Name: real-time measurement of the mitochondrial bioenergetic profile of neutrophils
Uploaded: 2023-06-02T13:00:00
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UConn Healthの免疫学部のAnthony T. Vella博士とFederica Aglianoin博士の代謝細胞外フラックス分析装置の使用に関するトレーニング、およびUConn Healthの免疫学部のLynn Puddington博士の機器のサポートに感謝します。UConn医学部のジュネーブ・ハーギス博士が、この原稿の科学的執筆と編集に協力してくれたことに感謝します。この研究は、国立衛生研究所、国立心臓肺血液研究所(R01HL145454)、国立総合医学研究所(R35GM147713およびP20GM139763)、UConn Healthのスタートアップファンド、および米国免疫学会のキャリア再エントリーフェローシップからの助成金によってサポートされました。

ヘパリン処理全血サンプルは、ヘルシンキ宣言に従ってUConn Healthの治験審査委員会によって承認されたように、インフォームドコンセントを取得した後、健康なヒトドナーから取得されました。すべての動物実験は、UConn Health施設動物管理および使用委員会(IACUC)のガイドラインに従い、げっ歯類の使用の承認は、国立衛生研究所の実験動物の管理と使用に関するガイドに概説されている基準...

代謝細胞外フラックス分析装置を使用して好中球のミトコンドリア呼吸を測定する標準的な手順は、細胞数、細胞増殖、生存率などの多くの要因によって制限されます。各化合物濃度は、このアッセイにおける細胞の種類と供給源によって異なります。オリゴマイシンとロテノン/抗マイシンAは、ほとんどの細胞タイプの中で主に同様の濃度で使用されます。ただし、FCCPによって誘発される?...

ミトコンドリアは、酸化的リン酸化(OXPHOS)によってアデノシン三リン酸(ATP)を生成する細胞の生体エネルギー学において主要な役割を果たしています。これに加えて、ミトコンドリアの役割は、活性酸素種の生成と解毒、細胞質およびミトコンドリアマトリックスカルシウム調節、細胞合成、異化、および細胞内の代謝産物の輸送にまで及びます1。ミトコンドリア呼吸は、その機能不全が心血管疾患3や加齢黄斑変性症4、パーキンソン病およびアルツハイマー病5、シャルコー・マリー・トゥース病2A(CMT2A)6などの多種多様な神経変性疾患を含む代謝障害2を引き起こす可能性があるため、すべての細胞に不可欠です。
好中球に関する電子顕微鏡的研究により、ミトコンドリアは比較的少なく7、ミトコンドリアの呼吸速度は非常に低いため、エネルギー産生を解糖に大きく依存していることが明らかになりました8。ただし、ミトコンドリアは、走化性9やアポトーシス10、11、12などの好中球機能にとって重要です。以前の研究では、膜電位の高いヒト好中球における複雑なミトコンドリアネットワークが明らかになりました。ミトコンドリア膜電位損失は、好中球アポトーシスの早期指標である10。ミトコンドリア脱共役カルボニルシアニドm-クロロフェニルヒドラゾン(CCCP)による処理は、ミトコンドリアの形態の変化とともに、走化性の有意な阻害を示しました9,10。
好中球の主要なエネルギー源は解糖系であるが、ミトコンドリアは、プリン作動性シグナル伝達の第1段階に燃料を供給することによって好中球活性化を開始するATPを提供し、これはCa2+シグナル伝達を高め、ミトコンドリアATP産生を増幅し、好中球機能応答を開始する13。ミトコンドリア呼吸鎖の機能不全は、有毒な活性酸素種(ROS)の過剰産生をもたらし、病原性損傷につながります14,15,16。好中球細胞外トラップ(NET)を形成するプロセスであるNETosisは、好中球の重要な特性であり、病原体と戦うのに役立ち17、癌、血栓症、自己免疫疾患などの多くの病理学的状態に寄与します18。ミトコンドリア由来のROSはNETosis19に寄与し、ミトコンドリアDNAはNETs18の構成要素となり得、そして変化したミトコンドリア恒常性はNETosis20,21,22,23,24を損なう。さらに、正常な分化または成熟の間に、好中球代謝リプログラミングは解糖活性を制限することによって逆転し、それらはミトコンドリア呼吸に従事し、細胞内脂質を動員します25,26。
代謝細胞外フラックス分析装置は、生細胞のミトコンドリア呼吸と解糖を継続的に監視および定量することができます。この分析装置は、96ウェルプレートフォーマットのセンサーカートリッジと2つの蛍光色素を使用して、酸素(O2)濃度とpH変化を定量します。センサーカートリッジは、アッセイ中に細胞単層の上にあり、~200 nmの高さのマイクロチャンバーを形成します。分析器内の光ファイバー束は、蛍光色素を励起し、蛍光強度の変化を検出するために使用されます。O2 濃度とpHのリアルタイム変化が自動的に計算され、酸素消費速度(OCR)と細胞外酸性化速度(ECAR)として表示されます。センサーカートリッジには4つのポートがあり、アッセイ測定中に各ウェルに最大4つの化合物をロードできます。このプロトコルは、代謝細胞外フラックスアナライザーを使用して、マウスおよびヒト好中球、ならびに好中球様HL60細胞のミトコンドリア呼吸を定量化することに焦点を当てています。

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	<tbody>
		<tr>
			<td>37 &#176;C non-CO2&#160;incubator</td>
			<td>Precision</td>
			<td>Economy Model 2EG</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biorender</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Software Application</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Model 5810R</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#160;Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive</td>
			<td>Corning</td>
			<td>102416-100</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep Magnet</td>
			<td>STEMCELL</td>
			<td>18000</td>
			<td>Magnet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySepMouse Neutrophil Enrichment kit</td>
			<td>STEMCELL</td>
			<td>19762A</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad Prism 9</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Software Application</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Serum Albumin Solution (25%)</td>
			<td>GeminiBio</td>
			<td>800-120</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine (VetaKet)</td>
			<td>DAILYMED</td>
			<td>NDC 59399-114-10</td>
			<td>Anesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>SH30256.01</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate buckets</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>UL155</td>
			<td>Accessory</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PolymorphPrep</td>
			<td>PROGEN</td>
			<td>1895 (previous 1114683)</td>
			<td>polysaccharide solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified mouse anti-human CD18 antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>302102</td>
			<td>Clone TS1/18</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11-875-093</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse metabolic extracellular flux analyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>XFe96</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF Cell Mito Stress Test Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>103015-100</td>
			<td>mitochondrial stress test Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swing-bucket rotor</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>A-4-62</td>
			<td>Rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vactrap 2 Vacum Trap</td>
			<td>Fox Lifesciences</td>
			<td>3052101-FLS</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wave</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Software Application</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF 1.0 M Glucose Solution</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>103577-100</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF 100 mM Pyruvate Solution</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>103578-100</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF 200 mM Glutamine Solution</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>103579-100</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF DMEM medium</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>103575-100</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XFe96 FluxPak</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>102601-100</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine (AnaSed Injection)</td>
			<td>DAILYMED</td>
			<td>NDC 59399-110-20</td>
			<td>Anesthetic</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time measurement of the mitochondrial bioenergetic profile of neutrophils

好中球は防御の最前線であり、ヒトで最も豊富な白血球です。これらのエフェクター細胞は、食作用や酸化バーストなどの機能を果たし、微生物クリアランスのための好中球細胞外トラップ(NET)を作成します。好中球の代謝活動に関する新しい洞察は、好中球が主に解糖に依存しているという初期の概念に挑戦します。代謝活性の正確な測定は、トリカルボン酸(TCA)サイクル(クレブス回路としても知られています)、酸化的リン酸化(OXPHOS)、ペントースリン酸経路(PPP)、および生理学的条件および疾患状態における脂肪酸酸化(FAO)を含む好中球のさまざまな代謝要件を明らかにすることができます。本論文では、代謝細胞外フラックス分析装置による代謝フラックス解析を用いて、マウス骨髄由来好中球、ヒト血液由来好中球、好中球様HL60細胞株のミトコンドリア呼吸の指標として酸素消費率(OCR)を測定するための段階的なプロトコルと前提条件について説明します。この方法は、正常および疾患条件下での好中球のミトコンドリア機能を定量するために使用できます。

マウス好中球(図3A)、ヒト好中球(図3B)、および未分化および分化したHL60細胞(図3C)の混合物であるオリゴマイシン、FCCP、およびロテノン/抗マイシンA混合物に応答するミトコンドリア呼吸の変化を示す代表的なOCRダイナミクスが示されています。すべての細胞において、オリゴマイシン処理は、ATPシンターゼのプロトンチャネ...

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Real-Time Measurement of the Mitochondrial Bioenergetic Profile of Neutrophils

代謝細胞外フラックス分析装置を用いてマウスおよびヒト好中球およびHL60細胞のミトコンドリア呼吸を測定する段階的プロトコルについて説明する。

好中球のミトコンドリア生体エネルギープロファイルのリアルタイム測定

Neutrophils are the first line of defense and the most abundant leukocytes in humans. These effector cells perform functions such as phagocytosis and ...

このプロトコルは、代謝細胞外フラックスアナライザーを使用して、マウスおよびヒト好中球、および好中球様HL60細胞のミトコンドリア呼吸を定量化することに焦点を当てています。この方法により、正常および疾患条件下で好中球のミトコンドリア機能を定量化することができます。これは、薬物やあらゆる病状に反応して細胞のミトコンドリア機能に関する洞察を提供できる簡単な手法です。細胞が異なればミトコンドリアの呼吸効率も異なるため、高品質の結果を得るには、細胞播種密度と試薬濃度の最適化を正確に行う必要があります。代謝細胞外フラックスアッセイを開始するには、特別に設計された96ウェルプレート上に充填されたセンサーカートリッジを取り、200マイクロリットルのキャリブレーション培地を下層のプレートの各ウェルに移します。カートリッジとプレートをキャリブラントで慎重に持ち上げ、二酸化炭素を含まない加湿された摂氏37度のインキュベーターに一晩入れて水分補給します。次に、細胞の種類に基づいて、96ウェルプレートを特定のコーティングでコーティングし、細胞接着を確保します。その後、プレートを200マイクロリットルの滅菌PBSで2回洗浄します。1ミリモルのピルビン酸、10ミリモルのグルコース、および2ミリモルのグルタミンを含むDMEM中のアッセイ培地を調製します。マウスとヒトの好中球細胞を、本文原稿に記載されているように調達します。マウスから調達した好中球については、アッセイ培地を添加して細胞密度を10〜6細胞/ミリリットルの1.1倍に調整する。次いで、1ウェルあたり180マイクロリットルのマウス好中球懸濁液を調製した96ウェルプレートに播種する。同様に、アッセイ培地を用いてヒト好中球細胞密度を1ミリリットル当たり10〜6細胞の2.2倍に調整する。アッセイ当日に、血球計算盤を用いて好中球様HL60細胞を手動で計数する。次いで、分化または未分化HL60細胞を300Gで室温で5分間遠心分離する。細胞をDMEMで1回洗浄し、アッセイ培地に再懸濁して、1ミリリットルあたり10〜6個の細胞の1.39倍の細胞密度を達成します。次に、180マイクロリットルの分化または未分化HL60細胞を、マウスおよびヒト好中球サンプルを含む予め調製された96ウェルプレートに播種する。最後に、播種中のバックグラウンド補正のために、細胞を含まない細胞培養プレートのコーナーウェルに完全な培地を追加します。プレートを室温で300Gで3分間中断することなく遠心分離し、プレートの底部に細胞が適切に付着することを確認します。最後に、プレートを1時間インキュベートして、細胞をアッセイ培地で事前に平衡化します。ミトコンドリアストレステストキットを開き、製造元の指示に従って試薬を準備します。次に、調製したオリゴマイシンをポートAに、FCCPをポートBに、ロテノン/抗マイシンA混合物をポートCに注入するために、試薬をカートリッジにロードします。未使用のポートに20マイクロリットルのアッセイ培地を充填します。アッセイの少なくとも5時間前に、Waveソフトウェアを開き、ヒーターオンタブをクリックして、アッセイシステムを摂氏37度で平衡化します。温度に達すると、Waveソフトウェアの左下隅に準備完了が表示されます。ソフトウェアでミトコンドリアストレスアッセイキットのテンプレートを開きます。左側で注入方法を選択し、[追加]をクリックして、注入条件にヒト好中球またはマウス好中球またはHL60という名前を付けます。ポートAからDをそれぞれクリックして選択し、[化合物の追加]をクリックして、オリゴマイシンまたはFCCPまたはロテノン/抗マイシンAをそれぞれの濃度で入力します。左側で[前処理]を選択し、[追加]をクリックして、CD18とCell Takに別々の名前を付けます。左側のセルタイプを選択します。次に、[追加]をクリックして、ヒト好中球、マウス好中球、およびHL60またはDHL60に名前を付け、必要に応じて摂食密度を付けます。[グループの追加] をクリックしてグループを定義します。次に、下線付きの定義をクリックします。トップメニューのプレートマップをクリックして、左側に定義があり、右側にプレートマップがあるすべてのグループを確認します。ドラッグアンドドロップして、4つのコーナーウェルを背景として維持しながら、各ウェルをグループに追加します。プロトコルを設定するには、トップメニューの[プロトコル]タブを選択し、混合時間を3分、休息時間を0分、測定を7分に設定して、ベースライン、オリゴマイシン、FCCP、ロテノン、抗マイシンA混合物の3サイクルを定義します。「アッセイの実行」ページに移動し、参照用のプロジェクト・サマリー情報を入力して、「実行の開始」をクリックします。アッセイの完了後にすべての結果が保存されるように、ファイルを保存する場所を指定します。次に、もう一度[実行の開始]をクリックします。アッセイの自動ロード後、トレイが開くのを待って、センサーカートリッジとプレートに200マイクロリットルのキャリブラントを入れます。カートリッジのバーコードの方向を右に向けて設定します。[準備完了] をクリックしてキャリブレーションを実行します。これには約 20 分かかります。キャリブレーション後、Open Trayをクリックし、プレートを細胞播種プレートと交換し、I'm Readyをクリックしてアッセイを続行します。アッセイが完了すると、データは自動的に保存されます。結果をスプレッドシートまたはその他の解析ソフトウェアファイルにエクスポートします。グラフをプロットし、データを分析します。酸素消費速度またはOCRの代表的な動態は、オリゴマイシン、FCCP、およびロテノンと抗マイシンAの混合物に応答して、マウスおよびヒト好中球、ならびに未分化および分化HL60細胞におけるミトコンドリア呼吸の変化を示した。FCCP処理は、電子の流れと酸素消費量を増加させて、OCR値を回復し、最大の呼吸を達成しました。ロテノンと抗マイシンAの混合物は、電子伝達鎖の複合体1および3をブロックし、ミトコンドリア呼吸の排除をもたらす。ミトコンドリア呼吸の低下は、好中球指向性分化後のHL60細胞で観察されました。分化したHL60細胞は、基底ミトコンドリア呼吸、プロトンリーク連鎖呼吸、ATP連鎖呼吸、および非ミトコンドリア呼吸が有意に低いことがわかりました。分化したHL60細胞の最大呼吸の増加は有意ではなかったが、予備の呼吸能力は有意に増加した。OCR値の読み取り中にセンサーカートリッジにフローティングセルによる障害物があってはならないため、セルがプレートの下部にあることを確認してください。この技術は、研究者が好中球関連研究における薬物またはミトコンドリア機能障害の効果を研究するのに役立ちます。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A TIRF Microscopy Technique for Real-time, Simultaneous Imaging of the TCR and its Associated Signaling Proteins

TCRとそれに関連するシグナル伝達タンパク質のリアルタイムの同時イメージングのための全反射顕微鏡法

Signaling is initiated through the T Cell Receptor (TCR) when it is engaged by antigenic peptide fragments bound by Major Histocompatibility Complex ...

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

複合体形成シグナリングT細胞のリアルタイムのライブイメージング

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

Bioenergetics and the Oxidative Burst: Protocols for the Isolation and Evaluation of Human Leukocytes and Platelets

ヒト白血球と血小板の単離と評価のためのプロトコル：生体エネルギーと酸化バースト

Mitochondrial dysfunction is known to play a significant role in a number of pathological conditions such as atherosclerosis, diabetes, septic shock, and ...

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

ヒト好中球における細胞外DNAのリリースおよび定量NET形成のハイスループット測定<em&gt;インビトロ</em

Neutrophil granulocytes are the most abundant leukocytes in the human blood. Neutrophils are the first to arrive at the site of infection. Neutrophils ...

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

リアルタイムで麻酔したマウスに生体顕微鏡により腸間膜静脈に好中球および単球のイメージング

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

Measuring Dengue Virus RNA in the Culture Supernatant of Infected Cells by Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction

量的なリアルタイムのポリメラーゼの連鎖反応による感染細胞の培養上清中のデング ウイルス RNA を測定

At present, real-time polymerase chain reaction (PCR) technology is an indispensable tool for the detection and quantification of viral genomes in ...

Robust Ligature-Induced Model of Murine Periodontitis for the Evaluation of Oral Neutrophils

口腔好中球評価のためのマウス歯肉炎の堅牢な合字誘発モデル

The main advantages of studying the pathophysiology of periodontal disease utilizing murine models are the reduced cost of animals, array of genetically ...

Pan-lyssavirus Real Time RT-PCR for Rabies Diagnosis

狂犬病診断のためのパンリサウイルスリアルタイムRT-PCR

Molecular assays are rapid, sensitive and specific, and have become central to diagnosing rabies. PCR based assays have been utilized for decades to ...

Monitoring Influenza Virus Survival Outside the Host Using Real-Time Cell Analysis

リアルタイム細胞解析を用いた宿主外でのインフルエンザウイルスの生存率のモニタリング

Methods for virus particle quantification represent a critical aspect of many virology studies. Although several reliable techniques exist, they are ...

Real-Time Quantification of Reactive Oxygen Species in Neutrophils Infected with Meningitic Escherichia Coli

Real-Time Quantification of Reactive Oxygen Species in Neutrophils Infected with Meningitic Escherichia Coli

髄膜炎性大腸菌に感染した好中球における活性酸素種のリアルタイム定量

Escherichia coli (E. coli) is the most common Gram-negative bacteria causing neonatal meningitis. The occurrence of bacteremia and bacterial penetration ...