Video) | JoVE

Análise celular única de alelos ativos transcricionralmente por peixe de molécula única

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

Single Molecule Fluorescence Energy Transfer Study of Ribosome Protein Synthesis

Single Molecule Fluorescence Energy Transfer Study of Ribosome Protein Synthesis Video (Video) | JoVE

Estudo de transferência de energia de fluorescência única da síntese de proteína ribossa

The ribosome is a large ribonucleoprotein complex that assembles proteins processively along mRNA templates. The diameter of the ribosome is approximately ...