Name: real-time measurement of the mitochondrial bioenergetic profile of neutrophils
Uploaded: 2023-06-02T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real-Time Measurement of the Mitochondrial Bioenergetic Profile of Neutrophils at JoVE.com

हम यूकॉन हेल्थ में इम्यूनोलॉजी विभाग से डॉ एंथनी टी वेला और डॉ फेडेरिका एग्लियानिन को चयापचय बाह्य प्रवाह विश्लेषक का उपयोग करने में उनके प्रशिक्षण के लिए और यूकॉन हेल्थ में इम्यूनोलॉजी विभाग में डॉ लिन पुडिंगटन को उपकरणों के समर्थन के लिए स्वीकार करते हैं। हम इस पांडुलिपि के वैज्ञानिक लेखन और संपादन में मदद के लिए यूकॉन स्कूल ऑफ मेडिसिन से डॉ जिनेवा हारजिस को स्वीकार करते हैं। इस शोध को नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ, नेशनल हार्ट, लंग एंड ब्लड इंस्टीट्यूट (R01HL145454), नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ जनरल मेडिकल साइंसेज (R35GM147713 और P20GM139763), यूकॉन हेल्थ से एक स्टार्टअप फंड और अमेरिकन एसोसिएशन ऑफ इम्यूनोलॉजिस्ट से करियर री-एंट्री फैलोशिप से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।

हेलसिंकी की घोषणा के अनुसार यूकॉन हेल्थ के संस्थागत समीक्षा बोर्ड द्वारा अनुमोदित सूचित सहमति प्राप्त करने के बाद स्वस्थ मानव दाताओं से हेपरिनाइज्ड पूरे रक्त के नमूने प्राप्त किए गए थे। सभी पशु प्रय...

मानक प्रक्रिया जो चयापचय बाह्य प्रवाह विश्लेषक का उपयोग करके न्यूट्रोफिल के माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन को मापती है, सेल संख्या, कोशिका वृद्धि और व्यवहार्यता सहित कई कारकों द्वारा सीमित है। प्रत्येक यौग?...

माइटोकॉन्ड्रिया सेल बायोएनर्जेटिक में एक प्रमुख भूमिका निभाते हैं, जो ऑक्सीडेटिव फॉस्फोराइलेशन (ओएक्सपीओएस) द्वारा एडेनोसिन ट्राइफॉस्फेट (एटीपी) उत्पन्न करता है। इसके अलावा, माइटोकॉन्ड्रिया की भूमिका प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों, साइटोप्लाज्मिक और माइटोकॉन्ड्रियल मैट्रिक्स कैल्शियम विनियमन, सेलुलर संश्लेषण, अपचय और सेल1 के भीतर मेटाबोलाइट्स के परिवहन के उत्पादन और विषहरण में फैली हुई है। माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन सभी कोशिकाओं में आवश्यक है, क्योंकि उनकी शिथिलता के परिणामस्वरूप चयापचय संबंधी समस्याएंहो सकती हैं2, जिसमें हृदय रोग3 और विभिन्न प्रकार के न्यूरोडीजेनेरेटिव रोग शामिल हैं, जैसे कि उम्र से संबंधित मैकुलर अपघटन4, पार्किंसंस और अल्जाइमर रोग5, और चारकोट-मैरी-टूथ रोग 2 ए (सीएमटी 2 ए)6।
न्यूट्रोफिल पर इलेक्ट्रॉन सूक्ष्म अध्ययन से पता चला है कि अपेक्षाकृत कम माइटोकॉन्ड्रिया7 हैं, और वे अपने ऊर्जा उत्पादन के लिए ग्लाइकोलाइसिस पर बहुत अधिक निर्भर करते हैं क्योंकि माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन दरबहुत कम है। हालांकि, न्यूट्रोफिल कार्यों के लिए माइटोकॉन्ड्रिया महत्वपूर्ण हैं, जैसे कि केमोटैक्सिस9 और एपोप्टोसिस10,11,12। एक पिछले अध्ययन में उच्च झिल्ली क्षमता वाले मानव न्यूट्रोफिल में एक जटिल माइटोकॉन्ड्रियल नेटवर्क का पता चला। माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली संभावित हानि न्यूट्रोफिल एपोप्टोसिस10 का एक प्रारंभिक संकेतक है। माइटोकॉन्ड्रियल अनकपलर कार्बोनिल साइनाइड एम-क्लोरोफिनाइल हाइड्राज़ोन (सीसीसीपी) के साथ उपचार ने माइटोकॉन्ड्रियल आकृति विज्ञान 9,10 में बदलाव के साथ-साथ केमोटैक्सिस में महत्वपूर्ण अवरोध दिखाया।
यद्यपि न्यूट्रोफिल के लिए प्राथमिक ऊर्जा स्रोत ग्लाइकोलाइसिस है, माइटोकॉन्ड्रिया एटीपी प्रदान करता है जो प्यूरीनर्जिक सिग्नलिंग के पहले चरण को ईंधन देकर न्यूट्रोफिल सक्रियण शुरू करता है, जो सीए2 + सिग्नलिंग को बढ़ाता है, माइटोकॉन्ड्रियल एटीपी उत्पादन को बढ़ाता है, और न्यूट्रोफिलकार्यात्मक प्रतिक्रियाओं को शुरू करता है। माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन श्रृंखला की शिथिलता के परिणामस्वरूप विषाक्त प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) का अत्यधिक उत्पादन होता है और रोगजनक क्षति14,15,16 की ओर जाता है। एनईटोसिस, जो न्यूट्रोफिल एक्स्ट्रासेल्युलर ट्रैप (एनईटी) बनाने की प्रक्रिया है, न्यूट्रोफिल की एक महत्वपूर्ण संपत्ति है जो उन्हें रोगजनकों17 से लड़ने में मदद करती है और कैंसर, घनास्त्रता और ऑटोइम्यूनविकारों सहित कई रोग स्थितियों में योगदान देती है। माइटोकॉन्ड्रियल-व्युत्पन्न आरओएस एनईटोसिस19 में योगदान देता है, माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए एनईटी18 का एक घटक हो सकता है, और परिवर्तित माइटोकॉन्ड्रियल होमियोस्टैसिस एनईटोसिस20,21,22,23,24 को बाधित करता है। इसके अलावा, सामान्य भेदभाव या परिपक्वता के दौरान, न्यूट्रोफिल चयापचय रीप्रोग्रामिंग ग्लाइकोलाइटिक गतिविधि को सीमित करके उलट हो जाती है, और वे माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन में संलग्न होते हैं और इंट्रासेल्युलर लिपिड25,26 जुटाते हैं।
चयापचय बाह्य प्रवाह विश्लेषक लगातार लाइव सेल माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन और ग्लाइकोलाइसिस की निगरानी और मात्रा निर्धारित कर सकता है। विश्लेषक ऑक्सीजन (ओ2) एकाग्रता और पीएच परिवर्तनों को मापने के लिए 96-वेल प्लेट प्रारूप सेंसर कारतूस और दो फ्लोरोफोर का उपयोग करता है। सेंसर कारतूस परख के दौरान सेल मोनोलेयर के ऊपर है और ~ 200 एनएम उच्च माइक्रोचैंबर बनाता है। विश्लेषक में ऑप्टिकल फाइबर बंडलों का उपयोग फ्लोरोफोरेस को उत्तेजित करने और फ्लोरोसेंट तीव्रता परिवर्तनों का पता लगाने के लिए किया जाता है। ओ2 एकाग्रता और पीएच में वास्तविक समय परिवर्तन स्वचालित रूप से गणना की जाती है और ऑक्सीजन खपत दर (ओसीआर) और बाह्य अम्लीकरण दर (ईसीएआर) के रूप में दिखाई जाती है। सेंसर कारतूस पर चार पोर्ट हैं जो परख माप के दौरान प्रत्येक कुएं में चार यौगिकों को लोड करने की अनुमति देते हैं। यह प्रोटोकॉल चयापचय बाह्य प्रवाह विश्लेषक का उपयोग करके माउस और मानव न्यूट्रोफिल के माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन के साथ-साथ न्यूट्रोफिल जैसी एचएल 60 कोशिकाओं को निर्धारित करने पर केंद्रित है।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>37 &#176;C non-CO2&#160;incubator</td>
			<td>Precision</td>
			<td>Economy Model 2EG</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biorender</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Software Application</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Model 5810R</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#160;Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive</td>
			<td>Corning</td>
			<td>102416-100</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep Magnet</td>
			<td>STEMCELL</td>
			<td>18000</td>
			<td>Magnet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySepMouse Neutrophil Enrichment kit</td>
			<td>STEMCELL</td>
			<td>19762A</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad Prism 9</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Software Application</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Serum Albumin Solution (25%)</td>
			<td>GeminiBio</td>
			<td>800-120</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine (VetaKet)</td>
			<td>DAILYMED</td>
			<td>NDC 59399-114-10</td>
			<td>Anesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>SH30256.01</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate buckets</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>UL155</td>
			<td>Accessory</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PolymorphPrep</td>
			<td>PROGEN</td>
			<td>1895 (previous 1114683)</td>
			<td>polysaccharide solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified mouse anti-human CD18 antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>302102</td>
			<td>Clone TS1/18</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11-875-093</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse metabolic extracellular flux analyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>XFe96</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF Cell Mito Stress Test Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>103015-100</td>
			<td>mitochondrial stress test Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swing-bucket rotor</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>A-4-62</td>
			<td>Rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vactrap 2 Vacum Trap</td>
			<td>Fox Lifesciences</td>
			<td>3052101-FLS</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wave</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Software Application</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF 1.0 M Glucose Solution</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>103577-100</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF 100 mM Pyruvate Solution</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>103578-100</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF 200 mM Glutamine Solution</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>103579-100</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF DMEM medium</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>103575-100</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XFe96 FluxPak</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>102601-100</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine (AnaSed Injection)</td>
			<td>DAILYMED</td>
			<td>NDC 59399-110-20</td>
			<td>Anesthetic</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time measurement of the mitochondrial bioenergetic profile of neutrophils

न्यूट्रोफिल रक्षा की पहली पंक्ति है और मनुष्यों में सबसे प्रचुर मात्रा में ल्यूकोसाइट्स हैं। ये प्रभावक कोशिकाएं फागोसाइटोसिस और ऑक्सीडेटिव विस्फोट जैसे कार्य करती हैं, और माइक्रोबियल निकासी के लिए न्यूट्रोफिल बाह्य कोशिकीय जाल (एनईटी) बनाती हैं। न्यूट्रोफिल की चयापचय गतिविधियों में नई अंतर्दृष्टि प्रारंभिक अवधारणा को चुनौती देती है कि वे मुख्य रूप से ग्लाइकोलाइसिस पर भरोसा करते हैं। चयापचय गतिविधियों का सटीक माप न्यूट्रोफिल की विभिन्न चयापचय आवश्यकताओं को प्रकट कर सकता है, जिसमें ट्राइकारबॉक्सिलिक एसिड (टीसीए) चक्र (जिसे क्रेब्स चक्र के रूप में भी जाना जाता है), ऑक्सीडेटिव फॉस्फोराइलेशन (ओएक्सपीएचओ), पेंटोस फॉस्फेट मार्ग (पीपीपी), और फैटी एसिड ऑक्सीकरण (एफएओ) शारीरिक परिस्थितियों में और रोग अवस्थाओं में शामिल हैं। यह पेपर एक चयापचय बाह्य प्रवाह विश्लेषक पर चयापचय प्रवाह विश्लेषण का उपयोग करते हुए, माउस अस्थि मज्जा-व्युत्पन्न न्यूट्रोफिल, मानव रक्त-व्युत्पन्न न्यूट्रोफिल और न्यूट्रोफिल जैसी एचएल 60 सेल लाइन पर माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन के संकेतक के रूप में ऑक्सीजन खपत दर (ओसीआर) को मापने के लिए एक चरण-दर-चरण प्रोटोकॉल और पूर्वआवश्यकताओं का वर्णन करता है। इस विधि का उपयोग सामान्य और रोग स्थितियों के तहत न्यूट्रोफिल के माइटोकॉन्ड्रियल कार्यों को निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है।

प्रतिनिधि ओसीआर गतिशीलता को ऑलिगोमाइसिन, एफसीसीपी, और रोटेनोन / एंटीमाइसिन के जवाब में माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन परिवर्तनों को दर्शाते हुए दिखाया गया है, माउस न्यूट्रोफिल (चित्रा 3 ए), मानव न्य?...

Watch this Scientific Journal Video about Real-Time Measurement of the Mitochondrial Bioenergetic Profile of Neutrophils at JoVE.com

Real-Time Measurement of the Mitochondrial Bioenergetic Profile of Neutrophils

हम चयापचय बाह्य प्रवाह विश्लेषक का उपयोग करके माउस और मानव न्यूट्रोफिल और एचएल 60 कोशिकाओं के माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन को मापने वाले चरणबद्ध प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं।

न्यूट्रोफिल के माइटोकॉन्ड्रियल बायोएनर्जेटिक प्रोफाइल का वास्तविक समय माप

Neutrophils are the first line of defense and the most abundant leukocytes in humans. These effector cells perform functions such as phagocytosis and ...

यह प्रोटोकॉल माउस और मानव न्यूट्रोफिल के माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन को निर्धारित करने पर केंद्रित है, साथ ही चयापचय बाह्य प्रवाह विश्लेषक का उपयोग करके न्यूट्रोफिल जैसी एचएल 60 कोशिकाएं भी हैं। यह विधि हमें सामान्य और रोग स्थितियों के तहत न्यूट्रोफिल में माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन को निर्धारित करने की अनुमति देती है। यह एक सीधी तकनीक है जो दवाओं या किसी भी बीमारी की स्थिति के जवाब में कोशिकाओं के माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकती है।चूंकि विभिन्न कोशिकाओं में अलग-अलग माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन दक्षता होती है, इसलिए उच्च गुणवत्ता वाले परिणाम प्राप्त करने के लिए सेल सीडिंग घनत्व और अभिकर्मक एकाग्रता का अनुकूलन सटीक रूप से किया जाना चाहिए। चयापचय बाह्य प्रवाह परख शुरू करने के लिए, विशेष रूप से डिज़ाइन किए गए 96-वेल प्लेट पर पैक किया गया एक सेंसर कारतूस लें और अंतर्निहित प्लेट के प्रत्येक कुएं में 200 माइक्रोलीटर अंशांकन माध्यम स्थानांतरित करें। कैलिब्रांट के साथ कारतूस और प्लेट को ध्यान से उठाएं, और इसे हाइड्रेशन के लिए रात भर गैर-कार्बन-डाइऑक्साइड ह्यूमिडिफायर 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रखें।इसके बाद, सेल प्रकार के आधार पर, सेल आसंजन सुनिश्चित करने के लिए एक विशिष्ट कोटिंग के साथ 96-वेल प्लेट को कोट करें। बाद में, प्लेटों को 200 माइक्रोलीटर बाँझ पीबीएस के साथ दो बार धो लें। डीएमईएम में एक मिलीमोलर पाइरूवेट, 10 मिलीमोलर ग्लूकोज और दो मिलीमोलर ग्लूटामाइन के साथ परख माध्यम तैयार करें।पाठ पांडुलिपि में वर्णित माउस और मानव न्यूट्रोफिल कोशिकाओं की खरीद करें। माउस से प्राप्त न्यूट्रोफिल के लिए, परख माध्यम जोड़कर सेल घनत्व को 1.1 गुना 10 से छठी कोशिकाओं प्रति मिलीलीटर समायोजित करें। फिर तैयार 96-वेल प्लेट में प्रति अच्छी तरह से माउस न्यूट्रोफिल निलंबन के 180 माइक्रोलीटर बीज डालें।इसी तरह, परख माध्यम का उपयोग करके मानव न्यूट्रोफिल सेल घनत्व को 2.2 गुना 10 से छठी कोशिकाओं प्रति मिलीलीटर में समायोजित करें। परख के दिन, हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके मैन्युअल रूप से न्यूट्रोफिल जैसी एचएल 60 कोशिकाओं की गणना करें। फिर पांच मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 300 जी पर विभेदित या उदासीन एचएल 60 कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें।एक बार डीएमईएम के साथ कोशिकाओं को धोएं और प्रति मिलीलीटर 1.39 गुना 10 से छठे कोशिकाओं के सेल घनत्व को प्राप्त करने के लिए परख माध्यम में उन्हें फिर से निलंबित करें। अगला बीज 180 माइक्रोलीटर विभेदित या उदासीन एचएल 60 कोशिकाओं को माउस और मानव न्यूट्रोफिल नमूने वाले पूर्व-तैयार 96-वेल प्लेट में डालता है। अंत में, बीज बोते समय पृष्ठभूमि सुधार के लिए कोशिकाओं से रहित सेल कल्चर प्लेट के कोने कुओं में पूरा माध्यम जोड़ें।प्लेट के तल पर कोशिकाओं के उचित पालन को सुनिश्चित करने के लिए बिना ब्रेक के तीन मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 300 ग्राम पर प्लेट को सेंट्रीफ्यूज करें। अंत में, परख माध्यम के साथ कोशिकाओं को पूर्व-समतुल्य करने के लिए प्लेट को एक घंटे के लिए इनक्यूबेट करें। माइटोकॉन्ड्रियल तनाव परीक्षण किट खोलें और निर्माता के निर्देशों के अनुसार अभिकर्मकों को तैयार करें।इसके बाद, कारतूस को अभिकर्मकों के साथ लोड करें, तैयार ऑलिगोमाइसिन से पोर्ट ए में, एफसीसीपी को पोर्ट बी में, और इंजेक्शन के लिए पोर्ट सी में रोटेनोन / एंटीमाइसिन ए मिश्रण से शुरू करें। अप्रयुक्त बंदरगाहों को 20 माइक्रोलीटर परख माध्यम से भरें। वेव सॉफ्टवेयर खोलकर और हीटर ऑन टैब पर क्लिक करके परख से कम से कम पांच घंटे पहले परख प्रणाली को 37 डिग्री सेल्सियस पर समतुल्य करें।तापमान तक पहुंचने के बाद, वेव सॉफ्टवेयर का निचला बायां कोना तैयार दिखाई देता है। सॉफ्टवेयर में माइटोकॉन्ड्रियल तनाव परख किट के लिए एक टेम्पलेट खोलें। बाईं ओर इंजेक्शन रणनीतियों का चयन करें, फिर जोड़ें पर क्लिक करें और इंजेक्शन की स्थिति को मानव न्यूट्रोफिल या माउस न्यूट्रोफिल या एचएल 60 के रूप में नाम दें।प्रत्येक पर क्लिक करके पोर्ट ए से डी का चयन करें, और यौगिक जोड़ें पर क्लिक करें और संबंधित सांद्रता के साथ ऑलिगोमाइसिन या एफसीसीपी या रोटेनोन / एंटीमाइसिन ए दर्ज करें। बाईं ओर प्रथागत का चयन करें, फिर जोड़ें पर क्लिक करें और उन्हें अलग से CD18 और Cell Tak नाम दें। बाईं ओर कक्ष प्रकार का चयन करें।फिर जोड़ें पर क्लिक करें और उन्हें मानव न्यूट्रोफिल, माउस न्यूट्रोफिल, और एचएल 60 या डीएचएल 60 को लागू आहार घनत्व के साथ नाम दें। समूह जोड़ें पर क्लिक करके समूहों को परिभाषित करें. फिर रेखांकित परिभाषा पर क्लिक करें।बाईं ओर परिभाषाओं और दाईं ओर प्लेट मानचित्र के साथ सभी समूहों का निरीक्षण करने के लिए शीर्ष मेनू में प्लेट मैप पर क्लिक करें। चार कोने के कुओं को पृष्ठभूमि के रूप में बनाए रखते हुए प्रत्येक कुएं को समूह में जोड़ने के लिए खींचें और छोड़ें। प्रोटोकॉल सेट करने के लिए, शीर्ष मेनू में प्रोटोकॉल टैब का चयन करें, और बेसलाइन, ऑलिगोमाइसिन, एफसीसीपी, रोटेनोन और एंटीमाइसिन ए मिश्रण के तीन चक्रों को परिभाषित करें, मिश्रण करने का समय तीन मिनट के रूप में सेट करके, शून्य मिनट के रूप में आराम करें, और माप सात मिनट के रूप में।परख चलाएँ पृष्ठ पर जाएँ, संदर्भ के लिए प्रोजेक्ट सारांश जानकारी प्रदान करें, और प्रारंभ चलाएँ क्लिक करें. फ़ाइलों को सहेजने के लिए स्थान दें ताकि परख के पूरा होने के बाद सभी परिणाम सहेजे जाएं। फिर फिर से स्टार्ट रन पर क्लिक करें।परख के स्वचालित लोडिंग के बाद, सेंसर कारतूस और प्लेट को 200 माइक्रोलीटर कैलिब्रांट के साथ रखने के लिए ट्रे के खुलने की प्रतीक्षा करें। कारतूस बारकोड दिशा दाईं ओर सेट करें। आई एम रेडी पर क्लिक करके अंशांकन चलाएं, जिसमें लगभग 20 मिनट लगते हैं।अंशांकन के बाद, ओपन ट्रे पर क्लिक करें, प्लेट को सेल सीड प्लेट से बदलें, और परख जारी रखने के लिए तैयार हूं पर क्लिक करें। परख को पूरा करने के बाद, डेटा स्वचालित रूप से सहेजा जाता है। परिणामों को किसी स्प्रेडशीट या अन्य विश्लेषण सॉफ़्टवेयर फ़ाइल में निर्यात करें.ग्राफ ़ को प्लॉट करें और डेटा का विश्लेषण करें। ऑक्सीजन खपत दर या ओसीआर की प्रतिनिधि गतिशीलता ने माउस और मानव न्यूट्रोफिल में माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन में परिवर्तन का संकेत दिया, साथ ही ऑलिगोमाइसिन, एफसीसीपी और रोटेनोन और एंटीमाइसिन ए के मिश्रण के जवाब में उदासीन और विभेदित एचएल 60 कोशिकाओं का संकेत दिया। एफसीसीपी उपचार ने ओसीआर मूल्य को बहाल करने और अधिकतम श्वसन प्राप्त करने के लिए इलेक्ट्रॉनों और ऑक्सीजन की खपत के प्रवाह में वृद्धि की।रोटेनोन और एंटीमाइसिन ए के मिश्रण ने इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला के कॉम्प्लेक्स 1 और 3 को अवरुद्ध कर दिया, जिससे माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन का उन्मूलन हो गया। न्यूट्रोफिल-निर्देशित भेदभाव के बाद एचएल 60 कोशिकाओं में माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन में कमी देखी गई। विभेदित एचएल 60 कोशिकाओं में बेसल माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन, प्रोटॉन-रिसाव से जुड़े श्वसन, एटीपी-लिंक्ड श्वसन और गैर-माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन काफी कम पाए गए।विभेदित एचएल 60 कोशिकाओं के अधिकतम श्वसन में वृद्धि पर्याप्त नहीं थी, जबकि अतिरिक्त श्वसन क्षमता में काफी वृद्धि हुई थी। सुनिश्चित करें कि कोशिकाएं प्लेट के निचले भाग में हैं, क्योंकि सेंसर कारतूस को ओसीआर मान पढ़ते समय फ्लोटिंग कोशिकाओं के कारण कोई बाधा नहीं होनी चाहिए। यह तकनीक शोधकर्ताओं को न्यूट्रोफिल से जुड़े अध्ययनों में दवाओं या माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन के प्रभाव का अध्ययन करने में मदद करेगी।

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A TIRF Microscopy Technique for Real-time, Simultaneous Imaging of the TCR and its Associated Signaling Proteins

वास्तविक समय, TCR के साथ - साथ इमेजिंग और उसके एसोसिएटेड संकेतन प्रोटीन के लिए एक TIRF माइक्रोस्कोपी तकनीक

Signaling is initiated through the T Cell Receptor (TCR) when it is engaged by antigenic peptide fragments bound by Major Histocompatibility Complex ...

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

टी सेल की वास्तविक समय लाइव इमेजिंग परिसर गठन संकेतन

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

Bioenergetics and the Oxidative Burst: Protocols for the Isolation and Evaluation of Human Leukocytes and Platelets

मानव leukocytes और प्लेटलेट्स की अलगाव और मूल्यांकन के लिए प्रोटोकॉल: bioenergetics और oxidative फट

Mitochondrial dysfunction is known to play a significant role in a number of pathological conditions such as atherosclerosis, diabetes, septic shock, and ...

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

कोशिकी डीएनए रिलीज के उच्च throughput मापन और मानव न्यूट्रोफिल में मात्रात्मक नेट गठन<em&gt; इन विट्रो</em

Neutrophil granulocytes are the most abundant leukocytes in the human blood. Neutrophils are the first to arrive at the site of infection. Neutrophils ...

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

रीयल टाइम में anaesthetized चूहों पर intravital माइक्रोस्कोपी द्वारा Mesenteric रगों में न्यूट्रोफिल और monocytes इमेजिंग

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

Measuring Dengue Virus RNA in the Culture Supernatant of Infected Cells by Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction

डेंगू वायरस आरएनए को मापने वास्तविक समय मात्रात्मक पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया द्वारा संक्रमित कोशिकाओं की संस्कृति Supernatant में

At present, real-time polymerase chain reaction (PCR) technology is an indispensable tool for the detection and quantification of viral genomes in ...

Robust Ligature-Induced Model of Murine Periodontitis for the Evaluation of Oral Neutrophils

ओरल न्यूट्रोफिल्स के मूल्यांकन के लिए मोनी पेरिन पीरियोडोंटाइटिस का मजबूत लिगेचर-प्रेरित मॉडल

The main advantages of studying the pathophysiology of periodontal disease utilizing murine models are the reduced cost of animals, array of genetically ...

Pan-lyssavirus Real Time RT-PCR for Rabies Diagnosis

रेबीज निदान के लिए पैन-लिसवायरस रियल टाइम आरटी-पीसीआर

Molecular assays are rapid, sensitive and specific, and have become central to diagnosing rabies. PCR based assays have been utilized for decades to ...

Monitoring Influenza Virus Survival Outside the Host Using Real-Time Cell Analysis

रियल-टाइम सेल विश्लेषण का उपयोग करके मेजबान के बाहर इन्फ्लूएंजा वायरस उत्तरजीविता की निगरानी

Methods for virus particle quantification represent a critical aspect of many virology studies. Although several reliable techniques exist, they are ...

Real-Time Quantification of Reactive Oxygen Species in Neutrophils Infected with Meningitic Escherichia Coli

Real-Time Quantification of Reactive Oxygen Species in Neutrophils Infected with Meningitic Escherichia Coli

मेनिंगिटिक एस्चेरिचिया कोलाई से संक्रमित न्यूट्रोफिल में प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों का वास्तविक समय मात्राकरण

Escherichia coli (E. coli) is the most common Gram-negative bacteria causing neonatal meningitis. The occurrence of bacteremia and bacterial penetration ...