Name: real-time measurement of the mitochondrial bioenergetic profile of neutrophils
Uploaded: 2023-06-02T13:00:00
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대사 세포외 플럭스 분석기 사용에 대한 교육을 제공한 UConn Health 면역학과의 Anthony T. Vella 박사와 Federica Aglianoin 박사, 기기를 지원해 주신 UConn Health 면역학과의 Lynn Puddington 박사에게 감사드립니다. 이 원고의 과학적 저술 및 편집에 도움을 준 UConn School of Medicine의 Geneva Hargis 박사에게 감사드립니다. 이 연구는 국립 보건원 (National Institutes of Health), 국립 심장, 폐 및 혈액 연구소 (National Heart, Lung, and Blood Institute, R01HL145454), 국립 일반 의학 연구소 (National Institute of General Medical Sciences, R35GM147713 and P20GM139763), UConn Health의 창업 기금 및 미국 면역 학자 협회 (American Association of Immunologists)의 경력 재진입 펠로우쉽.

헤파린화된 전혈 샘플은 헬싱키 선언에 따라 UConn Health의 기관 검토 위원회(Institutional Review Board of UConn Health)의 승인을 받은 정보에 입각한 동의를 얻은 후 건강한 인간 기증자로부터 얻었습니다. 모든 동물 실험은 UConn Health Institutional Animal Care and Use Committee(IACUC) 가이드라인을 따랐으며, 설치류 사용에 대한 승인은 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 Guide for the Care and Use of Laboratory Animals에 ?...

대사 세포외 플럭스 분석기를 사용하여 호중구의 미토콘드리아 호흡을 측정하는 표준 절차는 세포 수, 세포 성장 및 생존력을 포함한 많은 요인에 의해 제한됩니다. 각 화합물 농도는 이 분석에서 세포의 유형과 공급원에 따라 다릅니다. 올리고마이신과 로테논/안티마이신 A는 대부분의 세포 유형에서 비슷한 농도로 주로 사용됩니다. 그러나, FCCP에 의해 유도된 최대 호흡수는 상이한 세포들 사?...

미토콘드리아는 산화적 인산화(OXPHOS)에 의해 아데노신 삼인산(ATP)을 생성하는 세포 생물 에너지학에서 중요한 역할을 합니다. 이 외에도 미토콘드리아의 역할은 활성 산소 종의 생성 및 해독, 세포질 및 미토콘드리아 기질 칼슘 조절, 세포 합성, 이화 작용 및 세포 내 대사 산물의 수송으로 확장됩니다1. 미토콘드리아 호흡은 모든 세포에 필수적인데, 그 기능 장애는 심혈관 질환3과 연령 관련 황반변성4, 파킨슨병 및 알츠하이머병5, 샤르코-마리-투스병2 A(CMT2A)6와 같은 다양한 신경퇴행성 질환을 포함한 대사 문제2를 유발할 수 있기 때문이다.
호중구에 대한 전자 현미경 연구에 따르면 미토콘드리아는 상대적으로 적으며7 미토콘드리아는 미토콘드리아 호흡률이 매우 낮기 때문에 에너지 생산을 위해 해당과정에 크게 의존하고 있다8. 그러나 미토콘드리아는 화학주성9 및 세포자멸사10,11,12와 같은 호중구 기능에 중요합니다. 이전 연구에서는 높은 막 전위를 가진 인간 호중구에서 복잡한 미토콘드리아 네트워크를 밝혀냈습니다. 미토콘드리아 막의 전위 손실은 호중구 세포자멸사의 초기 지표이다10. 미토콘드리아 언커플러 카르보닐 시안화물 m-클로로페닐 히드라존(CCCP)을 사용한 치료는 미토콘드리아 형태의 변화와 함께 화학주성에서 상당한 억제를 보여주었습니다 9,10.
호중구의 주요 에너지원은 해당과정이지만, 미토콘드리아는 퓨린성 신호전달의 첫 번째 단계에 연료를 공급하여 호중구 활성화를 시작하는 ATP를 제공하며, 이는 Ca2+ 신호전달을 증가시키고, 미토콘드리아 ATP 생산을 증폭시키며, 호중구 기능적 반응을 개시한다13. 미토콘드리아 호흡 사슬의 기능 장애는 독성 활성 산소 종 (ROS)의 과도한 생산을 초래하고 병원성 손상을 초래합니다14,15,16. 호중구 세포외 트랩(NET)을 형성하는 과정인 NETosis는 호중구가 병원체에 대항하는 데 도움이 되는 중요한 특성이며17 암, 혈전증, 자가면역 질환18을 포함한 많은 병리학적 상태에 기여한다. 미토콘드리아 유래 ROS는 NETosis19에 기여하고, 미토콘드리아 DNA는 NETs18의 구성 요소가 될 수 있으며, 변경된 미토콘드리아 항상성은 NETosis 20,21,22,23,24를 손상시킵니다. 또한, 정상적인 분화 또는 성숙 동안, 호중구 대사 재 프로그래밍은 해당 작용 활성을 제한함으로써 역전되고, 미토콘드리아 호흡에 관여하고 세포 내 지질을 동원한다25,26.
대사 세포외 플럭스 분석기는 살아있는 세포 미토콘드리아 호흡 및 해당 과정을 지속적으로 모니터링하고 정량화할 수 있습니다. 분석기는 96웰 플레이트 형식 센서 카트리지와 2개의 형광단을 사용하여 산소(O2) 농도 및 pH 변화를 정량화합니다. 센서 카트리지는 분석 중에 세포 단층 위에 있으며 ~200nm 높이의 마이크로 챔버를 형성합니다. 분석기의 광섬유 다발은 형광단을 여기시키고 형광 강도 변화를 감지하는 데 사용됩니다. O2 농도 및 pH의 실시간 변화는 자동으로 계산되어 산소 소비율(OCR) 및 세포외 산성화율(ECAR)로 표시됩니다. 센서 카트리지에는 분석 측정 중에 각 웰에 최대 4개의 화합물을 로드할 수 있는 4개의 포트가 있습니다. 이 프로토콜은 대사 세포외 플럭스 분석기를 사용하여 마우스 및 인간 호중구와 호중구 유사 HL60 세포의 미토콘드리아 호흡을 정량화하는 데 중점을 둡니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>37 &#176;C non-CO2&#160;incubator</td>
			<td>Precision</td>
			<td>Economy Model 2EG</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biorender</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Software Application</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Model 5810R</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#160;Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive</td>
			<td>Corning</td>
			<td>102416-100</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep Magnet</td>
			<td>STEMCELL</td>
			<td>18000</td>
			<td>Magnet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySepMouse Neutrophil Enrichment kit</td>
			<td>STEMCELL</td>
			<td>19762A</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad Prism 9</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Software Application</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Serum Albumin Solution (25%)</td>
			<td>GeminiBio</td>
			<td>800-120</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine (VetaKet)</td>
			<td>DAILYMED</td>
			<td>NDC 59399-114-10</td>
			<td>Anesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>SH30256.01</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate buckets</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>UL155</td>
			<td>Accessory</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PolymorphPrep</td>
			<td>PROGEN</td>
			<td>1895 (previous 1114683)</td>
			<td>polysaccharide solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified mouse anti-human CD18 antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>302102</td>
			<td>Clone TS1/18</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11-875-093</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse metabolic extracellular flux analyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>XFe96</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF Cell Mito Stress Test Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>103015-100</td>
			<td>mitochondrial stress test Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swing-bucket rotor</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>A-4-62</td>
			<td>Rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vactrap 2 Vacum Trap</td>
			<td>Fox Lifesciences</td>
			<td>3052101-FLS</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wave</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Software Application</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF 1.0 M Glucose Solution</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>103577-100</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF 100 mM Pyruvate Solution</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>103578-100</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF 200 mM Glutamine Solution</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>103579-100</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF DMEM medium</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>103575-100</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XFe96 FluxPak</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>102601-100</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine (AnaSed Injection)</td>
			<td>DAILYMED</td>
			<td>NDC 59399-110-20</td>
			<td>Anesthetic</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time measurement of the mitochondrial bioenergetic profile of neutrophils

호중구는 인간의 첫 번째 방어선이자 가장 풍부한 백혈구입니다. 이러한 이펙터 세포는 식균 작용 및 산화 버스트와 같은 기능을 수행하고 미생물 제거를 위한 호중구 세포외 트랩(NET)을 생성합니다. 호중구의 대사 활동에 대한 새로운 통찰력은 호중구가 주로 해당과정에 의존한다는 초기 개념에 도전합니다. 대사 활동의 정확한 측정은 트리카르복실산(TCA) 회로(크렙스 회로라고도 함), 산화적 인산화(OXPHOS), 오탄당 인산염 경로(PPP) 및 지방산 산화(FAO)를 포함하여 호중구의 다양한 대사 요구 사항을 밝힐 수 있습니다. 이 논문은 대사 세포외 플럭스 분석기에서 대사 플럭스 분석을 사용하여 마우스 골수 유래 호중구, 인간 혈액 유래 호중구 및 호중구 유사 HL60 세포주에서 미토콘드리아 호흡의 지표로 산소 소비율(OCR)을 측정하기 위한 단계별 프로토콜 및 사전 요구 사항을 설명합니다. 이 방법은 정상 및 질병 조건 하에서 호중구의 미토콘드리아 기능을 정량화하는 데 사용할 수 있습니다.

마우스 호중구(도 3A), 인간 호중구(도 3B) 및 미분화 및 분화된 HL60 세포(도 3C)의 혼합물의 올리고마이신, FCCP 및 로테논/안티마이신 A에 대한 반응으로 미토콘드리아 호흡 변화를 나타내는 대표적인 OCR 동역학이 도시된다. 모든 세포에서, 올리고마이신 처리는 ATP 합성효소의 양성자 채널을 억제함으로써 OCR 값을 감소시키고; FCCP 치...

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Real-Time Measurement of the Mitochondrial Bioenergetic Profile of Neutrophils

대사 세포외 플럭스 분석기를 사용하여 마우스와 인간 호중구 및 HL60 세포의 미토콘드리아 호흡을 측정하는 단계적 프로토콜을 설명합니다.

호중구의 미토콘드리아 생물에너지 프로파일의 실시간 측정

Neutrophils are the first line of defense and the most abundant leukocytes in humans. These effector cells perform functions such as phagocytosis and ...

이 프로토콜은 대사 세포외 플럭스 분석기를 사용하여 마우스 및 인간 호중구와 호중구 유사 HL60 세포의 미토콘드리아 호흡을 정량화하는 데 중점을 둡니다. 이 방법을 사용하면 정상 및 질병 상태에서 호중구의 미토콘드리아 기능을 정량화할 수 있습니다. 이것은 약물이나 질병 상태에 대한 반응으로 세포의 미토콘드리아 기능에 대한 통찰력을 제공할 수 있는 간단한 기술입니다.세포마다 미토콘드리아 호흡 효율이 다르기 때문에 고품질 결과를 얻으려면 세포 파종 밀도와 시약 농도를 정확하게 최적화해야 합니다. 대사 세포외 플럭스 분석을 시작하려면 특별히 설계된 96웰 플레이트 위에 포장된 센서 카트리지를 사용하여 200마이크로리터의 보정 배지를 기본 플레이트의 각 웰에 옮깁니다. 보정제로 카트리지와 플레이트를 조심스럽게 들어 올리고 수분 공급을 위해 밤새 이산화탄소가 아닌 가습 섭씨 37도 인큐베이터에 넣습니다.다음으로, 세포 유형에 따라 세포 접착을 보장하기 위해 특정 코팅으로 96웰 플레이트를 코팅합니다. 그 후, 플레이트를 200 마이크로리터의 멸균 PBS로 2회 세척한다. 1 밀리몰 피루브산, 10 밀리몰 글루코스 및 2 밀리몰 글루타민으로 DMEM에서 분석 배지를 준비합니다.마우스 및 인간 호중구 세포를 텍스트 원고에 기술된 바와 같이 조달한다. 마우스로부터 조달된 호중구에 대해서는, 분석 배지를 첨가하여 세포 밀도를 밀리리터당 10 내지 6번째 세포로 1.1배로 조정하였다. 이어서, 마우스 호중구 현탁액을 웰 당 180 마이크로리터씩 준비된 96-웰 플레이트에 시딩한다.유사하게, 분석 배지를 사용하여 인간 호중구 세포 밀도를 2.2배 10 내지 밀리리터당 6번째 세포로 조정한다. 분석 당일에, 혈구계를 사용하여 수동으로 호중구 유사 HL60 세포를 계수한다. 그 후 분화 또는 미분화된 HL60 세포를 실온에서 300G에서 5분 동안 원심분리한다.세포를 DMEM으로 한번 세척하고, 이들을 분석 배지에서 재현탁시켜 밀리리터당 1.39 x 10 내지 6번째 세포의 세포 밀도를 달성한다. 다음으로, 분화 또는 미분화된 HL60 세포 180 마이크로리터를 마우스 및 인간 호중구 샘플을 함유하는 미리 준비된 96-웰 플레이트에 넣는다. 마지막으로, 파종하는 동안 배경 보정을 위해 세포가 없는 세포 배양 플레이트의 모서리 웰에 완전한 배지를 추가합니다.플레이트를 실온에서 3분 동안 원심분리하여 플레이트 바닥에 있는 세포가 제대로 부착되도록 합니다. 마지막으로, 플레이트를 1시간 동안 인큐베이션하여 세포를 분석 배지와 사전 평형화시킨다. 미토콘드리아 스트레스 테스트 키트를 열고 제조업체의 지침에 따라 시약을 준비합니다.다음으로, 준비된 올리고마이신을 포트 A로, FCCP를 포트 B로, 로테논/안티마이신 A 혼합물을 포트 C로 주입하여 시약으로 카트리지를 로드합니다. 사용하지 않는 포트를 20마이크로리터의 분석 배지로 채웁니다. Wave 소프트웨어를 열고 Heater On 탭을 클릭하여 분석 최소 5시간 전에 섭씨 37도에서 분석 시스템을 평형화합니다.온도에 도달하면 Wave 소프트웨어의 왼쪽 하단 모서리에 준비가 표시됩니다. 소프트웨어에서 미토콘드리아 스트레스 분석 키트에 대한 템플릿을 엽니다. 왼쪽에서 주입 전략을 선택한 다음 추가를 클릭하고 주입 조건의 이름을 인간 호중구 또는 마우스 호중구 또는 HL60으로 지정합니다.각각을 클릭하여 포트 A에서 D를 선택하고 화합물 추가를 클릭하고 각 농도의 올리고마이신 또는 FCCP 또는 로테논/안티마이신 A를 입력합니다. 왼쪽에서 전처리를 선택한 다음 추가를 클릭하고 이름을 CD18 및 Cell Tak으로 별도로 지정합니다. 왼쪽에서 셀 유형을 선택합니다.그런 다음 추가를 클릭하고 해당하는 경우 공급 밀도를 사용하여 이름을 인간 호중구, 마우스 호중구 및 HL60 또는 DHL60으로 지정합니다. Add Group(그룹 추가)을 클릭하여 그룹을 정의합니다. 그런 다음 밑줄이 그어진 정의를 클릭합니다.상단 메뉴에서 플레이트 맵을 클릭하면 왼쪽에 정의가 있고 오른쪽에 플레이트 맵이 있는 모든 그룹을 관찰할 수 있습니다. 끌어서 놓으면 네 개의 모서리 웰을 배경으로 유지하면서 각 웰을 그룹에 추가할 수 있습니다. 프로토콜을 설정하려면 상단 메뉴에서 프로토콜 탭을 선택하고 혼합 시간을 3분, 휴식을 0분, 측정을 7분으로 설정하여 기준선, 올리고마이신, FCCP, 로테논 및 안티마이신 A 혼합물의 3주기를 정의합니다.Run Assay 페이지로 이동하여 참조용 프로젝트 요약 정보를 제공하고 Start Run(실행 시작)을 클릭합니다. 분석 완료 후 모든 결과가 저장되도록 파일을 저장할 위치를 지정하십시오. 그런 다음 실행 시작을 다시 클릭합니다.분석을 자동으로 로드한 후 트레이가 열릴 때까지 기다렸다가 센서 카트리지와 플레이트에 200마이크로리터의 교정제를 놓습니다. 카트리지 바코드 방향을 오른쪽으로 설정합니다. I'm Ready(준비됨)를 클릭하여 보정을 실행하며, 이 작업에는 약 20분이 소요됩니다.보정 후 Open Tray(트레이 열기)를 클릭하고 플레이트를 세포 시드 플레이트로 교체한 다음 I'm Read(준비 완료)를 클릭하여 분석을 계속합니다. 분석 완료 후 데이터가 자동으로 저장됩니다. 결과를 스프레드시트 또는 기타 분석 소프트웨어 파일로 내보냅니다.그래프를 플로팅하고 데이터를 분석합니다. 산소 소비율 또는 OCR의 대표적인 역학은 올리고마이신, FCCP 및 로테논과 안티마이신의 혼합물에 반응하여 미분화 및 분화된 HL60 세포뿐만 아니라 마우스 및 인간 호중구에서 미토콘드리아 호흡의 변화를 나타냅니다. FCCP 치료는 전자의 흐름과 산소 소비를 증가시켜 OCR 값을 복원하고 최대 호흡을 달성했습니다.로테논과 안티마이신 A의 혼합물은 전자 수송 사슬의 복합체 1과 3을 차단하여 미토콘드리아 호흡을 제거합니다. 감소된 미토콘드리아 호흡은 호중구 지시 분화 후 HL60 세포에서 관찰되었습니다. 분화된 HL60 세포는 기저 미토콘드리아 호흡, 양성자 누출 연결 호흡, ATP 연결 호흡 및 비미토콘드리아 호흡이 유의하게 낮은 것으로 밝혀졌습니다.분화된 HL60 세포의 최대 호흡 증가는 크지 않은 반면, 예비 호흡 용량은 유의하게 증가했습니다. OCR 값을 읽는 동안 센서 카트리지가 플로팅 셀로 인해 장애물이 없어야 하므로 셀이 플레이트 바닥에 있는지 확인하십시오. 이 기술은 연구자들이 호중구 관련 연구에서 약물 또는 미토콘드리아 기능 장애의 효과를 연구하는 데 도움이 될 것입니다.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A TIRF Microscopy Technique for Real-time, Simultaneous Imaging of the TCR and its Associated Signaling Proteins

실시간, TCR의 동시 이미징 및 관련 신호 전달 단백질에 대한 TIRF 현미경 기법

Signaling is initiated through the T Cell Receptor (TCR) when it is engaged by antigenic peptide fragments bound by Major Histocompatibility Complex ...

연구

면역학 및 감염병학

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

T 세포의 실시간 라이브 영상은 복잡한 형성을 신호

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

Bioenergetics and the Oxidative Burst: Protocols for the Isolation and Evaluation of Human Leukocytes and Platelets

인간 백혈구 및 혈소판의 분리 및 평가를위한 프로토콜 : 생물 에너지와 산화 버스트

Mitochondrial dysfunction is known to play a significant role in a number of pathological conditions such as atherosclerosis, diabetes, septic shock, and ...

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

세포 외 DNA 릴리스의 높은 처리량 측정 및 인간 호중구의 양적 NET 형성<em&gt; 체외</em

Neutrophil granulocytes are the most abundant leukocytes in the human blood. Neutrophils are the first to arrive at the site of infection. Neutrophils ...

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At present, real-time polymerase chain reaction (PCR) technology is an indispensable tool for the detection and quantification of viral genomes in ...

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The main advantages of studying the pathophysiology of periodontal disease utilizing murine models are the reduced cost of animals, array of genetically ...

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광견병 진단을 위한 팬-리사바이러스 실시간 RT-PCR

Molecular assays are rapid, sensitive and specific, and have become central to diagnosing rabies. PCR based assays have been utilized for decades to ...

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실시간 세포 분석을 사용하여 호스트 외부인플루엔자 바이러스 생존 모니터링

Methods for virus particle quantification represent a critical aspect of many virology studies. Although several reliable techniques exist, they are ...

Real-Time Quantification of Reactive Oxygen Species in Neutrophils Infected with Meningitic Escherichia Coli

Real-Time Quantification of Reactive Oxygen Species in Neutrophils Infected with Meningitic Escherichia Coli

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