Name: real-time measurement of the mitochondrial bioenergetic profile of neutrophils
Uploaded: 2023-06-02T13:00:00
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Riconosciamo il Dr. Anthony T. Vella e la Dr. Federica Aglianoin del Dipartimento di Immunologia di UConn Health per la loro formazione nell'uso dell'analizzatore di flusso extracellulare metabolico e la Dr. Lynn Puddington del Dipartimento di Immunologia di UConn Health per il suo supporto agli strumenti. Riconosciamo la dottoressa Geneva Hargis della UConn School of Medicine per il suo aiuto nella scrittura scientifica e nella revisione di questo manoscritto. Questa ricerca è stata supportata da sovvenzioni del National Institutes of Health, National Heart, Lung, and Blood Institute (R01HL145454), National Institute of General Medical Sciences (R35GM147713 e P20GM139763), un fondo di avvio di UConn Health e una borsa di rientro professionale dell'American Association of Immunologists.

I campioni di sangue intero eparinizzato sono stati ottenuti da donatori umani sani dopo aver ottenuto il consenso informato, come approvato dall'Institutional Review Board di UConn Health in conformità con la Dichiarazione di Helsinki. Tutti gli esperimenti sugli animali hanno seguito le linee guida dell'UConn Health Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) e l'approvazione per l'uso dei roditori è stata ottenuta dall'UConn Health IACUC secondo i criteri delineati nella Guida per la cura e l'uso degli anima...

La procedura standard che misura la respirazione mitocondriale dei neutrofili utilizzando l'analizzatore del flusso extracellulare metabolico è limitata da molti fattori, tra cui il numero di cellule, la crescita cellulare e la vitalità. Ogni concentrazione di composto varia tra il tipo e la fonte di cellule in questo test. Oligomicina e rotenone / antimicina A sono per lo più utilizzati in una concentrazione simile tra la maggior parte dei tipi di cellule. Tuttavia, poiché la frequenza respiratoria massima indotta ...

I mitocondri svolgono un ruolo importante nella bioenergetica cellulare, che genera adenosina trifosfato (ATP) mediante fosforilazione ossidativa (OXPHOS). Oltre a questo, il ruolo dei mitocondri si estende alla generazione e alla disintossicazione delle specie reattive dell'ossigeno, alla regolazione del calcio della matrice citoplasmatica e mitocondriale, alla sintesi cellulare, al catabolismo e al trasporto di metaboliti all'interno della cellula1. La respirazione mitocondriale è essenziale in tutte le cellule, poiché la loro disfunzione può causare problemi metabolici 2, comprese le malattie cardiovascolari3 e un'ampia varietà di malattie neurodegenerative, come la degenerazione maculare legata all'età4, il morbo di Parkinson e l'Alzheimer5 e la malattia di Charcot-Marie-Tooth2 A (CMT2A)6.
Studi al microscopio elettronico sui neutrofili hanno rivelato che ci sono relativamente pochi mitocondri7 e fanno molto affidamento sulla glicolisi per la loro produzione di energia poiché i tassi di respirazione mitocondriale sono molto bassi8. Tuttavia, i mitocondri sono cruciali per le funzioni dei neutrofili, come la chemiotassi9 e l'apoptosi10,11,12. Uno studio precedente ha rivelato una complessa rete mitocondriale nei neutrofili umani con alto potenziale di membrana. La perdita di potenziale della membrana mitocondriale è un indicatore precoce dell'apoptosi dei neutrofili10. Il trattamento con disaccoppiatore mitocondriale cianuro di carbonile m-clorofenil idrazono (CCCP) ha mostrato una significativa inibizione della chemiotassi, insieme a un cambiamento nella morfologia mitocondriale 9,10.
Sebbene la fonte primaria di energia per i neutrofili sia la glicolisi, i mitocondri forniscono l'ATP che avvia l'attivazione dei neutrofili alimentando la prima fase della segnalazione purinergica, che aumenta la segnalazione Ca2+, amplifica la produzione di ATP mitocondriale e avvia le risposte funzionali dei neutrofili13. La disfunzione della catena respiratoria mitocondriale provoca un'eccessiva produzione di specie tossiche reattive dell'ossigeno (ROS) e porta a danni patogeni14,15,16. La NETosi, che è il processo di formazione di trappole extracellulari di neutrofili (NET), è una proprietà critica dei neutrofili che li aiuta a combattere contro i patogeni17 e contribuisce a molte condizioni patologiche, tra cui cancro, trombosi e disturbi autoimmuni18. I ROS di derivazione mitocondriale contribuiscono alla NETosi19, il DNA mitocondriale può essere un componente di NETs18 e l'omeostasi mitocondriale alterata compromette NETosis 20,21,22,23,24. Inoltre, durante la normale differenziazione o maturazione, la riprogrammazione metabolica dei neutrofili viene invertita limitando l'attività glicolitica, e si impegnano nella respirazione mitocondriale e mobilitano i lipidi intracellulari25,26.
L'analizzatore del flusso metabolico extracellulare può monitorare e quantificare continuamente la respirazione mitocondriale e la glicolisi delle cellule vive. L'analizzatore utilizza una cartuccia sensore a 96 pozzetti e due fluorofori per quantificare la concentrazione di ossigeno (O2) e le variazioni di pH. La cartuccia del sensore si trova sopra il monostrato cellulare durante il test e forma una microcamera alta ~ 200 nm. I fasci di fibre ottiche nell'analizzatore vengono utilizzati per eccitare i fluorofori e rilevare le variazioni di intensità fluorescente. Le variazioni in tempo reale della concentrazione di O2 e del pH vengono calcolate automaticamente e mostrate come tasso di consumo di ossigeno (OCR) e tasso di acidificazione extracellulare (ECAR). Ci sono quattro porte sulla cartuccia del sensore che consentono di caricare fino a quattro composti in ciascun pozzetto durante le misurazioni del test. Questo protocollo si concentra sulla quantificazione della respirazione mitocondriale dei neutrofili di topo e umani, nonché delle cellule HL60 simili ai neutrofili, utilizzando l'analizzatore del flusso extracellulare metabolico.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>37 &#176;C non-CO2&#160;incubator</td>
			<td>Precision</td>
			<td>Economy Model 2EG</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biorender</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Software Application</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Model 5810R</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#160;Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive</td>
			<td>Corning</td>
			<td>102416-100</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep Magnet</td>
			<td>STEMCELL</td>
			<td>18000</td>
			<td>Magnet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySepMouse Neutrophil Enrichment kit</td>
			<td>STEMCELL</td>
			<td>19762A</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad Prism 9</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Software Application</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Serum Albumin Solution (25%)</td>
			<td>GeminiBio</td>
			<td>800-120</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine (VetaKet)</td>
			<td>DAILYMED</td>
			<td>NDC 59399-114-10</td>
			<td>Anesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>SH30256.01</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate buckets</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>UL155</td>
			<td>Accessory</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PolymorphPrep</td>
			<td>PROGEN</td>
			<td>1895 (previous 1114683)</td>
			<td>polysaccharide solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified mouse anti-human CD18 antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>302102</td>
			<td>Clone TS1/18</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11-875-093</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse metabolic extracellular flux analyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>XFe96</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF Cell Mito Stress Test Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>103015-100</td>
			<td>mitochondrial stress test Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swing-bucket rotor</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>A-4-62</td>
			<td>Rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vactrap 2 Vacum Trap</td>
			<td>Fox Lifesciences</td>
			<td>3052101-FLS</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wave</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Software Application</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF 1.0 M Glucose Solution</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>103577-100</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF 100 mM Pyruvate Solution</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>103578-100</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF 200 mM Glutamine Solution</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>103579-100</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF DMEM medium</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>103575-100</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XFe96 FluxPak</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>102601-100</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine (AnaSed Injection)</td>
			<td>DAILYMED</td>
			<td>NDC 59399-110-20</td>
			<td>Anesthetic</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time measurement of the mitochondrial bioenergetic profile of neutrophils

I neutrofili sono la prima linea di difesa e i leucociti più abbondanti nell'uomo. Queste cellule effettrici svolgono funzioni come la fagocitosi e l'esplosione ossidativa e creano trappole extracellulari di neutrofili (NET) per la clearance microbica. Nuove conoscenze sulle attività metaboliche dei neutrofili sfidano il concetto iniziale che si basano principalmente sulla glicolisi. La misurazione precisa delle attività metaboliche può dispiegare diversi requisiti metabolici dei neutrofili, tra cui il ciclo dell'acido tricarbossilico (TCA) (noto anche come ciclo di Krebs), la fosforilazione ossidativa (OXPHOS), la via del pentoso fosfato (PPP) e l'ossidazione degli acidi grassi (FAO) in condizioni fisiologiche e in stati patologici. Questo articolo descrive un protocollo passo-passo e i prerequisiti per misurare il tasso di consumo di ossigeno (OCR) come indicatore della respirazione mitocondriale sui neutrofili derivati dal midollo osseo di topo, sui neutrofili derivati dal sangue umano e sulla linea cellulare HL60 simile ai neutrofili, utilizzando l'analisi del flusso metabolico su un analizzatore di flusso extracellulare metabolico. Questo metodo può essere utilizzato per quantificare le funzioni mitocondriali dei neutrofili in condizioni normali e di malattia.

Le dinamiche OCR rappresentative sono mostrate indicando i cambiamenti della respirazione mitocondriale in risposta a oligomicina, FCCP e rotenone / antimicina Una miscela di neutrofili di topo (Figura 3A), neutrofili umani (Figura 3B) e cellule HL60 indifferenziate e differenziate (Figura 3C). In tutte le cellule, il trattamento con oligomicina diminuisce il valore OCR inibendo il canale protonico dell'ATP sintasi; Il trattamento F...

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Real-Time Measurement of the Mitochondrial Bioenergetic Profile of Neutrophils

Descriviamo protocolli graduali che misurano la respirazione mitocondriale di neutrofili di topo e umani e cellule HL60 utilizzando l'analizzatore di flusso extracellulare metabolico.

Misurazione in tempo reale del profilo bioenergetico mitocondriale dei neutrofili

Neutrophils are the first line of defense and the most abundant leukocytes in humans. These effector cells perform functions such as phagocytosis and ...

Questo protocollo si concentra sulla quantificazione della respirazione mitocondriale dei neutrofili di topo e umani, nonché delle cellule HL60 simili ai neutrofili utilizzando l'analizzatore del flusso extracellulare metabolico. Questo metodo ci consente di quantificare la funzione mitocondriale nei neutrofili in condizioni normali e di malattia. Questa è una tecnica semplice che può fornire informazioni sulla funzione mitocondriale delle cellule in risposta a farmaci o qualsiasi condizione di malattia.Poiché cellule diverse hanno un'efficienza respiratoria mitocondriale diversa, l'ottimizzazione della densità di semina cellulare e della concentrazione del reagente deve essere eseguita con precisione per ottenere risultati di alta qualità. Per iniziare il test del flusso metabolico extracellulare, prendere una cartuccia del sensore imballata su una piastra da 96 pozzetti appositamente progettata e trasferire 200 microlitri di mezzo di calibrazione in ciascun pozzetto della piastra sottostante. Sollevare con cautela la cartuccia e la piastra con calibrante e posizionarla in un'incubatrice umidificata a 37 gradi Celsius non ad anidride carbonica durante la notte per l'idratazione.Successivamente, in base al tipo di cella, rivestire la piastra a 96 pozzetti con un rivestimento specifico per garantire l'adesione della cella. Successivamente, lavare le piastre con 200 microlitri di PBS sterile due volte. Preparare il mezzo di analisi in DMEM con un piruvato millimolare, glucosio 10 millimolare e due glutammina millimolare.Procurarsi le cellule dei neutrofili umani e del topo come descritto nel manoscritto testuale. Per i neutrofili acquistati dal topo, regolare la densità cellulare a 1,1 volte 10 alla sesta cellula per millilitro aggiungendo il mezzo di analisi. Quindi seminare 180 microlitri della sospensione di neutrofili del topo per pozzetto nella piastra a 96 pozzetti preparata.Allo stesso modo, regolare la densità delle cellule neutrofile umane a 2,2 volte 10 alle sesta cellule per millilitro utilizzando il mezzo di analisi. Il giorno del test, contare manualmente le cellule HL60 simili ai neutrofili utilizzando l'emocitometro. Quindi centrifugare le celle HL60 differenziate o indifferenziate a 300G a temperatura ambiente per cinque minuti.Lavare le cellule con DMEM una volta e risospenderle nel mezzo di analisi per ottenere una densità cellulare di 1,39 volte 10 alla sesta cellula per millilitro. Successivamente seminare 180 microlitri di cellule HL60 differenziate o indifferenziate nella piastra a 96 pozzetti pre-preparata contenente i campioni di neutrofili umani e di topo. Infine, aggiungere un mezzo completo ai pozzetti angolari della piastra di coltura cellulare privo di cellule per la correzione dello sfondo durante la semina.Centrifugare la piastra a 300G a temperatura ambiente per tre minuti senza interruzioni per garantire la corretta aderenza delle cellule sul fondo della piastra. Infine, incubare la piastra per un'ora per pre-equilibrare le cellule con il mezzo di analisi. Aprire il kit di test da sforzo mitocondriale e preparare i reagenti secondo le istruzioni del produttore.Quindi, caricare la cartuccia con i reagenti, iniziando con l'oligomicina preparata nella porta A, FCCP nella porta B e la miscela di rotenone / antimicina A nella porta C per le iniezioni. Riempire le porte inutilizzate con 20 microlitri di terreno di analisi. Equilibrare il sistema di analisi a 37 gradi Celsius almeno cinque ore prima del test aprendo il software Wave e facendo clic sulla scheda Riscaldatore acceso.Dopo aver raggiunto la temperatura, l'angolo in basso a sinistra del software Wave mostra pronto. Aprire un modello per il kit di analisi dello stress mitocondriale nel software. Selezionare le strategie di iniezione sul lato sinistro, quindi fare clic su Aggiungi e denominare la condizione di iniezione come neutrofili umani o neutrofili di topo o HL60.Selezionare le porte da A a D facendo clic su ciascuna, quindi fare clic su Aggiungi composto e immettere oligomicina o FCCP o rotenone / antimicina A con le rispettive concentrazioni. Selezionare Pretrattamento sul lato sinistro, quindi fare clic su Aggiungi e denominarli CD18 e Cell Tak separatamente. Selezionare il Tipo di cella sul lato sinistro.Quindi fare clic su Aggiungi e denominarli neutrofili umani, neutrofili di topo e HL60 o DHL60 con una densità di alimentazione applicabile. Definisci i gruppi facendo clic su Aggiungi gruppo. Quindi fare clic sulla definizione sottolineata.Clicca su Mappa delle piastre nel menu in alto per osservare tutti i gruppi con le definizioni sul lato sinistro e la mappa delle lastre sulla destra. Trascinate e rilasciate per aggiungere ogni pozzetto al gruppo mantenendo i quattro pozzetti angolari come sfondo. Per impostare il protocollo, selezionare la scheda Protocollo nel menu in alto e definire tre cicli di miscela basale, oligomicina, FCCP, rotenone e antimicina A, impostando il tempo di miscelazione come tre minuti, il riposo come zero minuti e la misurazione come sette minuti.Passare alla pagina Esegui analisi, fornire le informazioni di riepilogo del progetto come riferimento e fare clic su Avvia esecuzione. Indicare la posizione in cui salvare i file in modo che tutti i risultati vengano salvati dopo il completamento del test. Quindi fare nuovamente clic su Avvia esecuzione.Dopo il caricamento automatico del test, attendere che il vassoio si apra per posizionare la cartuccia del sensore e la piastra con 200 microlitri di calibrante. Impostare la direzione del codice a barre della cartuccia rivolta verso destra. Eseguire la calibrazione facendo clic su Sono pronto, operazione che richiede circa 20 minuti.Dopo la calibrazione, fare clic su Apri vassoio, sostituire la piastra con la piastra seminata dalla cella e fare clic su Sono pronto per continuare il test. Dopo aver completato il test, i dati vengono salvati automaticamente. Esportare i risultati in un foglio di calcolo o in un altro file software di analisi.Tracciare il grafico e analizzare i dati. La dinamica rappresentativa del tasso di consumo di ossigeno o OCR ha indicato cambiamenti nella respirazione mitocondriale nei neutrofili di topo e umani, nonché cellule HL60 indifferenziate e differenziate in risposta a oligomicina, FCCP e la miscela di rotenone e antimicina A.I valori OCR sono diminuiti in tutte le cellule dopo il trattamento con oligomicina a causa dell'inibizione del canale protonico dell'ATP sintasi. Il trattamento FCCP ha aumentato il flusso di elettroni e il consumo di ossigeno per ripristinare il valore OCR e ottenere la massima respirazione.Una miscela di rotenone e antimicina A ha bloccato i complessi 1 e 3 della catena di trasporto degli elettroni, portando all'eliminazione della respirazione mitocondriale. Una diminuzione della respirazione mitocondriale è stata osservata nelle cellule HL60 dopo differenziazione diretta dai neutrofili. Le cellule HL60 differenziate sono risultate avere una respirazione mitocondriale basale significativamente più bassa, una respirazione legata alla perdita di protoni, una respirazione legata all'ATP e una respirazione non mitocondriale.L'aumento della respirazione massima delle cellule HL60 differenziate non è stato sostanziale, mentre la capacità respiratoria di riserva è stata significativamente aumentata. Assicurarsi che le celle siano nella parte inferiore della piastra, poiché la cartuccia del sensore non dovrebbe presentare ostacoli a causa delle celle mobili durante la lettura del valore OCR. Questa tecnica aiuterebbe i ricercatori a studiare l'effetto dei farmaci o della disfunzione mitocondriale negli studi associati ai neutrofili.

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