Name: real-time measurement of the mitochondrial bioenergetic profile of neutrophils
Uploaded: 2023-06-02T13:00:00
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我们感谢UConn Health免疫学系的Anthony T. Vella博士和Federica Aglianoin博士在使用代谢细胞外通量分析仪方面的培训，以及UConn Health免疫学系的Lynn Puddington博士对这些仪器的支持。我们感谢康涅狄格大学医学院的日内瓦·哈吉斯博士在科学写作和编辑本手稿方面的帮助。这项研究得到了美国国立卫生研究院，国家心脏，肺和血液研究所（R01HL145454），国家普通医学科学研究所（R35GM147713和P20GM139763），UConn Health的启动基金以及美国免疫学家协会的职业再入奖学金的支持。

肝素化全血样本是在获得知情同意后从健康人类捐赠者那里获得的，经康涅狄格大学卫生机构审查委员会根据赫尔辛基宣言批准。所有动物实验都遵循康涅狄格大学卫生机构动物护理和使用委员会（IACUC）的指导方针，并根据美国国立卫生研究院实验动物护理和使用指南中概述的标准，获得了康涅狄格大学健康IACUC对啮齿动物的使用批准。本研究使用6周龄的雄性C57BL / 6小鼠。
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使用代谢细胞外通量分析仪测量中性粒细胞线粒体呼吸的标准程序受到许多因素的限制，包括细胞数量、细胞生长和活力。在该测定中，每种化合物浓度因细胞的类型和来源而异。寡霉素和鱼藤酮/抗霉素A在大多数细胞类型中大多以相似的浓度使用。然而，由于FCCP诱导的最大呼吸频率因不同细胞而异，因此需要仔细滴定FCCP以优化浓度42。在优化期间执行 FCCP 的顺序添加也更好。?...

线粒体在细胞生物能量学中起主要作用，其通过氧化磷酸化（OXPHOS）产生三磷酸腺苷（ATP）。除此之外，线粒体的作用延伸到活性氧的产生和解毒，细胞质和线粒体基质钙调节，细胞合成，分解代谢以及细胞内代谢物的运输1。线粒体呼吸在所有细胞中都是必不可少的，因为它们的功能障碍会导致代谢问题2，包括心血管疾病3 和多种神经退行性疾病，如年龄相关性黄斑变性4，帕金森氏症和阿尔茨海默氏症5，以及Charcot-Marie-Tooth疾病2 A（CMT2A）6。
对中性粒细胞的电子显微镜研究表明，线粒体7相对较少，并且由于线粒体呼吸速率非常低，它们严重依赖糖酵解来产生能量8。然而，线粒体对中性粒细胞功能至关重要，例如趋化性9和细胞凋亡10,11,12。之前的一项研究揭示了具有高膜电位的人中性粒体中性粒体网络。线粒体膜电位丢失是中性粒细胞凋亡的早期指标10。用线粒体解偶联剂羰基氰化物间氯苯基腙（CCCP）处理显示出对趋化性的显着抑制，以及线粒体形态的变化9,10。
虽然中性粒细胞的主要能量来源是糖酵解，但线粒体通过推动嘌呤能信号传导的第一阶段来提供启动中性粒细胞激活的 ATP，从而促进 Ca2+ 信号传导，放大线粒体 ATP 的产生，并启动中性粒细胞功能反应13。线粒体呼吸链功能障碍导致有毒活性氧（ROS）的过量产生并导致致病性损害14,15,16。NETosis是形成中性粒细胞细胞外陷阱（NET）的过程，是中性粒细胞的关键特性，可帮助它们对抗病原体17，并导致许多病理状况，包括癌症，血栓形成和自身免疫性疾病18。线粒体来源的 ROS 有助于 NETosis19，线粒体 DNA 可以是NETs 18 的组成部分，线粒体稳态改变会损害 NETosis 20,21,22,23,24。此外，在正常分化或成熟期间，中性粒细胞代谢重编程通过限制糖酵解活性而被逆转，并且它们参与线粒体呼吸并动员细胞内脂质25,26。
代谢细胞外通量分析仪可以连续监测和量化活细胞线粒体呼吸和糖酵解。该分析仪利用一个 96 孔板格式的传感器盒和两个荧光团来量化氧 （O2） 浓度和 pH 值变化。在测定过程中，传感器盒位于细胞单层上方，并形成~200nm高的微室。分析仪中的光纤束用于激发荧光团并检测荧光强度变化。自动计算 O2 浓度和 pH 值的实时变化，并显示为耗氧速率 （OCR） 和细胞外酸化速率 （ECAR）。传感器盒上有四个端口，允许在测定测量期间将多达四种化合物加载到每个孔中。该协议侧重于使用代谢细胞外通量分析仪量化小鼠和人中性粒细胞的线粒体呼吸，以及中性粒细胞样HL60细胞。

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	<tbody>
		<tr>
			<td>37 &#176;C non-CO2&#160;incubator</td>
			<td>Precision</td>
			<td>Economy Model 2EG</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biorender</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Software Application</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Model 5810R</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#160;Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive</td>
			<td>Corning</td>
			<td>102416-100</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep Magnet</td>
			<td>STEMCELL</td>
			<td>18000</td>
			<td>Magnet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySepMouse Neutrophil Enrichment kit</td>
			<td>STEMCELL</td>
			<td>19762A</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad Prism 9</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Software Application</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Serum Albumin Solution (25%)</td>
			<td>GeminiBio</td>
			<td>800-120</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine (VetaKet)</td>
			<td>DAILYMED</td>
			<td>NDC 59399-114-10</td>
			<td>Anesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>SH30256.01</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate buckets</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>UL155</td>
			<td>Accessory</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PolymorphPrep</td>
			<td>PROGEN</td>
			<td>1895 (previous 1114683)</td>
			<td>polysaccharide solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified mouse anti-human CD18 antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>302102</td>
			<td>Clone TS1/18</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11-875-093</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse metabolic extracellular flux analyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>XFe96</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF Cell Mito Stress Test Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>103015-100</td>
			<td>mitochondrial stress test Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swing-bucket rotor</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>A-4-62</td>
			<td>Rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vactrap 2 Vacum Trap</td>
			<td>Fox Lifesciences</td>
			<td>3052101-FLS</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wave</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Software Application</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF 1.0 M Glucose Solution</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>103577-100</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF 100 mM Pyruvate Solution</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>103578-100</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF 200 mM Glutamine Solution</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>103579-100</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF DMEM medium</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>103575-100</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XFe96 FluxPak</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>102601-100</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine (AnaSed Injection)</td>
			<td>DAILYMED</td>
			<td>NDC 59399-110-20</td>
			<td>Anesthetic</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time measurement of the mitochondrial bioenergetic profile of neutrophils

中性粒细胞是人类的第一道防线，也是最丰富的白细胞。这些效应细胞执行吞噬作用和氧化爆发等功能，并产生中性粒细胞细胞外陷阱（NET）用于微生物清除。对中性粒细胞代谢活动的新见解挑战了它们主要依赖于糖酵解的早期概念。代谢活动的精确测量可以揭示中性粒细胞的不同代谢需求，包括生理条件和疾病状态下的三羧酸（TCA）循环（也称为克雷布斯循环），氧化磷酸化（OXPHOS），磷酸戊糖途径（PPP）和脂肪酸氧化（FAO）。本文描述了在代谢细胞外通量分析仪上进行代谢通量分析，测量小鼠骨髓来源中性粒细胞、人血源性中性粒细胞和中性粒细胞样HL60细胞系的耗氧率（OCR）作为线粒体呼吸指标的分步方案和先决条件。该方法可用于量化中性粒细胞在正常和疾病条件下的线粒体功能。

显示代表性的OCR动力学表明线粒体呼吸变化响应寡霉素，FCCP和鱼藤酮/抗霉素A小鼠中性粒细胞（图3A），人中性粒细胞（图3B）以及未分化和分化的HL60细胞（图3C）的混合物。在所有细胞中，寡霉素处理通过抑制ATP合酶的质子通道来降低OCR值;FCCP处理通过增加电子流量和耗氧量来恢复OCR值，以维持膜电位并实现最大呼吸;和鱼藤酮/?...

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Real-Time Measurement of the Mitochondrial Bioenergetic Profile of Neutrophils

我们描述了使用代谢细胞外通量分析仪测量小鼠和人中性粒细胞以及HL60细胞线粒体呼吸的逐步方案。

实时测量中性粒细胞的线粒体生物能量特征

Neutrophils are the first line of defense and the most abundant leukocytes in humans. These effector cells perform functions such as phagocytosis and ...

该协议侧重于使用代谢细胞外通量分析仪量化小鼠和人中性粒细胞以及中性粒细胞样HL60细胞的线粒体呼吸。这种方法使我们能够量化中性粒细胞在正常和疾病条件下的线粒体功能。这是一种简单的技术，可以深入了解细胞对药物或任何疾病状况的线粒体功能。由于不同的细胞具有不同的线粒体呼吸效率，因此必须准确优化细胞接种密度和试剂浓度才能获得高质量的结果。要开始代谢细胞外通量测定，请取包装在专门设计的96孔板上的传感器盒，并将200微升校准培养基转移到基础板的每个孔中。小心地用校准剂提起滤芯和板，并将其放入非二氧化碳加湿的37摄氏度培养箱中过夜进行水合作用。接下来，根据细胞类型，在96孔板上涂上特定的涂层，以确保细胞粘附。之后，用200微升无菌PBS清洗板两次。用1毫摩尔丙酮酸，10毫摩尔葡萄糖和2毫摩尔谷氨酰胺制备DMEM中的测定培养基。按照文本手稿中的描述获取小鼠和人中性粒细胞。对于从小鼠获得的中性粒细胞，通过添加测定培养基将细胞密度调节至每毫升第六个细胞的1.1乘以10至第六个细胞。然后将每孔接种180微升小鼠中性粒细胞悬浮液到制备的96孔板中。类似地，使用测定培养基将人中性粒细胞密度调节至每毫升10至第六个细胞的2.2倍。在测定当天，使用血细胞计数器手动计数中性粒细胞样HL60细胞。然后将分化或未分化的HL60细胞在室温下以300G离心五分钟。用DMEM洗涤细胞一次，然后将其重新悬浮在测定培养基中，以达到每毫升10至第六个细胞的1.39倍的细胞密度。接下来将180微升分化或未分化的HL60细胞种子到含有小鼠和人中性粒细胞样品的预先制备的96孔板中。最后，将完全培养基添加到没有细胞的细胞培养板的角孔中，以便在接种时进行背景校正。在室温下以300G离心板三分钟，以确保板底部的细胞正确粘附。最后，将板孵育一小时，用测定培养基预平衡细胞。打开线粒体压力测试试剂盒，按照制造商的说明准备试剂。接下来，将试剂盒装入试剂盒，首先将制备的寡霉素装入端口A，将FCCP装入端口B，将鱼藤酮/抗霉素A混合物装入端口C进行注射。用20微升测定培养基填充未使用的端口。在检测前至少五小时在 37 摄氏度下平衡检测系统，方法是打开 Wave 软件并单击“加热器打开”选项卡。达到温度后，Wave软件的左下角显示准备就绪。在软件中打开线粒体应激测定试剂盒的模板。选择左侧的注射策略，然后单击添加并将注射条件命名为人中性粒细胞或小鼠中性粒细胞或HL60。通过单击每个端口选择端口 A 到 D，然后单击添加化合物并输入具有相应浓度的寡霉素或 FCCP 或鱼藤酮/抗霉素 A。选择左侧的预处理，然后单击添加并分别命名为CD18和Cell Tak。选择左侧的单元格类型。然后单击添加并将它们命名为人中性粒细胞、小鼠中性粒细胞和 HL60 或 DHL60，并根据需要提供喂养密度。通过单击添加组来定义组。然后单击带下划线的定义。单击顶部菜单中的“板图”以观察左侧带有定义的所有组，右侧带有板图。拖放以将每个孔添加到组中，同时保持四个角孔作为背景。要设置实验方案，请选择顶部菜单中的“实验方案”选项卡，并通过将混合时间设置为三分钟、休息时间为零分钟和测量时间为七分钟来定义基线、寡霉素、FCCP、鱼藤酮和抗霉素 A 混合物的三个周期。转到“运行分析”页，提供项目摘要信息以供参考，然后单击“开始运行”。给出保存文件的位置，以便在测定完成后保存所有结果。然后再次单击开始运行。自动加载测定后，等待托盘打开，将传感器盒和板放入200微升校准剂。将墨盒条形码方向朝右设置。通过单击“我已准备就绪”运行校准，这大约需要 20 分钟。校准后，单击打开托盘，用细胞接种板替换板，然后单击我已准备好继续测定。完成测定后，数据将自动保存。将结果导出到电子表格或其他分析软件文件。绘制图形并分析数据。耗氧率或OCR的代表性动态表明小鼠和人中性粒细胞线粒体呼吸的变化，以及未分化和分化的HL60细胞响应寡霉素，FCCP以及鱼藤酮和抗霉素A的混合物，由于ATP合酶质子通道的抑制，寡霉素处理后所有细胞的OCR值降低。FCCP处理增加了电子流量和氧气消耗，以恢复OCR值并实现最大呼吸。鱼藤酮和抗霉素A的混合物阻断了电子传递链的复合物1和3，导致线粒体呼吸的消除。中性粒细胞定向分化后HL60细胞中观察到线粒体呼吸减少。发现分化的HL60细胞具有显着降低的基础线粒体呼吸，质子泄漏相关呼吸，ATP连接呼吸和非线粒体呼吸。分化HL60细胞最大呼吸增加不显著，而备用呼吸能力显著增加。确保细胞位于板的底部，因为在读取 OCR 值时，传感器盒不应因浮动细胞而有任何障碍物。该技术将帮助研究人员研究中性粒细胞相关研究中药物或线粒体功能障碍的影响。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A TIRF Microscopy Technique for Real-time, Simultaneous Imaging of the TCR and its Associated Signaling Proteins

一个实时，同步成像的TCR和其相关的信号转导蛋白的T​​IRF显微镜技术

Signaling is initiated through the T Cell Receptor (TCR) when it is engaged by antigenic peptide fragments bound by Major Histocompatibility Complex ...

科研

免疫与感染

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

T细胞实时成像实时信号复合物的形成

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

Bioenergetics and the Oxidative Burst: Protocols for the Isolation and Evaluation of Human Leukocytes and Platelets

生物能量和氧化突发：协议用于人类白细胞和血小板的隔离与评价

Mitochondrial dysfunction is known to play a significant role in a number of pathological conditions such as atherosclerosis, diabetes, septic shock, and ...

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

胞外DNA释放的高通量测量和人中性粒定量NET形成<em&gt;体外</em

Neutrophil granulocytes are the most abundant leukocytes in the human blood. Neutrophils are the first to arrive at the site of infection. Neutrophils ...

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

在实时麻醉小鼠成像中性粒细胞和单核细胞在肠系膜静脉用活体显微镜

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

Measuring Dengue Virus RNA in the Culture Supernatant of Infected Cells by Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction

实时定量聚合酶链反应检测感染细胞培养中的登革热病毒 rna

At present, real-time polymerase chain reaction (PCR) technology is an indispensable tool for the detection and quantification of viral genomes in ...

Robust Ligature-Induced Model of Murine Periodontitis for the Evaluation of Oral Neutrophils

用于口腔中性粒细胞病评价的鼠期牙周炎的强结合诱导模型

The main advantages of studying the pathophysiology of periodontal disease utilizing murine models are the reduced cost of animals, array of genetically ...

Pan-lyssavirus Real Time RT-PCR for Rabies Diagnosis

用于狂犬病诊断的泛源病毒实时RT-PCR

Molecular assays are rapid, sensitive and specific, and have become central to diagnosing rabies. PCR based assays have been utilized for decades to ...

Monitoring Influenza Virus Survival Outside the Host Using Real-Time Cell Analysis

使用实时细胞分析监测宿主外的流感病毒存活率

Methods for virus particle quantification represent a critical aspect of many virology studies. Although several reliable techniques exist, they are ...

Real-Time Quantification of Reactive Oxygen Species in Neutrophils Infected with Meningitic Escherichia Coli

Real-Time Quantification of Reactive Oxygen Species in Neutrophils Infected with Meningitic Escherichia Coli

中性粒细胞中活性氧物种的实时定量 感染脑膜性 大肠杆菌

Escherichia coli (E. coli) is the most common Gram-negative bacteria causing neonatal meningitis. The occurrence of bacteremia and bacterial penetration ...