Name: single-molecule imaging of lateral mobility and ion channel activity in lipid bilayers using total internal reflection fluorescence (tirf) microscopy
Uploaded: 2023-02-17T14:40:00
Duration: 8 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-Molecule Imaging of Lateral Mobility and Ion Channel Activity in Lipid Bilayers using Total Internal Reflection Fluorescence TIRF Microscopy Video at J

Vi tackar Beate Nitschke för hennes hjälp med proteinberedning och Robin Ghosh, Michael Schweikert (Stuttgart) och Maximilan Ulbrich (Freiburg) för insiktsfulla diskussioner. Detta arbete stöddes av Stuttgart Research Center Systems Biology (SRCSB) och ett bidrag från Baden Württemberg Foundation (BiofMO-6 till SN).

Vi deklarerar inga intressekonflikter.

Protokollet som presenteras här ger en introduktion till användningen av DIB-membran för att studera samspelet mellan lateral jonkanalrörelse och kanalfunktion med hjälp av enmolekylär TIRF-mikroskopi. För att få bästa möjliga data är beredningen av stabila DIB-membran med så många välseparerade kanaler som möjligt avgörande för att erhålla tidsserier av enskilda partiklar, som kan analyseras på ett tillfredsställande sätt.
Kritiska parametrar som ska optimeras inkluderar valet av lipid, lipidkoncentrationen i oljefasen och protein- och tvättmedelskoncentrationerna i vattenhaltiga droppar. De lipider som används är ovanliga eftersom de inte visar någon tydlig fasövergång vid låga temperaturer. DPhPC är en vanlig lipid för att producera stabila membransystem40. I princip kan vilken lipid som helst som bibehåller sin vätskemiljö vid låga temperaturer vara lämplig för denna applikation. Dessutom bör lipiden inte vara känslig för oxidation. Tvättmedelskoncentrationen i dropparna bör vara så låg som möjligt för att undvika membranbrott. Stabila membran och goda proteininblandningshastigheter uppnås i allmänhet med tvättmedelskoncentrationer under den kritiska micellkoncentrationen (cmc), förutsatt att membranproteinet inte fälls ut.
Om DIB-membranen inte tål specifika tvättmedel21,41, eller om proteinerna inte integreras från låg tvättmedelslösning i DIB-membranen, kan proteinkanalerna först rekonstitueras till små unilamellär lipidvesiklar (SUV), som sedan smälts samman med DIB-membranen från droppsidan, vilket framgångsrikt har visats för E. coli MscL 42 . Ibland bildas inte DIB-membran eftersom lipidkoncentrationen i oljefasen är för låg. För att förhindra att DIB-membran spricker bör man också vara medveten om att det osmotiska trycket mellan hydrogelen och droppen måste balanseras exakt utan att påverka Ca2+-flödet från cis till trans för mycket. Optimerad agarostjocklek och maskstorlek verkar vara avgörande för att observera diffusionen av membranproteiner. Eventuell torkning av agarosskiktet bör undvikas. Tjockleken kan bestämmas med hjälp av atomkraftmikroskopi17. Genom att variera agaroskoncentrationen, volymen och rotationshastigheten under spinnbeläggning kan hydrogelens maskstorlek och tjocklek optimeras. Observera dock att hydrogelskiktets tjocklek påverkar bildkontrasten. För att fånga membranproteiner i DIB kan agaroshydrogelen ersättas med specialsyntetiserad, icke-tvärbunden, Ni-NTA-modifierad, lågsmältande agaros för att fånga dem via en His-tag17. En alltför hög fluorescensbakgrund orsakas ofta av bristning av DIB-membranen. Detta är särskilt ett problem med flerbrunnskammare, eftersom det Ca2+-känsliga färgämnet diffunderar in i hydrogelen. I detta fall bör intilliggande brunnar undvikas. Fluorescensblekning av det Ca2+-känsliga färgämnet ovanför membranet bör inte vara en signifikant begränsande faktor, eftersom den utbyts av oexciterade färgämnen i huvuddelen av droppen (figur 3A) utanför TIRF-evanescentfältet. Lokaliseringsprecisionen för proteinet ges av noggrannheten att passa fläckarna och pixelstorleken.
Svaga fluorescenssignaler kan orsakas av lågt Ca2+-flöde genom kanalen. Möjliga orsaker inkluderar: (i) felaktiga TIRF-inställningar (t.ex. laserintensitet), (ii) det osmotiska Ca 2+ trycket över membranet, eller (iii) kanalernas inneboende Ca2+-permeabilitet är för låg. För att klara det första problemet måste laserintensitet, TIRF-vinkel och kameraförstärkning optimeras. De två senare problemen kan övervinnas genom applicering av en elektrisk potential över membranet 2,43. Tillämpningen av externa spänningar kan dock snedvrida resultatet, eftersom elektriska effekter kan påverka kanalöppningen av ligandstyrda eller mekanokänsliga jonkanaler som faktiskt inte är spänningsstyrda. Exempel på sådana kanaler är mitokondriella proteintranslokasen TOM-CC27 och dess kanalbildande underenhet Tom40 26,44,45,46. Slutligen bör det noteras att det är svårt att införa membranproteiner i DIB-membran i en specifik orientering för att uppnå önskad funktionalitet, och kvantitativa studier är sällsynta47,48. I vissa fall är orienteringen av de integrerade proteinerna slumpmässig. Detta är ett allvarligt problem för att studera membranproteiner, eftersom vissa membranproteiner aktiveras på endast ena sidan av membranet.
TIRF-mikroskopi är en kraftfull metod för att hantera enmolekylära händelser i plana stödda membran49. Exempel inkluderar montering och vikningsvägsbelysning av kanalproteiner såsom α-hemolysin50, perfringolysin O 51 och OmpG52. Dessa studier inkluderade FRET som en ytterligare teknik. Dessutom har aktivering av den mekanokänsliga jonkanalen MscL tidigare studerats genom mekanisk stimulering av stödda DIB-bilager42 med hjälp av strömmätningar. Baserat på detta arbete kan framtida studier kombinera plattformen som beskrivs här med FRET-experiment med en molekyl för att adressera mekanokänsliga kanaler på enmolekylnivå på ett optiskt sätt17. Injektion av buffert i droppen, sträckning av det inre DIB-monolagret eller riktad bindning av enskilda kanaler till den underliggande hydrogelen kan användas för att ytterligare studera inte bara den fysiska mekanismen för mekaniskt aktiverade kanaler, som svarar på membranspänning och / eller krökning som visas för MscL och MscS, tvåpordomänen K + -kanaler, TREK-1, TREK-2, och TRAAK, och PIEZO (för granskning, se53), men också lokal bindning till det cellulära cytoskelettet, som visas för den beröringskänsliga jonkanalen NOMPC54,55.

Detta protokoll syftar till att beskriva hur man studerar korrelationen mellan membranmobilitet och jonkanalpermeabilitet hos membran i polymerstödda droppgränssnitt dubbelskikt (DIB) membran 1,2,3.
Den nuvarande tekniken kompletterar en imponerande uppsättning avancerade optiska och ytanalytiska verktyg, såsom enkelpartikelspårning 4,5, fluorescenskorrelationsspektroskopi 6,7 och höghastighetsatomkraftmikroskopi 8,9,10. Dessa ger värdefulla insikter i den dynamiska sammansättningen och strukturen hos membran som påverkar membranbaserade reaktioner11,12,13. Medan rörelsen och lateral diffusion av proteiner beror på den lokala densiteten hos proteiner i membranet, kan enskilda proteinmolekyler också fångas i lipidflottar14 och genom protein-proteininteraktioner15,16. Beroende på proteindomänerna som sticker ut från membranet till den extracellulära miljön eller cytosolen kan proteinmobiliteten variera från mycket mobil till helt orörlig. På grund av membranets komplexitet och dess perifera strukturer är det emellertid ofta svårt att dechiffrera samspelet mellan den laterala rörlighetens natur och proteinfunktionen17.
DIB-membran har visat sig vara en effektiv plattform för biofysiska enmolekylära analyser av membranproteiner 18,19,20,21,22. De bildas genom lipid självmontering genom kontakt av vattenhaltiga droppar med hydrogelstödda substrat i en lipid / oljefas. I likhet med de vanliga stödda lipidbiskikten (SLB)1,23,24,25 tillåter DIB lokal inställning av den laterala rörligheten genom tillfällig eller permanent bindning av proteiner till polymermatrisen när de funktionaliseras med lämpliga ligander 17. Den senare kan fungera som ett modellsystem för biokemiska processer i cellmembran med en heterogen proteinfördelning10.
Den experimentella metoden som beskrivs här bygger på fluorescensen hos Ca 2+-känsliga färgämnen för att mätaCa2+-jonflödet genom enskilda kanaler i närheten av membranet 2,22 med hjälp av TIRF-mikroskopi. Detta optiska tillvägagångssätt begränsar belysningen av provet till ett avstånd nära membranet, vilket på grund av de fysikaliska egenskaperna hos det flyktiga excitationsljuset leder till en signifikant minskning av fluorescensbakgrunden. Det senare är en förutsättning om hög rumslig och tidsmässig upplösning krävs för detektion av enskilda molekyler. Till skillnad från klassiska elektrofysiologiska metoder26,27 krävs inga membranspänningar för att studera jonflöde genom enskilda kanaler. Vidare kräver metoden inte märkning med fluorescerande färgämnen eller molekyler som kan störa kanalernas laterala rörelse i membranet.
Metoden är särskilt användbar för att studera proteinkanaler inbäddade i membranet på enmolekylnivå utan att använda klassisk elektrofysiologi. Med hjälp av mitokondriell proteinledande kanal TOM-CC från Neurospora crassa28,29,30 och OmpF, som stödjer diffusionen av små hydrofila molekyler över det yttre membranet hos Escherichia coli17,31, illustrerar vi hur membranmobiliteter och kanalaktiviteter hos de två proteinerna kan studeras och korreleras. Vi föreslår att detta tillvägagångssätt, även om det är optimerat för TOM-CC och OmpF, lätt kan tillämpas på andra proteinkanaler.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850356C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x Oil objective Apochromat N.A. 1.49</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRD01991</td>
			<td>TIRF microscope&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Hoffmann modulation contrast objective NA 0.25&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Microscope to assess DIB membrane formation&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x objective N.A. 0.25</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRL00102</td>
			<td>TIRF microscope&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40x Hoffmann modulation contrast objective NA 0.55</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Microscope to assess DIB membrane formation&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>488 nm laser, 100 mW&#160;&#160;</td>
			<td>Visitron</td>
			<td></td>
			<td>TIRF microscope&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive tape</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#196;kta pure&#160;&#160;</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td></td>
			<td>Protein purification system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford assay kit, Pierce</td>
			<td>Thermo Fisher&#160;</td>
			<td>23236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Roth</td>
			<td>5239.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chelax 100 resin</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>143-2832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>MC1024452500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis cassettes Slide-A-Lyzer 20 k MWCO</td>
			<td>Thermo Fisher&#160;</td>
			<td>87735</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DIB chamber&#160;</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
			<td>PMMA chamber for DIB membranes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital power meter and energy console</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PM100D</td>
			<td>Laser power meter&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Roth&#160;</td>
			<td>4720.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double distilled H2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse TS 100 Hoffmann modulation contrast microscope&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Microscope to assess DIB membrane formation&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Roth</td>
			<td>8042.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMCCD camera iXon Ultra 897</td>
			<td>Andor</td>
			<td></td>
			<td>TIRF microscope&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>32205-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixed angle rotor Ti70</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-8, CalciFluorTM</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>SC-362561</td>
			<td>Ca2+-sensitive dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>French press cell disruption homogenizer</td>
			<td>Igneus</td>
			<td>Igneus 40000 psi</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP filter</td>
			<td>AHF</td>
			<td></td>
			<td>Filter seeting used for excitation of DIB-membranes by epifluorescence with white light source&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>4878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips 40 mm x 24 mm x 0.13 mm</td>
			<td>Roth</td>
			<td>1870.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3783.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe 10 mL</td>
			<td>Roth</td>
			<td>X033.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe 100 mL</td>
			<td>Roth</td>
			<td>X049.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe 500 mL</td>
			<td>Roth</td>
			<td>EY49.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating block&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Thermomixer comfort</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating plate</td>
			<td>Minitube&#160;</td>
			<td>HT200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Roth&#160;</td>
			<td>9205.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexadcane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>296317</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>His Trap HP 1 mL</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>29051021</td>
			<td>Ni-NTA column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1.04716.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>10314243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KLM spin coater&#160;</td>
			<td>Schaefer Tec</td>
			<td>SCV-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>List medical L/M-3P-A vertical pipette puller</td>
			<td>Artisan Technology Group</td>
			<td>57761-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low melting point agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>A9414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M8 Stereomicroscope</td>
			<td>Wild</td>
			<td></td>
			<td>Stereomicrosope&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab&#160;</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>R2022a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroFil pipette tips</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MF34G-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 gas</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3957.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoliter 2010 injector&#160;</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>Nanoliter 2010&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-dodecyl-b-D-maltoside</td>
			<td>Glycon Biochemicals</td>
			<td>D97002-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA agarose, non-crosslinked</td>
			<td>Cube Biotech</td>
			<td>124115393</td>
			<td>Custom made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements AR software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MQS31100/MQS42560/MQS42580/MQS42780/MQS41930</td>
			<td>Imaging software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-octyl-polyoxyethylene</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>40530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O2 gas</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethylsulfonyl fluoride</td>
			<td>Roth&#160;</td>
			<td>6367.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photodiode sensor&#160; Si, 400 - 1100 nm, 500 mW</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>S130C</td>
			<td>Sensor for laser power meter&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner</td>
			<td>Diener Electronics</td>
			<td>Zepto</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Preparative ultracentrifuge Optima</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quad-band TIRF-filter 446/523/600/677 HC</td>
			<td>AHF</td>
			<td></td>
			<td>Filter setting used for excitation of DIB-membranes with 488 nm laser&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resource Q 1 mL</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>17117701</td>
			<td>Anion exchange column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon oil AR 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Roth</td>
			<td>2326.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super LoLux camera</td>
			<td>JVC</td>
			<td></td>
			<td>Stereomicrosope&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermoshaker</td>
			<td>Gerhardt</td>
			<td>THL 500/1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ti-E Fluorescence microscope&#160;&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MEA53100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9090.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Roth</td>
			<td>8952.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic bath&#160;</td>
			<td>Bandelin Sonorex</td>
			<td>RK 100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaccum pump</td>
			<td>Vacuubrand</td>
			<td>MD 4C NT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White light source for epifluorescence illumination (100 W)</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MBF72655</td>
			<td>TIRF microscope&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Roth</td>
			<td>2363.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-molecule imaging of lateral mobility and ion channel activity in lipid bilayers using total internal reflection fluorescence (tirf) microscopy

Högupplösta avbildningstekniker har visat att många jonkanaler inte är statiska utan föremål för mycket dynamiska processer, inklusive den övergående föreningen av porbildande och hjälpunderenheter, lateral diffusion och klustring med andra proteiner. Förhållandet mellan lateral diffusion och funktion är dock dåligt förstått. För att närma sig detta problem beskriver vi hur lateral rörlighet och aktivitet hos enskilda kanaler i stödda lipidmembran kan övervakas och korreleras med hjälp av total intern reflektionsfluorescens (TIRF) mikroskopi. Membran tillverkas på ett ultratunt hydrogelsubstrat med hjälp av droppgränssnitt dubbelskikt (DIB) teknik. Jämfört med andra typer av modellmembran har dessa membran fördelen att de är mekaniskt robusta och lämpliga för mycket känsliga analystekniker. Detta protokoll mäter Ca 2+ jonflöde genom enstaka kanaler genom att observera fluorescensemissionen av ett Ca2+-känsligt färgämne i närheten av membranet. Till skillnad från klassiska enkelmolekylära spårningsmetoder krävs inga fluorescerande fusionsproteiner eller etiketter som kan störa lateral rörelse och funktion i membranet. Möjliga förändringar i jonflöde i samband med konformationsförändringar av proteinet beror endast på proteinets laterala rörelse i membranet. Representativa resultat visas med användning av mitokondriell proteintranslokationskanal TOM-CC och bakteriekanalen OmpF. I motsats till OmpF är grinden av TOM-CC mycket känslig för molekylär inneslutning och typen av lateral diffusion. Därför är stödda dubbellager med droppgränssnitt ett kraftfullt verktyg för att karakterisera länken mellan lateral diffusion och jonkanalernas funktion.

Elektrodfri optisk enkanalsinspelning i realtid avslöjar samspelet mellan lateral proteinrörelse och funktionen hos enskilda jonkanaler i DIB-membran. Rekonstituering av det mitokondriella TOM-kärnkomplexet (figur 1A) till ett DIB-membran (figur 4D) illustrerar en stark tidsmässig korrelation mellan lateral rörlighet och jonpermeabilitet (figur 5A). TOM-CC-grinden verkar vara känslig för läget för lateral rörelse17. Rörliga kanaler visar Ca2+ flöde genom sina porer och höga fluorescenspunktintensiteter. Fångade, icke-rörliga molekyler visar låga och medelstora fluorescensintensiteter. För den allmänna proteinimportporen i mitokondrierna TOM-CC avslöjade denna enda molekylmetod en stark tidsmässig korrelation mellan lateral rörlighet och jonpermeabilitet, vilket tyder på att TOM-CC-kanalen har mekanokänsliga egenskaper17. Ett lateralt stopp av fritt rörliga TOM-CC-molekyler åtföljs av en partiell eller fullständig stängning av TOM-CC-kanalen. Avbildning av DIB-membran med OmpF (figur 1E och figur 4F), som är nästan helt inbäddade i membranet, visar inga stop-and-go-effekter (figur 5B). Slumpmässiga stopp av OmpF är inte förknippade med en förändring i intensitet och därmed med stängningen av dess porer. Baserat på fluorescenssignalerna38 kan positionsnoggrannheten för de enskilda kanalerna uppskattas i intervallet mellan 5 och 10 nm. Det bör dock noteras att denna noggrannhet inte kan uppnås om kanalerna vacklar något på grund av mobil förankring med agaroshydrogelen, som visas till exempel för TOM-CC-molekylerna i ett mellanliggande tillstånd med en rotmedelförskjutning på 120 nm (figur 5A).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64970/64970fig01.jpg"> Figur 1: Isolering av TOM-CC. a) Cryo EM-struktur av N. crassa TOM-CC30,39. Mitokondrier från en N. crassa-stam innehållande en Tom22 med en 6xHe-tagg solubiliserades i DDM och utsattes för Ni-NTA-affinitetskromatografi (B) och anjonbyteskromatografi (C). (D) SDS-PAGE för isolerad TOM-CC. (E) Kristallstruktur (PDB, 1OPF) och (F) SDS-PAGE av renad E. coli OmpF. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64970/64970fig01large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64970/64970fig02.jpg"> Figur 2: Flödesschema för PMMA-kammarmontering. Steg 1: Ett glastäckglas är spin-belagt med en agaroshydrogel. Steg 2: Det spinbelagda täckglaset monteras i en skräddarsydd PMMA-mikroskopikammare. Steg 3: Ytterligare agaros med låg smälthalt tillsätts i PMMA-kammarens inloppsport på en 35 °C värmeplatta. Steg 4: Lipidmonolager bildas runt vattenhaltiga droppar vid ett buffert-/oljegränssnitt (vänster) och på agaroshydrogel/oljegränssnittet (höger). Steg 5: Individuella vattenhaltiga droppar pipetteras in i brunnarna i PMMA-kammaren för att bilda ett lipiddubbelskikt vid kontakt med de två lipidmonolagren. Steg 6: Bildandet av DIB-membranen valideras med Hofmann-moduleringskontrastmikroskopi. Steg 7: Bilder av utvalda områden av DIB-membranen med införda jonkanaler erhålls genom TIRF-mikroskopi. Grön: 0,75% agaros; gul: 2,5% agaros innehållandeCa2+ joner; magenta: lipid / oljefas; mörkblå: vattenhaltig droppbuffert innehållande Ca2+-känsligt färgämne och protein. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64970/64970fig02large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64970/64970fig03.jpg"> Figur 3: Experimentell uppställning . (A) Schematisk representation av ett DIB-membran i en PMMA-brunn. Dubbelskiktet vilar på en ultratunn 0,75% agarosfilm för att möjliggöra TIRF-avbildning av Ca2+-flöde genom en jonkanal över tid med användning av ettCa2+-känsligt fluorescensfärgämne (Fluo-8) i trans. (B) Ca2+-flödet styrs uteslutande av det osmotiska trycket från cis till trans. Detta möjliggör både bestämning av positionen i membranet och kanalens öppna-slutna tillstånd . Kanalen som visas här är den proteinledande kanalen TOM-CC av N. crassa mitokondrier30. (C) Bana för en enda TOM-CC-kanal. Grön: rörlig kanal; Gul: Kanal som inte rör sig. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64970/64970fig03large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64970/64970fig04.jpg"> Figur 4: Avbildning av TOM-CC och OmpF i DIB-membran. (A) DIB-membran avbildat med Hoffmanns moduleringskontrastmikroskopi som visar dubbelskiktets kontaktyta mellan hydrogelen och droppen. (B) Brutet DIB-membran avbildat enligt (A). Pil, kant av PMMA-kammaren. (C) DIB-membran avbildat med TIRF-mikroskopi utan proteinkanaler. (D) DIB-membran med rekonstituerad TOM-CC, avbildad med TIRF-mikroskopi. De vita fyrkanterna markerar fläckar med hög (SH), mellanliggande (SI) och låg (SL) intensitet. (E) Anpassning av fluorescensintensitetsprofilen för de tre punkterna markerade i (A) till tvådimensionella Gaussfunktioner avslöjar positionen för enskilda TOM-CC och Ca2+ -flödet genom kanalen. F) DIB-membran med rekonstituerat OmpF. (G) Gaussisk passning av den fluorescerande punkt som är markerad i (F). I motsats till det tvåporiga β-fats proteinkomplexet TOM-CC avslöjar OmpF med tre porer β fat endast ett permeabilitetstillstånd. Pixelstorlek, 0,16 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64970/64970fig04large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64970/64970fig05.jpg"> Figur 5: Kanalaktivitet korrelerar med lateral rörlighet för TOM-CC. (A) Den fluorescerande amplitudspåret (överst) och motsvarande bana (botten) för TOM-CC indikerar att den öppna-slutna kanalaktiviteten för TOM-CC korrelerar med komplexets laterala membranrörlighet. Banan visar tre permeabilitetstillstånd. Grön: helt öppet tillstånd; gul: mellanliggande permeabilitetstillstånd; röd: stängt kanaltillstånd; röd stjärna: TOM-CC i mellanläge vinglar runt sin medelposition med cirka ±60 nm. Positionsnoggrannheten37 baserad på fluorescenssignalerna i helt öppna och mellanliggande tillstånd varierar mellan 5 nm och 10 nm. (B) Fluorescerande amplitudspår (överst) och motsvarande bana (botten) för OmpF. OmpF avslöjar bara en intensitetsnivå, oavsett om den är i rörelse eller fångad. Bansegmenten som motsvarar tidsperioderna för fångade molekyler är markerade i grått. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64970/64970fig05large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Buffert </td>
			<td colspan="3">Reagenskoncentrationer</td>
			<td>Volym</td>
		</tr><tr><td>A1*</td>
			<td colspan="3">20 mM Tris-HCl pH 8,5, 0,1 % (vikt/volym) n-dodecyl-β-D-maltosid (DDM), 10 % (v/v) glycerol, 300 mM NaCl och 1 mM fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF)</td>
			<td>100 ml</td>
		</tr><tr><td>A2*</td>
			<td colspan="3">20 mM Tris-HCl pH 8,5, 0,1% (w/v) DDM, 10% (v/v) glycerol, 1 M Imidazol och 1 mM PMSF</td>
			<td>100 ml</td>
		</tr><tr><td>B1*</td>
			<td colspan="3">20 mM HEPES pH 7,2, 0,1% (w/v) DDM, 2% (v/v) dimetylsulfoxid (DMSO)</td>
			<td>100 ml</td>
		</tr><tr><td>B2*</td>
			<td colspan="3">20 mM HEPES pH 7,2, 0,1% (w/v) DDM, 1 M KCl, 2% (v/v) dimetylsulfoxid (DMSO)</td>
			<td>100 ml</td>
		</tr><tr><td colspan="5">* Gasa och passera genom ett 0,22 μm filter före användning.</td>
		</tr></tbody></table>Tabell 1: Buffertlösningar för TOM-CC-isolering.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Buffert </td>
			<td colspan="3">Reagenskoncentrationer</td>
			<td>Volym</td>
		</tr><tr><td>LB*</td>
			<td colspan="3">1% (w/v) trypton, 1% (w/v) NaCl och 0,5% (w/v) jästextrakt</td>
			<td>1100 ml</td>
		</tr><tr><td>C1</td>
			<td colspan="3">2 mM MgCl2 och ~750 enheter DNAse och 50 mM Tris-HCl pH 7,5</td>
			<td>20 ml</td>
		</tr><tr><td>C2</td>
			<td colspan="3">50 mM Tris-HCl, pH 7,5</td>
			<td>50 ml</td>
		</tr><tr><td>C3</td>
			<td colspan="3">4% (w/v) natriumdodecylsulfat (SDS), 2 mM β-merkaptoetanol och 50 mM Tris-HCl pH 7,5</td>
			<td>50 ml</td>
		</tr><tr><td>C4</td>
			<td colspan="3">2% (w/v) SDS, 500 mM NaCl och 50 mM Tris-HCl pH 7,5</td>
			<td>50 ml</td>
		</tr><tr><td>C5</td>
			<td colspan="3">0,5% (w/v) oktylpolyoxietylen (oktyl POE), 1 mM EDTA och 20 mM Tris pH 8,5</td>
			<td>1000 ml</td>
		</tr><tr><td colspan="5">* Sterilisera före användning.</td>
		</tr></tbody></table>Tabell 2: Buffertlösningar för OmpF-isolering.

Watch this Scientific Journal Video about Single-Molecule Imaging of Lateral Mobility and Ion Channel Activity in Lipid Bilayers using Total Internal Reflection Fluorescence TIRF Microscopy Video at J

Single-Molecule Imaging of Lateral Mobility and Ion Channel Activity in Lipid Bilayers using Total Internal Reflection Fluorescence TIRF Microscopy Video (Video) | JoVE

Detta protokoll beskriver hur man använder TIRF-mikroskopi för att spåra enskilda jonkanaler och bestämma deras aktivitet i lipidmembran som stöds, vilket definierar samspelet mellan lateral membranrörelse och kanalfunktion. Den beskriver hur man förbereder membranen, registrerar data och analyserar resultaten.

Enmolekylär avbildning av lateral rörlighet och jonkanalaktivitet i lipidlager med hjälp av total intern reflektionsfluorescens (TIRF) mikroskopi

High-resolution imaging techniques have shown that many ion channels are not static, but subject to highly dynamic processes, including the transient ...

Jonkanaler är inte statiska i biologiska membran. Här presenterar vi ett optiskt tillvägagångssätt med en enda molekyl för att avslöja länken mellan lateral membrandiffusion och jonkanalfunktion. Den största fördelen med denna teknik jämfört med andra metoder är att fluorescerande märkning av proteiner som kan störa deras laterala rörelse och funktion inte krävs.Metoden kan appliceras på vilken membranproteinkanal som helst där fri eller begränsad diffusion är viktig för organisation och funktion. Börja med att överföra 380 mikroliter av DPhPC-stamlösningen till en injektionsflaska av glas och överlappa lipidstamlösningen med argon eller kvävgas för att förhindra lipidoxidation. Använd lägsta möjliga gasflöde för att undvika avdunstning av det organiska lösningsmedlet i vilket lipiderna är upplösta eller stänk av lösningsmedelssprayerna från injektionsflaskan.Torka lipidprovet under en ström av kväve och avlägsna det återstående organiska lösningsmedlet från lipidprovet under vakuum med en oljefri vakuumpump över natten. Lös upp lipidfilmen i en hexadekansilikonoljelösning genom att tillsätta lika stora volymer hexadekan och silikonolja med en en milliliter pipett till en slutlig lipidkoncentration av 9,5 milligram per milliliter. Placera några glasöverdrag i en täckglashållare i rostfritt stål och rengör dem i en glasbägare i cirka 10 minuter med aceton i en ultraljudsrengörare.Skölj täckglasen med dubbelt avjoniserat vatten och torka dem under en kväveström. Rengör och hydrofylisera ytterligare ett täckglas i en plasmarenare med syre i fem minuter. Montera ett plasmabehandlat täckglas på en spinnbeläggning och belägg täckglaset med en submikrometer tjock film av agaros genom att långsamt tillsätta 140 mikroliter uppvärmd 0,75% låg smältande agaros med en 200 mikroliter pipett vid 3 000 varv / min i 30 sekunder.Fäst omedelbart det spinbelagda täckglaset med det tunna lagret av agaroshydrogelen på undersidan av PMMA-kammaren. Se till att agaroshydrogelen pekar uppåt. Fäst kanterna på täckglaset på PMMA-mikrobearbetad enhet med transparent tejp och placera enheten på en värmeplatta uppvärmd till 35 grader Celsius.Häll försiktigt 200 mikroliter 2,5% agaroslösning i kammarens inlopp utan att skapa luftbubblor. Täck omedelbart PMMA-kammarens brunnar med cirka 60 mikroliter lipidoljelösning för att initiera lipidmonolagerbildning vid agarosoljegränssnittet för att undvika uttorkning av den spinbelagda agarosen i brunnarna i PMMA-kammaren. Placera enheten på en värmeplatta vid 35 grader Celsius i cirka två timmar.Placera cirka 20 mikroliter lipidhexadekansilikonoljelösning i var och en av de flera mikrotillverkade brunnarna i en droppinkubationskammare. Förbered en mikrokapillär glasnål med en spetsöppningsdiameter på cirka 20 mikrometer med en vertikal eller horisontell mikropipettdragare. Fyll nålen med cirka fem mikroliter vattenhaltig injektionslösning innehållande 8,8 millimolar HEPES, sju mikromolar fluorescerande färgämne, Fluo-8, 400 mikromolar EDTA, 1,32 molar kaliumklorid och 30 nanomolar TOM-kärnkomplex eller alternativt 20 nanomolar OMPF.Montera nålen med vatteninjektionslösningen på en piezodriven nanoinjektor och injicera 100 till 200 nanoliter vattenhaltiga droppar i brunnarna i droppinkubationskammaren fylld med lipidhexadekansilikonoljelösning med nanoinjektorn. Tillåt bildandet av ett lipidmonolager vid droppoljegränssnittet i cirka två timmar genom att bibehålla PMMA- och droppinkubationskamrarna på en värmeplatta uppvärmd till 35 grader Celsius. Överför manuellt enskilda vattenhaltiga droppar från droppinkubationskammarens brunnar till PMMA-kammarens brunnar med en enkanals mikroliterpipett med en 10 mikroliter engångspropenspets.Låt dropparna sjunka på lipidmonolagren vid hydrogel-oljegränssnitten för att bilda ett lipid-dubbelskikt mellan dropparna och agaroshydrogelen. Montera PMMA-kammaren med droppgränssnittets dubbelskikt eller DIB-membran på provhållaren i ett inverterat ljusmikroskop och utvärdera membranbildningen med hjälp av ett 10x Hoffman-moduleringskontrastmål. Om DIB-membran har bildats, montera PMMA-kammaren på provhållaren i ett TIRF-mikroskop utrustat med en konventionell ljuskälla för epifluorescensbelysning, en 488 nanometer laser och en bakgrundsbelyst elektronmultiplicerande CCD-kamera för att uppnå en pixelstorlek på cirka 0,16 mikrometer.Fokusera kanten på ett DIB-membran med ett 10x förstoringsmål under epifluorescensbelysning med en högintensiv ljuskälla med hjälp av en GFP-filteruppsättning. Finfokusera samma kant på DIB-membranet vid hög förstoring med ett 100x NA 1,49 apokromatiskt olje-TIRF-mål, återigen under epifluorescensbelysning med en högintensiv ljuskälla med en GFP-filteruppsättning. Ändra filterinställningen från GFP till fyrbands TIRF-filteruppsättningen, slå på 488 nanometerlasern och ställ in laserns intensitet på objektivlinsen.För att visualisera enstaka jonkanaler, justera TIRF-vinkeln och EM CCD-kameraförstärkningen så att de öppna jonkanalerna i DIB-membranet visas som fluorescerande fläckar med hög kontrast på en mörk bakgrund och signal-bakgrundsförhållandet når maximalt. Se till att fläckarna som motsvarar kalciumjonflödet genom enstaka jonkanaler förblir i fokus och har en rund form med hög intensitet i mitten och gradvis minskar mot periferin. Kontrollera att lysrörsfläckarna är i fokus för att säkerställa att jonkanalerna har rekonstituerats till DIB-membranen och rör sig lateralt i membranplanet.Slutligen spela in en serie membranbilder som möjliggör korrekt spårning av positionen och övervakning av det öppna-slutna tillståndet för de enskilda jonkanalerna. För att bestämma typen av lateral rörlighet och tillståndet för kanalaktivitet, förvärva tillräckligt långa och väl samplade banor. Cryo EM-struktur av Neurospora crassa TOM-CC visas här.Mitokondrier från en N.crassa-fläck innehållande en TOM 22 med en 6-His tagg solubiliserades i DDM och utsattes för nickel NTA-affinitetskromatografi och anjonbyteskromatografi. SDS-PAGE av isolerad TOM-CC-kristallstruktur och SDS-PAGE av renad E. coli OMPF som används för jämförelse visas här. Det fluorescerande amplitudspåret i motsvarande bana för TOM-CC indikerar att den öppna-slutna kanalaktiviteten hos TOM-CC korrelerar med komplexets laterala membranrörlighet.Amplitudspårningen visar tre permeabilitetstillstånd: helt öppet tillstånd som motsvarar rörliga kanaler, mellanliggande permeabilitetstillstånd och stängt kanaltillstånd som motsvarar icke-rörliga kanaler. TOM-CC i mellantillståndet vinglar runt sin medelposition med cirka plus/minus 60 nanometer. De fluorescerande amplitudspåren i motsvarande bana för OMPF visas här.OMPF avslöjar bara en intensitetsnivå jämfört med TOM-CC, oavsett om den är i rörelse eller fångad. Bansegmenten som motsvarar tidsperioderna för fångade molekyler är markerade i grått. En viktig sak att notera är att denna metod analyserar enstaka membranproteiner i en intakt membranmiljö.Membranproteinernas dynamik kommer att förbli en horisont för vetenskapliga studier inom överskådlig framtid. Vi förväntar oss att vår metod kommer att bidra till detta område avsevärt.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Single-Molecule Imaging of Lateral Mobility and Ion Channel Activity in Lipid Bilayers using Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopy

Detergent-free Ultrafast Reconstitution of Membrane Proteins into Lipid Bilayers Using Fusogenic Complementary-charged Proteoliposomes.

Detergent-free Ultrafast Reconstitution of Membrane Proteins into Lipid Bilayers Using Fusogenic Complementary-charged Proteoliposomes. Video (Video) | JoVE

Tvättmedel-fri ultrasnabb beredning av membranproteiner i Lipid lipidmonolager använder Fusogenic kompletterande laddade Proteoliposomes.

Detergents are indispensable for delivery of membrane proteins into 30-100 nm small unilamellar vesicles, while more complex, larger model lipid bilayers ...

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers Video (Video) | JoVE

In Vitro Beredning av självorganiserande Protein mönster på stöds Lipid lipidmonolager

Many aspects of the fundamental spatiotemporal organization of cells are governed by reaction-diffusion type systems. In vitro reconstitution of such ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator Video (Video) | JoVE

Dissipativa Microgravimetry att studera bindande dynamiken i den fosfolipid bindande proteinet Annexin A2 till Solid-stödda Lipid lipidmonolager med en kvarts Resonator

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy

Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy Video (Video) | JoVE

Uttryck och rening av den mänskliga Lipid-känsliga ering kanal TRPC3 för strukturella bestämning genom Single-particle kryo-elektronmikroskopi

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium ...

Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules

Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules Video (Video) | JoVE

Single-molekyl tracking mikroskopi-ett verktyg för att bestämma Diffusiva stater cytosoliska molekyler

Single-molecule localization microscopy probes the position and motions of individual molecules in living cells with tens of nanometer spatial and ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation Video (Video) | JoVE

Produktion av dynein och Kinesin motor ensembler på DNA origami nanostrukturer för enkel molekyl observation

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

High-Throughput Total Internal Reflection Fluorescence and Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy Using a Photonic Chip

High-Throughput Total Internal Reflection Fluorescence and Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy Using a Photonic Chip Video (Video) | JoVE

Hög genomströmning total intern reflektions fluorescens och direkt stokastisk optisk rekonstruktion mikroskopi med ett Fotoniskt chip

Total internal reflection fluorescence (TIRF) is commonly used in single molecule localization based super-resolution microscopy as it gives enhanced ...

Conventional BODIPY Conjugates for Live-Cell Super-Resolution Microscopy and Single-Molecule Tracking

Conventional BODIPY Conjugates for Live-Cell Super-Resolution Microscopy and Single-Molecule Tracking Video (Video) | JoVE

Konventionella BODIPY konjugat för Live-Cell Super-Resolution Mikroskopi och single-molecule tracking

Single molecule localization microscopy (SMLM) techniques overcome the optical diffraction limit of conventional fluorescence microscopy and can resolve ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH Video (Video) | JoVE

Encellsanalys av transkriptionellt aktiva alleler med enmolekylig FISK

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

Single Molecule Fluorescence Energy Transfer Study of Ribosome Protein Synthesis

Single Molecule Fluorescence Energy Transfer Study of Ribosome Protein Synthesis Video (Video) | JoVE

Enmolekyl fluorescens energiöverföringsstudie av ribosomproteinsyntes

The ribosome is a large ribonucleoprotein complex that assembles proteins processively along mRNA templates. The diameter of the ribosome is approximately ...