Name: real-time measurement of the mitochondrial bioenergetic profile of neutrophils
Uploaded: 2023-06-02T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real-Time Measurement of the Mitochondrial Bioenergetic Profile of Neutrophils at JoVE.com

Vi anerkender Dr. Anthony T. Vella og Dr. Federica Aglianoin fra Institut for Immunologi ved UConn Health for deres træning i at bruge den metaboliske ekstracellulære fluxanalysator og Dr. Lynn Puddington i Institut for Immunologi ved UConn Health for hendes støtte til instrumenterne. Vi anerkender Dr. Geneva Hargis fra UConn School of Medicine for hendes hjælp med videnskabelig skrivning og redigering af dette manuskript. Denne forskning blev støttet af tilskud fra National Institutes of Health, National Heart, Lung and Blood Institute (R01HL145454), National Institute of General Medical Sciences (R35GM147713 og P20GM139763), en opstartsfond fra UConn Health og et karriere-genindrejsestipendium fra American Association of Immunologer.

Hepariniserede fuldblodsprøver blev opnået fra raske humane donorer efter at have opnået informeret samtykke, som godkendt af Institutional Review Board of UConn Health i overensstemmelse med Helsingfors-erklæringen. Alle dyreforsøg fulgte UConn Health Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) retningslinjer, og godkendelse til brug af gnavere blev opnået fra UConn Health IACUC i henhold til kriterier skitseret i vejledningen til pleje og brug af forsøgsdyr fra National Institutes of Health. C57BL/6-hanm...

Standardproceduren, der måler mitokondriel respiration af neutrofiler ved hjælp af den metaboliske ekstracellulære fluxanalysator, er begrænset af mange faktorer, herunder celleantal, cellevækst og levedygtighed. Hver sammensat koncentration varierer mellem typen og kilden til celler i dette assay. Oligomycin og rotenon/antimycin A anvendes mest i en lignende koncentration blandt de fleste celletyper. Da den FCCP-inducerede maksimale respirationsfrekvens varierer mellem forskellige celler, kræves der imidlertid om...

Mitokondrier spiller en vigtig rolle i cellebioenergetik, som genererer adenosintrifosfat (ATP) ved oxidativ phosphorylering (OXPHOS). Ud over dette strækker mitokondriernes rolle sig ind i generering og afgiftning af reaktive iltarter, cytoplasmatisk og mitokondriel matrixcalciumregulering, cellulær syntese, katabolisme og transport af metabolitter i cellen1. Mitokondriel respiration er afgørende i alle celler, da deres dysfunktion kan resultere i metaboliske problemer 2, herunder hjerte-kar-sygdomme3 og en lang række neurodegenerative sygdomme, såsom aldersrelateret makuladegeneration4, Parkinsons og Alzheimers sygdomme5 og Charcot-Marie-Tooth sygdom2 A (CMT2A)6.
Elektronmikroskopiske undersøgelser af neutrofiler afslørede, at der er relativt få mitokondrier7, og de er stærkt afhængige af glykolyse for deres energiproduktion, da mitokondrie respirationshastigheder er meget lave8. Imidlertid er mitokondrier afgørende for neutrofile funktioner, såsom kemotakse9 og apoptose10,11,12. En tidligere undersøgelse afslørede et komplekst mitokondrienetværk i humane neutrofiler med højt membranpotentiale. Mitokondriemembranens potentielle tab er en tidlig indikator for neutrofil apoptose10. Behandling med mitokondriel afkobler carbonylcyanid m-chlorphenylhydrazon (CCCP) viste signifikant hæmning i kemotaksi sammen med en ændring i mitokondriemorfologi 9,10.
Selvom den primære energikilde for neutrofiler er glykolyse, tilvejebringer mitokondrier ATP, der initierer neutrofilaktivering ved at brænde den første fase af purinerg signalering, hvilket øger Ca2+ signalering, forstærker mitokondriel ATP-produktion og initierer neutrofile funktionelle reaktioner13. Dysfunktion af mitokondrie-respirationskæden resulterer i overdreven produktion af toksiske reaktive iltarter (ROS) og fører til patogene skader14,15,16. NETosis, som er processen med at danne neutrofile ekstracellulære fælder (NET'er), er en kritisk egenskab ved neutrofiler, der hjælper dem med at bekæmpe patogener17 og bidrager til mange patologiske tilstande, herunder kræft, trombose og autoimmune lidelser18. Mitokondrieafledt ROS bidrager til NETosis19, mitokondrie-DNA kan være en komponent i NETs18, og ændret mitokondriehomeostase svækker NETosis 20,21,22,23,24. Desuden bliver neutrofil metabolisk omprogrammering under normal differentiering eller modning vendt ved at begrænse glykolytisk aktivitet, og de engagerer sig i mitokondriel respiration og mobiliserer intracellulære lipider25,26.
Den metaboliske ekstracellulære fluxanalysator kan kontinuerligt overvåge og kvantificere levende celle mitokondriel respiration og glykolyse. Analysatoren anvender en 96-brønds pladeformatsensorpatron og to fluoroforer til at kvantificere iltkoncentration (O2) og pH-ændringer. Sensorpatronen er over cellemonolaget under analysen og danner et ~ 200 nm højt mikrokammer. De optiske fiberbundter i analysatoren bruges til at excitere fluoroforerne og detektere de fluorescerende intensitetsændringer. Ændringer i realtid iO2-koncentration og pH beregnes automatisk og vises som iltforbrugshastighed (OCR) og ekstracellulær forsuringshastighed (ECAR). Der er fire porte på sensorpatronen, der gør det muligt at indlæse op til fire forbindelser i hver brønd under analysemålingerne. Denne protokol fokuserer på kvantificering af mitokondriel respiration af mus og humane neutrofiler samt de neutrofillignende HL60-celler ved hjælp af den metaboliske ekstracellulære fluxanalysator.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>37 &#176;C non-CO2&#160;incubator</td>
			<td>Precision</td>
			<td>Economy Model 2EG</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biorender</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Software Application</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Model 5810R</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#160;Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive</td>
			<td>Corning</td>
			<td>102416-100</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep Magnet</td>
			<td>STEMCELL</td>
			<td>18000</td>
			<td>Magnet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySepMouse Neutrophil Enrichment kit</td>
			<td>STEMCELL</td>
			<td>19762A</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad Prism 9</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Software Application</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Serum Albumin Solution (25%)</td>
			<td>GeminiBio</td>
			<td>800-120</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine (VetaKet)</td>
			<td>DAILYMED</td>
			<td>NDC 59399-114-10</td>
			<td>Anesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>SH30256.01</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate buckets</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>UL155</td>
			<td>Accessory</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PolymorphPrep</td>
			<td>PROGEN</td>
			<td>1895 (previous 1114683)</td>
			<td>polysaccharide solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified mouse anti-human CD18 antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>302102</td>
			<td>Clone TS1/18</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11-875-093</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse metabolic extracellular flux analyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>XFe96</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF Cell Mito Stress Test Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>103015-100</td>
			<td>mitochondrial stress test Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swing-bucket rotor</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>A-4-62</td>
			<td>Rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vactrap 2 Vacum Trap</td>
			<td>Fox Lifesciences</td>
			<td>3052101-FLS</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wave</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Software Application</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF 1.0 M Glucose Solution</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>103577-100</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF 100 mM Pyruvate Solution</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>103578-100</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF 200 mM Glutamine Solution</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>103579-100</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF DMEM medium</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>103575-100</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XFe96 FluxPak</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>102601-100</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine (AnaSed Injection)</td>
			<td>DAILYMED</td>
			<td>NDC 59399-110-20</td>
			<td>Anesthetic</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time measurement of the mitochondrial bioenergetic profile of neutrophils

Neutrofiler er den første forsvarslinje og de mest rigelige leukocytter hos mennesker. Disse effektorceller udfører funktioner såsom fagocytose og oxidativ burst og skaber neutrofile ekstracellulære fælder (NET'er) til mikrobiel clearance. Ny indsigt i neutrofilers metaboliske aktiviteter udfordrer det tidlige koncept, at de primært er afhængige af glykolyse. Præcis måling af metaboliske aktiviteter kan udfolde forskellige metaboliske krav til neutrofiler, herunder tricarboxylsyre (TCA) cyklus (også kendt som Krebs cyklus), oxidativ phosphorylering (OXPHOS), pentosephosphatvej (PPP) og fedtsyreoxidation (FAO) under fysiologiske forhold og i sygdomstilstande. Dette papir beskriver en trinvis protokol og forudsætninger for at måle iltforbrugshastigheden (OCR) som en indikator for mitokondriel respiration på museknoglemarvsafledte neutrofiler, humane blodafledte neutrofiler og den neutrofillignende HL60-cellelinje ved hjælp af metabolisk fluxanalyse på en metabolisk ekstracellulær fluxanalysator. Denne metode kan anvendes til kvantificering af mitokondriefunktionerne hos neutrofiler under normale og sygdomsbetingelser.

Repræsentativ OCR-dynamik vises, hvilket indikerer mitokondrierespirationsændringer som reaktion på oligomycin, FCCP og rotenon/antimycin En blanding af museneutrofiler (figur 3A), humane neutrofiler (figur 3B) og udifferentierede og differentierede HL60-celler (figur 3C). I alle celler nedsætter oligomycinbehandling OCR-værdien ved at hæmme protonkanalen i ATP-syntase; FCCP-behandling gendanner OCR-værdien ved at øge strøm...

Watch this Scientific Journal Video about Real-Time Measurement of the Mitochondrial Bioenergetic Profile of Neutrophils at JoVE.com

Real-Time Measurement of the Mitochondrial Bioenergetic Profile of Neutrophils

Vi beskriver trinvise protokoller, der måler mitokondriel respiration af muse- og humane neutrofiler og HL60-celler ved hjælp af den metaboliske ekstracellulære fluxanalysator.

Realtidsmåling af mitokondriel bioenergetisk profil af neutrofiler

Neutrophils are the first line of defense and the most abundant leukocytes in humans. These effector cells perform functions such as phagocytosis and ...

Denne protokol fokuserer på kvantificering af mitokondriel respiration af muse- og humane neutrofiler samt neutrofillignende HL60-celler ved hjælp af den metaboliske ekstracellulære fluxanalysator. Denne metode giver os mulighed for at kvantificere mitokondriefunktion i neutrofiler under normale og sygdomsforhold. Dette er en ligetil teknik, der kan give indsigt i cellernes mitokondriefunktion som reaktion på lægemidler eller enhver sygdomstilstand.Da forskellige celler har forskellig mitokondriel respiratorisk effektivitet, skal optimering af cellesåtæthed og reagenskoncentration udføres nøjagtigt for at få resultater af høj kvalitet. For at starte det metaboliske ekstracellulære fluxassay skal du tage en sensorpatron pakket over en specielt designet 96-brøndplade og overføre 200 mikroliter kalibreringsmedium til hver brønd i den underliggende plade. Løft forsigtigt patronen og pladen med kalibrering, og læg den i en ikke-kuldioxidbefugtet 37 grader Celsius inkubator natten over for hydrering.Baseret på celletypen skal du derefter belægge 96-brøndpladen med en specifik belægning for at sikre celleadhæsion. Derefter vaskes pladerne med 200 mikroliter steril PBS to gange. Forbered analysemediet i DMEM med et millimolært pyruvat, 10 millimolært glucose og to millimolært glutamin.Anskaf musen og humane neutrofile celler som beskrevet i tekstmanuskriptet. For de neutrofiler, der er indkøbt fra musen, justeres celletætheden til 1,1 gange 10 til de sjette celler pr. milliliter ved at tilføje analysemedium. Derefter frø 180 mikroliter af musens neutrofile suspension pr. Brønd ind i den forberedte 96-brøndplade.På samme måde justeres den humane neutrofile celletæthed til 2,2 gange 10 til de sjette celler pr. milliliter ved hjælp af analysemediet. På dagen for analysen tælles de neutrofillignende HL60-celler manuelt ved hjælp af hæmocytometeret. Derefter centrifugeres de differentierede eller udifferentierede HL60-celler ved 300 G ved stuetemperatur i fem minutter.Vask cellerne med DMEM én gang og genopslæm dem i analysemediet for at opnå en celletæthed på 1,39 gange 10 til de sjette celler pr. milliliter. Derefter frø 180 mikroliter differentierede eller udifferentierede HL60-celler i den forberedte 96-brøndplade, der indeholder muse- og humane neutrofilprøver. Til sidst tilsættes komplet medium til hjørnebrøndene på cellekulturpladen uden celler til baggrundskorrektion under såning.Pladen centrifugeres ved 300 G ved stuetemperatur i tre minutter uden pause for at sikre, at cellerne på bunden af pladen klæber korrekt. Til sidst inkuberes pladen i en time for at præ-ekvilibrere cellerne med analysemediet. Åbn mitokondriestresstestsættet, og forbered reagenserne i henhold til producentens anvisninger.Derefter fyldes cylinderampullen med reagenser, begyndende med det fremstillede oligomycin i port A, FCCP i port B og rotenon/antimycin A-blandingen i port C til injektionsvæsker. Fyld de ubrugte porte med 20 mikroliter analysemedium. Ligevægt i analysesystemet ved 37 grader Celsius mindst fem timer før analysen ved at åbne Wave-softwaren og klikke på fanen Heater on.Efter at have nået temperaturen vises det nederste venstre hjørne af Wave-softwaren klar. Åbn en skabelon til mitokondriestressanalysesættet i softwaren. Vælg injektionsstrategier i venstre side, klik derefter på Tilføj, og navngiv injektionstilstanden som humane neutrofiler eller museneutrofiler eller HL60.Vælg port A til D ved at klikke på hver, og klik på Tilføj forbindelse, og indtast oligomycin eller FCCP eller rotenon / antimycin A med de respektive koncentrationer. Vælg Forbehandling i venstre side, klik derefter på Tilføj, og navngiv dem CD18 og Cell Tak separat. Vælg celletypen i venstre side.Klik derefter på Tilføj og navngiv dem humane neutrofiler, museneutrofiler og HL60 eller DHL60 med en fodringstæthed efter behov. Definer grupperne ved at klikke på Tilføj gruppe. Klik derefter på den understregede definition.Klik på Pladekort i topmenuen for at observere alle grupperne med definitioner i venstre side og pladekortet til højre. Træk og slip for at føje hvert felt til gruppen, mens du bevarer de fire hjørnefelter som baggrund. For at konfigurere protokollen skal du vælge fanen Protokol i topmenuen og definere tre cyklusser af baseline-, oligomycin-, FCCP-, rotenon- og antimycin A-blanding ved at indstille tiden til blanding som tre minutter, hvile som nul minutter og måling som syv minutter.Gå til siden Kør analyse, angiv projektoversigtsoplysningerne som reference, og klik på Start kørsel. Giv placeringen for at gemme filerne, så alle resultaterne gemmes efter afslutningen af analysen. Klik derefter på Start Kør igen.Efter den automatiske ilægning af analysen skal du vente på, at bakken åbnes for at placere sensorpatronen og pladen med 200 mikroliter kalibrering. Indstil patronens stregkoderetning mod højre. Kør kalibreringen ved at klikke på Jeg er klar, hvilket tager ca. 20 minutter.Efter kalibreringen skal du klikke på Åbn bakke, erstatte pladen med den celleseedede plade og klikke på Jeg er klar til at fortsætte analysen. Efter afslutningen af analysen gemmes dataene automatisk. Eksporter resultaterne til et regneark eller en anden analysesoftwarefil.Plot grafen og analyser dataene. Den repræsentative dynamik i iltforbrugshastigheden eller OCR indikerede ændringer i mitokondrierespirationen i muse- og humane neutrofiler såvel som udifferentierede og differentierede HL60-celler som reaktion på oligomycin, FCCP og blandingen af rotenon og antimycin A.OCR-værdierne faldt i alle celler efter oligomycinbehandling på grund af hæmningen af protonkanalen i ATP-syntase. FCCP-behandling øgede strømmen af elektroner og iltforbrug for at genoprette OCR-værdien og opnå maksimal respiration.En blanding af rotenon og antimycin A blokerede komplekser 1 og 3 i elektrontransportkæden, hvilket fører til eliminering af mitokondriel respiration. Nedsat mitokondriel respiration blev observeret i HL60-celler efter neutrofil-rettet differentiering. Differentierede HL60-celler viste sig at have signifikant lavere basal mitokondriel respiration, proton-lækagebundet respiration, ATP-bundet respiration og ikke-mitokondriel respiration.Stigningen i maksimal respiration af differentierede HL60-celler var ikke signifikant, mens den ekstra respirationskapacitet blev signifikant øget. Sørg for, at cellerne er i bunden af pladen, da sensorpatronen ikke bør have nogen forhindringer på grund af de flydende celler, mens du læser OCR-værdien. Denne teknik ville hjælpe forskere med at studere effekten af lægemidler eller mitokondriel dysfunktion i neutrofilassocierede undersøgelser.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A TIRF Microscopy Technique for Real-time, Simultaneous Imaging of the TCR and its Associated Signaling Proteins

En TIRF Mikroskopi Technique for i realtid, Samtidig Billeddannelse af TCR og dens associerede signalproteiner

Signaling is initiated through the T Cell Receptor (TCR) when it is engaged by antigenic peptide fragments bound by Major Histocompatibility Complex ...

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

Real-time Live Imaging af T-celle signalering Complex Formation

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

Bioenergetics and the Oxidative Burst: Protocols for the Isolation and Evaluation of Human Leukocytes and Platelets

Bioenergetik og oxidativ Burst: Protokoller til isolering og Evaluering af humane leukocytter og blodplader

Mitochondrial dysfunction is known to play a significant role in a number of pathological conditions such as atherosclerosis, diabetes, septic shock, and ...

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

High Throughput Måling af ekstracellulær DNA udledning og kvantitativ NET Formation i humane neutrofiler<em&gt; In vitro</em

Neutrophil granulocytes are the most abundant leukocytes in the human blood. Neutrophils are the first to arrive at the site of infection. Neutrophils ...

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

Imaging neutrofiler og monocytter i Mesenterial Veins af Intravital Mikroskopi på bedøvede mus i Real Time

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

Measuring Dengue Virus RNA in the Culture Supernatant of Infected Cells by Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction

Måling af Dengue Virus RNA i cellekultur Supernatant af inficerede celler ved Real-time kvantitativ Polymerase Chain Reaction

At present, real-time polymerase chain reaction (PCR) technology is an indispensable tool for the detection and quantification of viral genomes in ...

Robust Ligature-Induced Model of Murine Periodontitis for the Evaluation of Oral Neutrophils

Robust ligatur-induceret model af murine periodontitis til evaluering af orale neutrofiler

The main advantages of studying the pathophysiology of periodontal disease utilizing murine models are the reduced cost of animals, array of genetically ...

Pan-lyssavirus Real Time RT-PCR for Rabies Diagnosis

Pan-lyssavirus realtid RT-PCR for rabies diagnose

Molecular assays are rapid, sensitive and specific, and have become central to diagnosing rabies. PCR based assays have been utilized for decades to ...

Monitoring Influenza Virus Survival Outside the Host Using Real-Time Cell Analysis

Overvågning af influenzavirusoverlevelse uden for værten ved hjælp af celleanalyse i realtid

Methods for virus particle quantification represent a critical aspect of many virology studies. Although several reliable techniques exist, they are ...

Real-Time Quantification of Reactive Oxygen Species in Neutrophils Infected with Meningitic Escherichia Coli

Real-Time Quantification of Reactive Oxygen Species in Neutrophils Infected with Meningitic Escherichia Coli

Real-Time kvantificering af reaktive iltarter i neutrofiler inficeret med meningitiske Escherichia Coli

Escherichia coli (E. coli) is the most common Gram-negative bacteria causing neonatal meningitis. The occurrence of bacteremia and bacterial penetration ...