Name: real-time measurement of the mitochondrial bioenergetic profile of neutrophils
Uploaded: 2023-06-02T13:00:00
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Nous remercions le Dr Anthony T. Vella et la Dre Federica Aglianoin du Département d’immunologie de UConn Health pour leur formation à l’utilisation de l’analyseur de flux extracellulaire métabolique, et la Dre Lynn Puddington du Département d’immunologie de UConn Health pour son soutien aux instruments. Nous remercions le Dr Geneva Hargis de l’École de médecine de l’UConn pour son aide dans la rédaction scientifique et l’édition de ce manuscrit. Cette recherche a été soutenue par des subventions des National Institutes of Health, du National Heart, Lung, and Blood Institute (R01HL145454), de l’Institut national des sciences médicales générales (R35GM147713 et P20GM139763), d’un fonds de démarrage de UConn Health et d’une bourse de rentrée professionnelle de l’American Association of Immunologists.

Des échantillons de sang total héparinés ont été prélevés sur des donneurs humains sains après avoir obtenu un consentement éclairé, tel qu’approuvé par le comité d’examen institutionnel de UConn Health conformément à la Déclaration d’Helsinki. Toutes les expériences sur les animaux ont suivi les lignes directrices du Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux (IACUC) de UConn Health, et l’approbation de l’utilisation de rongeurs a été obtenue de l’UConn Health IACUC selon...

La procédure standard qui mesure la respiration mitochondriale des neutrophiles à l’aide de l’analyseur de flux extracellulaire métabolique est limitée par de nombreux facteurs, notamment le nombre de cellules, la croissance cellulaire et la viabilité. La concentration de chaque composé varie selon le type et la source des cellules dans ce test. L’oligomycine et la roténone/antimycine A sont principalement utilisées à une concentration similaire dans la plupart des types de cellules. Cependant, comme la f...

Les mitochondries jouent un rôle majeur dans la bioénergétique cellulaire, qui génère de l’adénosine triphosphate (ATP) par phosphorylation oxydative (OXPHOS). En plus de cela, le rôle des mitochondries s’étend à la génération et à la détoxification des espèces réactives de l’oxygène, à la régulation du calcium dans la matrice cytoplasmique et mitochondriale, à la synthèse cellulaire, au catabolisme et au transport des métabolites dans la cellule1. La respiration mitochondriale est essentielle dans toutes les cellules, car leur dysfonctionnement peut entraîner des problèmes métaboliques 2, dont des maladies cardiovasculaires3 et une grande variété de maladies neurodégénératives, telles que la dégénérescence maculaire liée à l’âge4, les maladies de Parkinson et d’Alzheimer5 et la maladie de Charcot-Marie-Tooth2 A (CMT2A)6.
Des études de microscopie électronique sur les neutrophiles ont révélé qu’il y a relativement peu de mitochondries7, et qu’elles dépendent fortement de la glycolyse pour leur production d’énergie car les taux de respiration mitochondriale sont très faibles8. Cependant, les mitochondries sont cruciales pour les fonctions des neutrophiles, telles que la chimiotaxie9 et l’apoptose10,11,12. Une étude antérieure a révélé un réseau mitochondrial complexe dans les neutrophiles humains à fort potentiel membranaire. La perte potentielle de la membrane mitochondriale est un indicateur précoce de l’apoptose des neutrophiles10. Le traitement par découpleur mitochondrial carbonyl cyanure m-chlorophényl hydrazone (CCCP) a montré une inhibition significative de la chimiotaxie, ainsi qu’une modification de la morphologie mitochondriale 9,10.
Bien que la principale source d’énergie pour les neutrophiles soit la glycolyse, les mitochondries fournissent l’ATP qui initie l’activation des neutrophiles en alimentant la première phase de la signalisation purinergique, qui stimule la signalisation Ca2+, amplifie la production d’ATP mitochondrial et initie les réponses fonctionnelles des neutrophiles13. Le dysfonctionnement de la chaîne respiratoire mitochondriale entraîne une production excessive d’espèces réactives toxiques de l’oxygène (ROS) et entraîne des dommages pathogènes14,15,16. NETosis, qui est le processus de formation de pièges extracellulaires (TNE) de neutrophiles, est une propriété essentielle des neutrophiles qui les aide à lutter contre les agents pathogènes17 et contribue à de nombreuses pathologies, y compris le cancer, la thrombose et les maladies auto-immunes18. Les ROS dérivés des mitochondries contribuent à NETosis19, l’ADN mitochondrial peut être un composant des NETs18, et l’homéostasie mitochondriale altérée altère NETosis 20,21,22,23,24. De plus, lors de la différenciation ou de la maturation normale, la reprogrammation métabolique des neutrophiles est inversée en limitant l’activité glycolytique, et ils s’engagent dans la respiration mitochondriale et mobilisent les lipides intracellulaires25,26.
L’analyseur de flux extracellulaire métabolique peut surveiller et quantifier en permanence la respiration mitochondriale et la glycolyse des cellules vivantes. L’analyseur utilise une cartouche de capteur de format plaque de 96 puits et deux fluorophores pour quantifier la concentration d’oxygène (O2) et les changements de pH. La cartouche du capteur est au-dessus de la monocouche cellulaire pendant le test et forme une microchambre de ~200 nm de haut. Les faisceaux de fibres optiques de l’analyseur sont utilisés pour exciter les fluorophores et détecter les changements d’intensité fluorescents. Les changements en temps réel de la concentration d’O2 et du pH sont automatiquement calculés et affichés sous forme de taux de consommation d’oxygène (OCR) et de taux d’acidification extracellulaire (ECAR). Il y a quatre ports sur la cartouche de capteur qui permettent de charger jusqu’à quatre composés dans chaque puits pendant les mesures de dosage. Ce protocole se concentre sur la quantification de la respiration mitochondriale des neutrophiles de souris et humains, ainsi que des cellules HL60 de type neutrophile, à l’aide de l’analyseur de flux extracellulaire métabolique.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>37 &#176;C non-CO2&#160;incubator</td>
			<td>Precision</td>
			<td>Economy Model 2EG</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biorender</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Software Application</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Model 5810R</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#160;Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive</td>
			<td>Corning</td>
			<td>102416-100</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep Magnet</td>
			<td>STEMCELL</td>
			<td>18000</td>
			<td>Magnet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySepMouse Neutrophil Enrichment kit</td>
			<td>STEMCELL</td>
			<td>19762A</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad Prism 9</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Software Application</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Serum Albumin Solution (25%)</td>
			<td>GeminiBio</td>
			<td>800-120</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine (VetaKet)</td>
			<td>DAILYMED</td>
			<td>NDC 59399-114-10</td>
			<td>Anesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>SH30256.01</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate buckets</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>UL155</td>
			<td>Accessory</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PolymorphPrep</td>
			<td>PROGEN</td>
			<td>1895 (previous 1114683)</td>
			<td>polysaccharide solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified mouse anti-human CD18 antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>302102</td>
			<td>Clone TS1/18</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11-875-093</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse metabolic extracellular flux analyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>XFe96</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF Cell Mito Stress Test Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>103015-100</td>
			<td>mitochondrial stress test Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swing-bucket rotor</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>A-4-62</td>
			<td>Rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vactrap 2 Vacum Trap</td>
			<td>Fox Lifesciences</td>
			<td>3052101-FLS</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wave</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Software Application</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF 1.0 M Glucose Solution</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>103577-100</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF 100 mM Pyruvate Solution</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>103578-100</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF 200 mM Glutamine Solution</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>103579-100</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF DMEM medium</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>103575-100</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XFe96 FluxPak</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>102601-100</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine (AnaSed Injection)</td>
			<td>DAILYMED</td>
			<td>NDC 59399-110-20</td>
			<td>Anesthetic</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time measurement of the mitochondrial bioenergetic profile of neutrophils

Les neutrophiles sont la première ligne de défense et les leucocytes les plus abondants chez l’homme. Ces cellules effectrices remplissent des fonctions telles que la phagocytose et l’éclatement oxydatif, et créent des pièges extracellulaires (TNE) de neutrophiles pour la clairance microbienne. De nouvelles connaissances sur les activités métaboliques des neutrophiles remettent en question le concept initial selon lequel ils reposent principalement sur la glycolyse. La mesure précise des activités métaboliques peut révéler différentes exigences métaboliques des neutrophiles, y compris le cycle de l’acide tricarboxylique (TCA) (également connu sous le nom de cycle de Krebs), la phosphorylation oxydative (OXPHOS), la voie du pentose phosphate (PPP) et l’oxydation des acides gras (FAO) dans des conditions physiologiques et dans des états pathologiques. Cet article décrit un protocole étape par étape et des prérequis pour mesurer le taux de consommation d’oxygène (OCR) en tant qu’indicateur de la respiration mitochondriale sur les neutrophiles dérivés de la moelle osseuse de souris, les neutrophiles dérivés du sang humain et la lignée cellulaire HL60 de type neutrophile, en utilisant l’analyse du flux métabolique sur un analyseur de flux extracellulaire métabolique. Cette méthode peut être utilisée pour quantifier les fonctions mitochondriales des neutrophiles dans des conditions normales et pathogènes.

Une dynamique représentative de l’OCR indique les changements respiratoires mitochondriaux en réponse à l’oligomycine, au FCCP et au mélange roténone/antimycine A de neutrophiles de souris (Figure 3A), de neutrophiles humains (Figure 3B) et de cellules HL60 indifférenciées et différenciées (Figure 3C). Dans toutes les cellules, le traitement à l’oligomycine diminue la valeur OCR en inhibant le canal protonique de l?...

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Real-Time Measurement of the Mitochondrial Bioenergetic Profile of Neutrophils

Nous décrivons des protocoles par étapes mesurant la respiration mitochondriale des neutrophiles de souris et humaines et des cellules HL60 à l’aide de l’analyseur de flux extracellulaire métabolique.

Mesure en temps réel du profil bioénergétique mitochondrial des neutrophiles

Neutrophils are the first line of defense and the most abundant leukocytes in humans. These effector cells perform functions such as phagocytosis and ...

Ce protocole se concentre sur la quantification de la respiration mitochondriale des neutrophiles de souris et humaines, ainsi que des cellules HL60 de type neutrophile à l’aide de l’analyseur de flux extracellulaire métabolique. Cette méthode nous permet de quantifier la fonction mitochondriale des neutrophiles dans des conditions normales et pathologiques. Il s’agit d’une technique simple qui peut fournir des informations sur la fonction mitochondriale des cellules en réponse à des médicaments ou à toute maladie.Étant donné que différentes cellules ont une efficacité respiratoire mitochondriale différente, l’optimisation de la densité d’ensemencement cellulaire et de la concentration de réactif doit être effectuée avec précision pour obtenir des résultats de haute qualité. Pour commencer le test de flux extracellulaire métabolique, prenez une cartouche de capteur emballée sur une plaque de 96 puits spécialement conçue et transférez 200 microlitres de milieu d’étalonnage dans chaque puits de la plaque sous-jacente. Soulevez soigneusement la cartouche et la plaque avec un calibrant et placez-la dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius sans dioxyde de carbone pendant la nuit pour l’hydratation.Ensuite, en fonction du type de cellule, enduisez la plaque à 96 puits d’un revêtement spécifique pour assurer l’adhérence de la cellule. Ensuite, lavez les assiettes avec 200 microlitres de PBS stérile deux fois. Préparer le milieu de dosage dans le DMEM avec un pyruvate millimolaire, 10 millimolaires de glucose et deux millimolaires de glutamine.Procurez-vous les cellules de neutrophiles de souris et humaines comme décrit dans le manuscrit du texte. Pour les neutrophiles obtenus de la souris, ajuster la densité cellulaire à 1,1 fois 10 à la sixième cellule par millilitre en ajoutant un milieu de dosage. Ensuite, ensemencez 180 microlitres de la suspension de neutrophiles de souris par puits dans la plaque préparée à 96 puits.De même, ajuster la densité des cellules neutrophiles humaines à 2,2 fois 10 à la sixième cellule par millilitre en utilisant le milieu de dosage. Le jour de l’essai, compter manuellement les cellules HL60 de type neutrophile à l’aide de l’hémocytomètre. Ensuite, centrifugez les cellules HL60 différenciées ou indifférenciées à 300G à température ambiante pendant cinq minutes.Lavez les cellules avec DMEM une fois et re-suspendez-les dans le milieu de dosage pour atteindre une densité cellulaire de 1,39 fois 10 à la sixième cellule par millilitre. Ensuite, ensemencez 180 microlitres de cellules HL60 différenciées ou indifférenciées dans la plaque de 96 puits pré-préparée contenant les échantillons de neutrophiles de souris et d’humains. Enfin, ajoutez un milieu complet aux puits d’angle de la plaque de culture cellulaire dépourvue de cellules pour la correction du fond pendant l’ensemencement.Centrifuger la plaque à 300G à température ambiante pendant trois minutes sans rupture pour assurer une bonne adhérence des cellules au fond de la plaque. Enfin, incuber la plaque pendant une heure pour prééquilibrer les cellules avec le milieu de dosage. Ouvrez le kit de test de stress mitochondrial et préparez les réactifs conformément aux instructions du fabricant.Ensuite, chargez la cartouche avec des réactifs, en commençant par l’oligomycine préparée dans le port A, FCCP dans le port B et le mélange roténone/antimycine A dans le port C pour les injections. Remplissez les orifices inutilisés avec 20 microlitres de milieu de dosage. Équilibrez le système de dosage à 37 degrés Celsius au moins cinq heures avant le test en ouvrant le logiciel Wave et en cliquant sur l’onglet Heater On.Après avoir atteint la température, le coin inférieur gauche du logiciel Wave est prêt. Ouvrez un modèle pour le kit de test de stress mitochondrial dans le logiciel. Sélectionnez les stratégies d’injection sur le côté gauche, puis cliquez sur Ajouter et nommez la condition d’injection en neutrophiles humains ou neutrophiles de souris ou HL60.Sélectionnez le port A à D en cliquant sur chacun, puis cliquez sur Ajouter un composé et entrez oligomycine ou FCCP ou roténone/antimycine A avec les concentrations respectives. Sélectionnez Prétraitement sur le côté gauche, puis cliquez sur Ajouter et nommez-les CD18 et Cell Tak séparément. Sélectionnez le type de cellule sur le côté gauche.Cliquez ensuite sur Ajouter et nommez-les neutrophiles humains, neutrophiles de souris et HL60 ou DHL60 avec une densité d’alimentation selon le cas. Définissez les groupes en cliquant sur Ajouter un groupe. Cliquez ensuite sur la définition soulignée.Cliquez sur Carte des plaques dans le menu supérieur pour observer tous les groupes avec les définitions sur le côté gauche et la carte des plaques sur la droite. Faites glisser et déposez pour ajouter chaque puits au groupe tout en conservant les quatre puits d’angle comme arrière-plan. Pour configurer le protocole, sélectionnez l’onglet Protocole dans le menu supérieur et définissez trois cycles de mélange, oligomycine, FCCP, roténone et antimycine A, en définissant le temps de mélange sur trois minutes, le repos sur zéro minute et la mesure sur sept minutes.Accédez à la page Exécuter le test, fournissez les informations récapitulatives du projet à titre de référence, puis cliquez sur Démarrer l’exécution. Indiquez l’emplacement d’enregistrement des fichiers afin que tous les résultats soient enregistrés une fois le test terminé. Cliquez ensuite à nouveau sur Démarrer l’exécution.Après le chargement automatique du test, attendez que le plateau s’ouvre pour placer la cartouche et la plaque du capteur avec 200 microlitres d’étalonnage. Réglez la direction du code-barres de la cartouche vers la droite. Exécutez l’étalonnage en cliquant sur Je suis prêt, ce qui prend environ 20 minutes.Après l’étalonnage, cliquez sur Ouvrir le bac, remplacez la plaque par la plaque ensemencée par la cellule, puis cliquez sur Je suis prêt pour continuer le test. Une fois le test terminé, les données sont automatiquement enregistrées. Exportez les résultats vers une feuille de calcul ou un autre fichier logiciel d’analyse.Tracez le graphique et analysez les données. La dynamique représentative du taux de consommation d’oxygène ou OCR a indiqué des changements dans la respiration mitochondriale chez les neutrophiles de souris et humains, ainsi que dans les cellules HL60 indifférenciées et différenciées en réponse à l’oligomycine, au FCCP et au mélange de roténone et d’antimycine A.Les valeurs OCR ont diminué dans toutes les cellules après le traitement à l’oligomycine en raison de l’inhibition du canal protonique de l’ATP synthase. Le traitement FCCP a augmenté le flux d’électrons et la consommation d’oxygène pour restaurer la valeur OCR et obtenir une respiration maximale.Un mélange de roténone et d’antimycine A a bloqué les complexes 1 et 3 de la chaîne de transport d’électrons, conduisant à l’élimination de la respiration mitochondriale. Une diminution de la respiration mitochondriale a été observée dans les cellules HL60 après différenciation dirigée par les neutrophiles. Les cellules HL60 différenciées se sont avérées avoir une respiration mitochondriale basale significativement inférieure, une respiration liée à une fuite de protons, une respiration liée à l’ATP et une respiration non mitochondriale.L’augmentation de la respiration maximale des cellules HL60 différenciées n’était pas substantielle, tandis que la capacité respiratoire de réserve était significativement augmentée. Assurez-vous que les cellules sont au bas de la plaque, car la cartouche de capteur ne doit pas avoir d’obstacles dus aux cellules flottantes lors de la lecture de la valeur OCR. Cette technique aiderait les chercheurs à étudier l’effet des médicaments ou du dysfonctionnement mitochondrial dans les études associées aux neutrophiles.

Research

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High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

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High Throughput Mesure de l&#39;ADN extracellulaire de sortie et quantitative Formation NET dans les neutrophiles humains<em&gt; In vitro</em

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Real-Time Quantification of Reactive Oxygen Species in Neutrophils Infected with Meningitic Escherichia Coli

Real-Time Quantification of Reactive Oxygen Species in Neutrophils Infected with Meningitic Escherichia Coli

Quantification en temps réel des espèces réactives d’oxygène dans les neutrophiles infectés par escherichia coli méningitique

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