Name: real-time measurement of the mitochondrial bioenergetic profile of neutrophils
Uploaded: 2023-06-02T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real-Time Measurement of the Mitochondrial Bioenergetic Profile of Neutrophils at JoVE.com

We erkennen Dr. Anthony T. Vella en Dr. Federica Aglianoin van de afdeling Immunologie van UConn Health voor hun training in het gebruik van de metabole extracellulaire fluxanalysator, en Dr. Lynn Puddington van de afdeling Immunologie van UConn Health voor haar ondersteuning van de instrumenten. We erkennen Dr. Geneva Hargis van UConn School of Medicine voor haar hulp bij het wetenschappelijk schrijven en redigeren van dit manuscript. Dit onderzoek werd ondersteund door subsidies van de National Institutes of Health, National Heart, Lung, and Blood Institute (R01HL145454), National Institute of General Medical Sciences (R35GM147713 and P20GM139763), een startup-fonds van UConn Health en een Career re-entry fellowship van de American Association of Immunologists.

Gehepariniseerde volbloedmonsters werden verkregen van gezonde menselijke donoren na het verkrijgen van geïnformeerde toestemming, zoals goedgekeurd door de Institutional Review Board van UConn Health in overeenstemming met de Verklaring van Helsinki. Alle dierproeven volgden de richtlijnen van de UConn Health Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) en goedkeuring voor het gebruik van knaagdieren werd verkregen van de UConn Health IACUC volgens de criteria die zijn uiteengezet in de Guide for the Care and Us...

De standaardprocedure die de mitochondriale ademhaling van neutrofielen meet met behulp van de metabole extracellulaire fluxanalysator wordt beperkt door vele factoren, waaronder celaantal, celgroei en levensvatbaarheid. Elke concentratie van de verbinding varieert tussen het type en de bron van de cellen in deze test. Oligomycine en rotenon/antimycine A worden meestal gebruikt in een vergelijkbare concentratie bij de meeste celtypen. Omdat de door FCCP geïnduceerde maximale ademhalingsfrequentie echter varieert tussen...

Mitochondriën spelen een belangrijke rol in celbio-energetica, die adenosinetrifosfaat (ATP) genereert door oxidatieve fosforylering (OXPHOS). Daarnaast strekt de rol van mitochondriën zich uit tot de generatie en ontgifting van reactieve zuurstofsoorten, cytoplasmatische en mitochondriale matrixcalciumregulatie, cellulaire synthese, katabolisme en het transport van metabolieten in de cel1. Mitochondriale ademhaling is essentieel in alle cellen, omdat hun disfunctie kan leiden tot metabole problemen 2, waaronder hart- en vaatziekten3 en een breed scala aan neurodegeneratieve ziekten, zoals leeftijdsgebonden maculaire degeneratie4, de ziekte van Parkinson en Alzheimer5 en de ziekte van Charcot-Marie-Tooth2 A (CMT2A)6.
Elektronenmicroscopische studies op neutrofielen onthulden dat er relatief weinig mitochondriën7 zijn en dat ze sterk afhankelijk zijn van glycolyse voor hun energieproductie, omdat mitochondriale ademhalingssnelheden erg laag zijn8. Mitochondriën zijn echter cruciaal voor neutrofiele functies, zoals chemotaxis9 en apoptose10,11,12. Een eerdere studie onthulde een complex mitochondriaal netwerk in menselijke neutrofielen met een hoog membraanpotentiaal. Het mitochondriale membraanpotentiaalverlies is een vroege indicator van neutrofiele apoptose10. Behandeling met mitochondriale uncoupler carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazone (CCCP) toonde significante remming in chemotaxis, samen met een verandering in mitochondriale morfologie 9,10.
Hoewel de primaire energiebron voor neutrofielen glycolyse is, leveren mitochondriën de ATP die neutrofiele activering initieert door de eerste fase van purinerge signalering te voeden, die Ca2 + -signalering verhoogt, mitochondriale ATP-productie versterkt en neutrofiele functionele responsen initieert13. Disfunctie van de mitochondriale ademhalingsketen resulteert in overmatige productie van toxische reactieve zuurstofsoorten (ROS) en leidt tot pathogene schade14,15,16. NETosis, het proces van het vormen van neutrofiele extracellulaire vallen (NET's), is een kritieke eigenschap van neutrofielen die hen helpt te vechten tegen pathogenen17 en bijdraagt aan vele pathologische aandoeningen, waaronder kanker, trombose en auto-immuunziekten18. Mitochondriaal afgeleide ROS dragen bij aan NETosis19, mitochondriaal DNA kan een onderdeel zijn van NETs18, en veranderde mitochondriale homeostase schaadt NETosis 20,21,22,23,24. Bovendien wordt tijdens normale differentiatie of rijping de metabole herprogrammering van neutrofielen omgekeerd door de glycolytische activiteit te beperken, en ze houden zich bezig met mitochondriale ademhaling en mobiliseren intracellulaire lipiden25,26.
De metabole extracellulaire fluxanalysator kan continu de mitochondriale ademhaling en glycolyse van levende cellen controleren en kwantificeren. De analyzer maakt gebruik van een 96-well plaatformaat sensorpatroon en twee fluoroforen om zuurstof (O2) concentratie en pH-veranderingen te kwantificeren. De sensorcartridge bevindt zich tijdens de test boven de celmonolaag en vormt een ~200 nm hoge microkamer. De optische vezelbundels in de analyzer worden gebruikt om de fluoroforen te prikkelen en de fluorescerende intensiteitsveranderingen te detecteren. Real-time veranderingen in O2-concentratie en pH worden automatisch berekend en weergegeven als zuurstofverbruikssnelheid (OCR) en extracellulaire verzuringssnelheid (ECAR). Er zijn vier poorten op de sensorcartridge waarmee tijdens de testmetingen maximaal vier verbindingen in elke put kunnen worden geladen. Dit protocol richt zich op het kwantificeren van de mitochondriale ademhaling van muis- en menselijke neutrofielen, evenals de neutrofielachtige HL60-cellen, met behulp van de metabole extracellulaire fluxanalysator.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>37 &#176;C non-CO2&#160;incubator</td>
			<td>Precision</td>
			<td>Economy Model 2EG</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biorender</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Software Application</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Model 5810R</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#160;Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive</td>
			<td>Corning</td>
			<td>102416-100</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep Magnet</td>
			<td>STEMCELL</td>
			<td>18000</td>
			<td>Magnet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySepMouse Neutrophil Enrichment kit</td>
			<td>STEMCELL</td>
			<td>19762A</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad Prism 9</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Software Application</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Serum Albumin Solution (25%)</td>
			<td>GeminiBio</td>
			<td>800-120</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine (VetaKet)</td>
			<td>DAILYMED</td>
			<td>NDC 59399-114-10</td>
			<td>Anesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>SH30256.01</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate buckets</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>UL155</td>
			<td>Accessory</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PolymorphPrep</td>
			<td>PROGEN</td>
			<td>1895 (previous 1114683)</td>
			<td>polysaccharide solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified mouse anti-human CD18 antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>302102</td>
			<td>Clone TS1/18</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11-875-093</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse metabolic extracellular flux analyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>XFe96</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF Cell Mito Stress Test Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>103015-100</td>
			<td>mitochondrial stress test Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swing-bucket rotor</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>A-4-62</td>
			<td>Rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vactrap 2 Vacum Trap</td>
			<td>Fox Lifesciences</td>
			<td>3052101-FLS</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wave</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Software Application</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF 1.0 M Glucose Solution</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>103577-100</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF 100 mM Pyruvate Solution</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>103578-100</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF 200 mM Glutamine Solution</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>103579-100</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF DMEM medium</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>103575-100</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XFe96 FluxPak</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>102601-100</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine (AnaSed Injection)</td>
			<td>DAILYMED</td>
			<td>NDC 59399-110-20</td>
			<td>Anesthetic</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time measurement of the mitochondrial bioenergetic profile of neutrophils

Neutrofielen zijn de eerste verdedigingslinie en de meest voorkomende leukocyten bij de mens. Deze effectorcellen voeren functies uit zoals fagocytose en oxidatieve burst en creëren neutrofiele extracellulaire vallen (NET's) voor microbiële klaring. Nieuwe inzichten in de metabole activiteiten van neutrofielen dagen het vroege concept uit dat ze voornamelijk afhankelijk zijn van glycolyse. Nauwkeurige meting van metabole activiteiten kan verschillende metabole behoeften van neutrofielen ontvouwen, waaronder de tricarbonzuur (TCA) cyclus (ook bekend als de Krebs-cyclus), oxidatieve fosforylering (OXPHOS), pentosefosfaatroute (PPP) en vetzuuroxidatie (FAO) onder fysiologische omstandigheden en in ziektetoestanden. Dit artikel beschrijft een stapsgewijs protocol en vereisten om de zuurstofverbruikssnelheid (OCR) te meten als een indicator van mitochondriale ademhaling op van het beenmerg afgeleide neutrofielen van muizen, van menselijk bloed afgeleide neutrofielen en de neutrofielachtige HL60-cellijn, met behulp van metabole fluxanalyse op een metabole extracellulaire fluxanalysator. Deze methode kan worden gebruikt voor het kwantificeren van de mitochondriale functies van neutrofielen onder normale en ziekteomstandigheden.

Representatieve OCR-dynamiek wordt getoond met de mitochondriale ademhalingsveranderingen in reactie op oligomycine, FCCP en rotenon / antimycine Een mengsel van muisneutrofielen (figuur 3A), menselijke neutrofielen (figuur 3B) en ongedifferentieerde en gedifferentieerde HL60-cellen (figuur 3C). In alle cellen verlaagt oligomycinebehandeling de OCR-waarde door het protonkanaal van ATP-synthase te remmen; FCCP-behandeling herstelt de...

Watch this Scientific Journal Video about Real-Time Measurement of the Mitochondrial Bioenergetic Profile of Neutrophils at JoVE.com

Real-Time Measurement of the Mitochondrial Bioenergetic Profile of Neutrophils

We beschrijven stapsgewijze protocollen die de mitochondriale ademhaling van muis en menselijke neutrofielen en HL60-cellen meten met behulp van de metabole extracellulaire fluxanalysator.

Real-time meting van het mitochondriale bio-energetische profiel van neutrofielen

Neutrophils are the first line of defense and the most abundant leukocytes in humans. These effector cells perform functions such as phagocytosis and ...

Dit protocol richt zich op het kwantificeren van mitochondriale ademhaling van muis en menselijke neutrofielen, evenals neutrofielachtige HL60-cellen met behulp van de metabole extracellulaire fluxanalysator. Deze methode stelt ons in staat om de mitochondriale functie in neutrofielen onder normale en ziekteomstandigheden te kwantificeren. Dit is een eenvoudige techniek die inzicht kan geven in de mitochondriale functie van de cellen als reactie op medicijnen of een ziekteaandoening.Omdat verschillende cellen verschillende mitochondriale ademhalingsefficiëntie hebben, moet de optimalisatie van de celzaaidichtheid en de reagensconcentratie nauwkeurig worden uitgevoerd om resultaten van hoge kwaliteit te krijgen. Om de metabole extracellulaire fluxtest te starten, neemt u een sensorpatroon verpakt over een speciaal ontworpen 96-putplaat en brengt u 200 microliter kalibratiemedium over in elk putje van de onderliggende plaat. Til de patroon en de plaat voorzichtig op met calibrant en plaats deze 's nachts in een niet-kooldioxide bevochtigde 37 graden Celsius incubator voor hydratatie.Vervolgens bekleedt u op basis van het celtype de 96-well-plaat met een specifieke coating om de celhechting te garanderen. Was daarna de borden twee keer met 200 microliter steriele PBS. Bereid het testmedium in DMEM met één millimolair pyruvaat, 10 millimolar glucose en twee millimolaire glutamine.Verkrijg de muis- en menselijke neutrofielencellen zoals beschreven in het tekstmanuscript. Voor de neutrofielen verkregen uit de muis, past u de celdichtheid aan tot 1,1 maal 10 tot de zesde cellen per milliliter door testmedium toe te voegen. Zaai vervolgens 180 microliter van de neutrofiele suspensie van de muis per put in de voorbereide 96-putplaat.Pas op dezelfde manier de menselijke neutrofiele celdichtheid aan tot 2,2 keer 10 tot de zesde cellen per milliliter met behulp van het testmedium. Tel op de dag van de test de neutrofielachtige HL60-cellen handmatig met behulp van de hemocytometer. Centrifugeer vervolgens de gedifferentieerde of ongedifferentieerde HL60-cellen bij 300 G bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten.Was de cellen eenmaal met DMEM en suspensie ze opnieuw in het testmedium om een celdichtheid van 1,39 maal 10 tot de zesde cel per milliliter te bereiken. Zaai vervolgens 180 microliter gedifferentieerde of ongedifferentieerde HL60-cellen in de vooraf voorbereide 96-putplaat met de muizen- en menselijke neutrofielenmonsters. Voeg ten slotte volledig medium toe aan de hoekputten van de celkweekplaat zonder cellen voor achtergrondcorrectie tijdens het zaaien.Centrifugeer de plaat op 300 G bij kamertemperatuur gedurende drie minuten zonder onderbreking om een goede hechting van de cellen aan de onderkant van de plaat te garanderen. Incubeer ten slotte de plaat gedurende een uur om de cellen vooraf in evenwicht te brengen met het testmedium. Open de mitochondriale stresstestkit en bereid de reagentia voor volgens de instructies van de fabrikant.Laad vervolgens de patroon met reagentia, te beginnen met het bereide oligomycine in poort A, FCCP in poort B en rotenon / antimycine A-mengsel in poort C voor injecties. Vul de ongebruikte poorten met 20 microliter testmedium. Breng het testsysteem ten minste vijf uur voor de test in evenwicht bij 37 graden Celsius door de Wave-software te openen en op het tabblad Heater On te klikken.Na het bereiken van de temperatuur toont de linkerbenedenhoek van de Wave-software gereed. Open een sjabloon voor de mitochondriale stresstestkit in de software. Selecteer injectiestrategieën aan de linkerkant, klik vervolgens op Toevoegen en geef de injectieconditie een naam als menselijke neutrofielen of muisneutrofielen of HL60.Selecteer poort A tot D door op elk te klikken en klik op Verbinding toevoegen en voer oligomycine of FCCP of rotenon / antimycine A in met de respectieve concentraties. Selecteer Voorbehandeling aan de linkerkant, klik vervolgens op Toevoegen en geef ze cd18 en cell tak afzonderlijk een naam. Selecteer het celtype aan de linkerkant.Klik vervolgens op Toevoegen en noem ze menselijke neutrofielen, muisneutrofielen en HL60 of DHL60 met een voedingsdichtheid indien van toepassing. Definieer de groepen door op Groep toevoegen te klikken. Klik vervolgens op de onderstreepte definitie.Klik op Plaatkaart in het bovenste menu om alle groepen met definities aan de linkerkant en de plaatkaart aan de rechterkant te observeren. Sleep en zet neer om elk putje aan de groep toe te voegen met behoud van de vier hoekputten als achtergrond. Als u het protocol wilt instellen, selecteert u het tabblad Protocol in het bovenste menu en definieert u drie cycli van baseline, oligomycine, FCCP, rotenon en antimycine A-mengsel, door de tijd in te stellen om te mengen als drie minuten, rust als nul minuten en meting als zeven minuten.Ga naar de pagina Test uitvoeren, geef de informatie over het projectoverzicht op ter referentie en klik op Uitvoeren starten. Geef de locatie op om de bestanden op te slaan, zodat alle resultaten worden opgeslagen na voltooiing van de test. Klik vervolgens opnieuw op Start Run.Wacht na het automatisch laden van de test tot de lade is geopend om de sensorcartridge en -plaat met 200 microliter kalibrant te plaatsen. Stel de richting van de streepjescode van de cartridge naar rechts in. Voer de kalibratie uit door op Ik ben klaar te klikken, wat ongeveer 20 minuten duurt.Klik na de kalibratie op Open Tray, vervang de plaat door de celzaadplaat en klik op I'm Ready om door te gaan met de test. Na het voltooien van de test worden de gegevens automatisch opgeslagen. Exporteer de resultaten naar een spreadsheet of ander analysesoftwarebestand.Plot de grafiek en analyseer de gegevens. De representatieve dynamiek van zuurstofverbruikssnelheid of OCR duidde op veranderingen in de mitochondriale ademhaling bij muizen en menselijke neutrofielen, evenals ongedifferentieerde en gedifferentieerde HL60-cellen als reactie op oligomycine, FCCP en het mengsel van rotenon en antimycine A.De OCR-waarden daalden in alle cellen na behandeling met oligomycine als gevolg van de remming van het protonkanaal van ATP-synthase. FCCP-behandeling verhoogde de stroom van elektronen en zuurstofverbruik om de OCR-waarde te herstellen en maximale ademhaling te bereiken.Een mengsel van rotenon en antimycine A blokkeerde complexen 1 en 3 van de elektronentransportketen, wat leidt tot de eliminatie van mitochondriale ademhaling. Verminderde mitochondriale ademhaling werd waargenomen in HL60-cellen na neutrofielgerichte differentiatie. Gedifferentieerde HL60-cellen bleken significant lagere basale mitochondriale ademhaling, protonlekgekoppelde ademhaling, ATP-gekoppelde ademhaling en niet-mitochondriale ademhaling te hebben.De toename van de maximale ademhaling van gedifferentieerde HL60-cellen was niet substantieel, terwijl de reserve ademhalingscapaciteit aanzienlijk was toegenomen. Zorg ervoor dat de cellen zich aan de onderkant van de plaat bevinden, omdat de sensorcartridge geen obstakels mag hebben vanwege de zwevende cellen tijdens het lezen van de OCR-waarde. Deze techniek zou onderzoekers helpen om het effect van geneesmiddelen of mitochondriale disfunctie in neutrofiel-geassocieerde studies te bestuderen.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A TIRF Microscopy Technique for Real-time, Simultaneous Imaging of the TCR and its Associated Signaling Proteins

Een TIRF Microscopie Techniek voor Real-time, gelijktijdige beeldvorming van de TCR en de bijbehorende signaaleiwitten

Signaling is initiated through the T Cell Receptor (TCR) when it is engaged by antigenic peptide fragments bound by Major Histocompatibility Complex ...

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

Real-time Live beeldvorming van T-cel signaleringscomplex Vorming

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

Bioenergetics and the Oxidative Burst: Protocols for the Isolation and Evaluation of Human Leukocytes and Platelets

Bio-energetica en de oxidatieve Burst: Protocollen voor de Isolatie en evaluatie van menselijke leukocyten en bloedplaatjes

Mitochondrial dysfunction is known to play a significant role in a number of pathological conditions such as atherosclerosis, diabetes, septic shock, and ...

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

High Throughput Meting van extracellulaire DNA los en Kwantitatieve NET Formation in menselijke neutrofielen<em&gt; In Vitro</em

Neutrophil granulocytes are the most abundant leukocytes in the human blood. Neutrophils are the first to arrive at the site of infection. Neutrophils ...

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

Beeldvorming van neutrofielen en monocyten in Mesenteriale Veins door Intravitale Microscopie op verdoofd muizen in Real Time

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

Measuring Dengue Virus RNA in the Culture Supernatant of Infected Cells by Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction

Meten van Dengue Virus RNA in het Supernatant van cultuur van geïnfecteerde cellen door Real-time kwantitatieve Polymerase-kettingreactie

At present, real-time polymerase chain reaction (PCR) technology is an indispensable tool for the detection and quantification of viral genomes in ...

Robust Ligature-Induced Model of Murine Periodontitis for the Evaluation of Oral Neutrophils

Robuust, ligatuur-geïnduceerde model van lymfklier-periodontitis voor de evaluatie van orale neutrofielen

The main advantages of studying the pathophysiology of periodontal disease utilizing murine models are the reduced cost of animals, array of genetically ...

Pan-lyssavirus Real Time RT-PCR for Rabies Diagnosis

Pan-Lyssavirus real time RT-PCR voor rabiës diagnose

Molecular assays are rapid, sensitive and specific, and have become central to diagnosing rabies. PCR based assays have been utilized for decades to ...

Monitoring Influenza Virus Survival Outside the Host Using Real-Time Cell Analysis

Monitoring influenzavirusoverleving buiten de gastheer met behulp van real-time celanalyse

Methods for virus particle quantification represent a critical aspect of many virology studies. Although several reliable techniques exist, they are ...

Real-Time Quantification of Reactive Oxygen Species in Neutrophils Infected with Meningitic Escherichia Coli

Real-Time Quantification of Reactive Oxygen Species in Neutrophils Infected with Meningitic Escherichia Coli

Real-time kwantificering van reactieve zuurstofsoorten bij neutrofielen besmet met meningitische Escherichia Coli

Escherichia coli (E. coli) is the most common Gram-negative bacteria causing neonatal meningitis. The occurrence of bacteremia and bacterial penetration ...