Name: real-time measurement of the mitochondrial bioenergetic profile of neutrophils
Uploaded: 2023-06-02T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real-Time Measurement of the Mitochondrial Bioenergetic Profile of Neutrophils at JoVE.com

Vi anerkjenner Dr. Anthony T. Vella og Dr. Federica Aglianoin fra Institutt for immunologi ved UConn Health for deres opplæring i bruk av metabolsk ekstracellulær fluksanalysator, og Dr. Lynn Puddington i Institutt for immunologi ved UConn Health for hennes støtte til instrumentene. Vi anerkjenner Dr. Geneva Hargis fra UConn School of Medicine for hennes hjelp med vitenskapelig skriving og redigering av dette manuskriptet. Denne forskningen ble støttet av tilskudd fra National Institutes of Health, National Heart, Lung and Blood Institute (R01HL145454), National Institute of General Medical Sciences (R35GM147713 og P20GM139763), et oppstartsfond fra UConn Health og et karrierestipend fra American Association of Immunologs.

Hepariniserte fullblodsprøver ble innhentet fra friske humane donorer etter å ha innhentet informert samtykke, som godkjent av Institutional Review Board of UConn Health i samsvar med Helsinkideklarasjonen. Alle dyreforsøk fulgte UConn Health Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) retningslinjer, og godkjenning for bruk av gnagere ble innhentet fra UConn Health IACUC i henhold til kriterier som er skissert i veiledningen for omsorg og bruk av forsøksdyr fra National Institutes of Health. Hannmus C57BL/6 ...

Standardprosedyren som måler mitokondriell respirasjon av nøytrofiler ved hjelp av metabolsk ekstracellulær fluksanalysator er begrenset av mange faktorer, inkludert celleantall, cellevekst og levedyktighet. Hver sammensatt konsentrasjon varierer mellom type og kilde til celler i denne analysen. Oligomycin og rotenon/antimycin A brukes mest i en lignende konsentrasjon blant de fleste celletyper. Siden FCCP-indusert maksimal respirasjonsfrekvens varierer mellom forskjellige celler, er det imidlertid nødvendig med for...

Mitokondrier spiller en viktig rolle i cellebioenergetikk, som genererer adenosintrifosfat (ATP) ved oksidativ fosforylering (OXPHOS). I tillegg til dette strekker mitokondriens rolle seg inn i generering og avgiftning av reaktive oksygenarter, cytoplasmatisk og mitokondriell matrikskalsiumregulering, cellulær syntese, katabolisme og transport av metabolitter i cellen1. Mitokondriell respirasjon er viktig i alle celler, da deres dysfunksjon kan resultere i metabolske problemer 2, inkludert kardiovaskulære sykdommer3 og et bredt spekter av nevrodegenerative sykdommer, som aldersrelatert makuladegenerasjon4, Parkinsons og Alzheimers sykdommer5 og Charcot-Marie-Tooth sykdom2 A (CMT2A) 6.
Elektronmikroskopiske studier på nøytrofiler viste at det er relativt få mitokondrier7, og de er avhengige av glykolyse for energiproduksjonen, da mitokondriell respirasjonsfrekvens er svært lav8. Imidlertid er mitokondrier avgjørende for nøytrofile funksjoner, som kjemotaksis9 og apoptose10,11,12. En tidligere studie avslørte et komplekst mitokondrielt nettverk i humane nøytrofiler med høyt membranpotensial. Mitokondriemembranens potensielle tap er en tidlig indikator på nøytrofil apoptose10. Behandling med mitokondriell utkobling av karbonylcyanid m-klorfenylhydrazon (CCCP) viste signifikant hemming i kjemotaksis, sammen med endring i mitokondriell morfologi 9,10.
Selv om den primære energikilden for nøytrofiler er glykolyse, gir mitokondrier ATP som initierer nøytrofil aktivering ved å brenne den første fasen av purinerg signalering, noe som øker Ca2 + -signalering, forsterker mitokondriell ATP-produksjon og initierer nøytrofile funksjonelle responser13. Dysfunksjon av mitokondrie-respirasjonskjeden resulterer i overdreven produksjon av giftige reaktive oksygenarter (ROS) og fører til patogene skader14,15,16. NETosis, som er prosessen med å danne nøytrofile ekstracellulære feller (NET), er en kritisk egenskap hos nøytrofiler som hjelper dem med å bekjempe patogener17 og bidrar til mange patologiske forhold, inkludert kreft, trombose og autoimmune lidelser18. Mitokondrie-avledet ROS bidrar til NETosis19, mitokondrielt DNA kan være en komponent i NET18, og endret mitokondriell homeostase svekker NETosis 20,21,22,23,24. Videre, under normal differensiering eller modning, blir nøytrofil metabolsk omprogrammering reversert ved å begrense glykolytisk aktivitet, og de engasjerer seg i mitokondriell respirasjon og mobiliserer intracellulære lipider25,26.
Den metabolske ekstracellulære fluksanalysatoren kan kontinuerlig overvåke og kvantifisere levende celle mitokondriell respirasjon og glykolyse. Analysatoren benytter en 96-brønns plateformat sensorpatron og to fluoroforer for å kvantifisere oksygenkonsentrasjon (O2) og pH-endringer. Sensorpatronen er over cellemonolaget under analysen og danner et ~ 200 nm høyt mikrokammer. De optiske fiberbuntene i analysatoren brukes til å opphisse fluoroforene og oppdage fluorescerende intensitetsendringer. Sanntidsendringer iO2-konsentrasjon og pH beregnes automatisk og vises som oksygenforbrukshastighet (OCR) og ekstracellulær forsuringshastighet (ECAR). Det er fire porter på sensorkassetten som tillater lasting av opptil fire forbindelser i hver brønn under analysemålingene. Denne protokollen fokuserer på å kvantifisere mitokondriell respirasjon av mus og humane nøytrofiler, samt de nøytrofillignende HL60-cellene, ved hjelp av den metabolske ekstracellulære fluksanalysatoren.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>37 &#176;C non-CO2&#160;incubator</td>
			<td>Precision</td>
			<td>Economy Model 2EG</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biorender</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Software Application</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Model 5810R</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#160;Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive</td>
			<td>Corning</td>
			<td>102416-100</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep Magnet</td>
			<td>STEMCELL</td>
			<td>18000</td>
			<td>Magnet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySepMouse Neutrophil Enrichment kit</td>
			<td>STEMCELL</td>
			<td>19762A</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad Prism 9</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Software Application</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Serum Albumin Solution (25%)</td>
			<td>GeminiBio</td>
			<td>800-120</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine (VetaKet)</td>
			<td>DAILYMED</td>
			<td>NDC 59399-114-10</td>
			<td>Anesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>SH30256.01</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate buckets</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>UL155</td>
			<td>Accessory</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PolymorphPrep</td>
			<td>PROGEN</td>
			<td>1895 (previous 1114683)</td>
			<td>polysaccharide solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified mouse anti-human CD18 antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>302102</td>
			<td>Clone TS1/18</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11-875-093</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse metabolic extracellular flux analyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>XFe96</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF Cell Mito Stress Test Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>103015-100</td>
			<td>mitochondrial stress test Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swing-bucket rotor</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>A-4-62</td>
			<td>Rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vactrap 2 Vacum Trap</td>
			<td>Fox Lifesciences</td>
			<td>3052101-FLS</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wave</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Software Application</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF 1.0 M Glucose Solution</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>103577-100</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF 100 mM Pyruvate Solution</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>103578-100</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF 200 mM Glutamine Solution</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>103579-100</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF DMEM medium</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>103575-100</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XFe96 FluxPak</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>102601-100</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine (AnaSed Injection)</td>
			<td>DAILYMED</td>
			<td>NDC 59399-110-20</td>
			<td>Anesthetic</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time measurement of the mitochondrial bioenergetic profile of neutrophils

Neutrofiler er den første forsvarslinjen og de rikeste leukocytter hos mennesker. Disse effektorcellene utfører funksjoner som fagocytose og oksidativt utbrudd, og skaper nøytrofile ekstracellulære feller (NET) for mikrobiell clearance. Ny innsikt i nøytrofilenes metabolske aktiviteter utfordrer det tidlige konseptet om at de primært er avhengige av glykolyse. Nøyaktig måling av metabolske aktiviteter kan utfolde forskjellige metabolske krav til nøytrofiler, inkludert trikarboksylsyre (TCA) -syklusen (også kjent som Krebs-syklusen), oksidativ fosforylering (OXPHOS), pentosefosfatvei (PPP) og fettsyreoksidasjon (FAO) under fysiologiske forhold og sykdomstilstander. Denne artikkelen beskriver en trinnvis protokoll og forutsetninger for å måle oksygenforbrukshastighet (OCR) som en indikator på mitokondriell respirasjon på nøytrofiler fra benmarg fra mus, humane blodavledede nøytrofiler og den nøytrofillignende HL60-cellelinjen, ved bruk av metabolsk fluksanalyse på en metabolsk ekstracellulær fluksanalysator. Denne metoden kan brukes til å kvantifisere mitokondrielle funksjoner av nøytrofiler under normale og sykdomsforhold.

Representativ OCR-dynamikk er vist som indikerer mitokondrielle respirasjonsendringer som respons på oligomycin, FCCP og rotenon/antimycin A-blanding av nøytrofile museceller (figur 3A), humane nøytrofile granulocytter (figur 3B) og udifferensierte og differensierte HL60-celler (figur 3C). I alle celler reduserer oligomycinbehandling OCR-verdien ved å hemme protonkanalen til ATP-syntase; FCCP-behandling gjenoppretter OCR-verdien...

Watch this Scientific Journal Video about Real-Time Measurement of the Mitochondrial Bioenergetic Profile of Neutrophils at JoVE.com

Real-Time Measurement of the Mitochondrial Bioenergetic Profile of Neutrophils

Vi beskriver trinnvise protokoller som måler mitokondriell respirasjon av mus og humane nøytrofiler og HL60-celler ved hjelp av metabolsk ekstracellulær fluksanalysator.

Sanntidsmåling av den mitokondrielle bioenergetiske profilen til nøytrofiler

Neutrophils are the first line of defense and the most abundant leukocytes in humans. These effector cells perform functions such as phagocytosis and ...

Denne protokollen fokuserer på å kvantifisere mitokondriell respirasjon av mus og humane nøytrofiler, samt nøytrofillignende HL60-celler ved bruk av metabolsk ekstracellulær fluksanalysator. Denne metoden tillater oss å kvantifisere mitokondriell funksjon i nøytrofiler under normale og sykdomsforhold. Dette er en enkel teknikk som kan gi innsikt i mitokondriefunksjonen til cellene som respons på medisiner eller enhver sykdomstilstand.Siden forskjellige celler har forskjellig mitokondriell respiratorisk effektivitet, må optimalisering av cellesåingstetthet og reagenskonsentrasjon utføres nøyaktig for å få resultater av høy kvalitet. For å starte den metabolske ekstracellulære fluxanalysen, ta en sensorpatron pakket over en spesialdesignet 96-brønnsplate og overfør 200 mikroliter kalibreringsmedium til hver brønn i den underliggende platen. Løft forsiktig patronen og platen med kalibrant, og legg den i en ikke-karbondioksidfuktet 37 grader Celsius-inkubator over natten for hydrering.Deretter, basert på celletypen, belegg 96-brønnplaten med et spesifikt belegg for å sikre celleadhesjon. Etterpå vasker du platene med 200 mikroliter steril PBS to ganger. Forbered analysemediet i DMEM med ett millimolært pyruvat, 10 millimolar glukose og to millimolært glutamin.Skaff mus og humane nøytrofile celler som beskrevet i tekstmanuskriptet. For nøytrofilene som er anskaffet fra musen, juster celletettheten til 1,1 ganger 10 til den sjette cellen per milliliter ved å tilsette analysemedium. Deretter frø 180 mikroliter av musens nøytrofile suspensjon per brønn inn i den forberedte 96-brønnplaten.På samme måte justerer du den humane nøytrofile celletettheten til 2, 2 ganger 10 til den sjette cellen per milliliter ved bruk av analysemediet. På analysedagen, telle de nøytrofillignende HL60-cellene manuelt ved hjelp av hemocytometeret. Deretter sentrifugerer du de differensierte eller udifferensierte HL60-cellene ved 300G ved romtemperatur i fem minutter.Vask cellene med DMEM en gang og suspender dem på nytt i analysemediet for å oppnå en celletetthet på 1,39 ganger 10 til den sjette cellen per milliliter. Deretter frø 180 mikroliter differensierte eller udifferensierte HL60-celler inn i den forberedte 96-brønnplaten som inneholder mus og humane nøytrofile prøver. Til slutt, legg komplett medium til hjørnebrønnene på cellekulturplaten uten celler for bakgrunnskorreksjon under såing.Sentrifuger platen ved 300G ved romtemperatur i tre minutter uten pause for å sikre riktig festing av cellene på bunnen av platen. Til slutt inkuberer du platen i en time for å forhåndsbalansere cellene med analysemediet. Åpne mitokondriestresstestsettet og klargjør reagensene i henhold til produsentens instruksjoner.Deretter fyller du sylinderampullen med reagenser, starter med det tilberedte oligomycinet i port A, FCCP i port B og rotenon/antimycin A-blandingen i port C for injeksjoner. Fyll de ubrukte portene med 20 mikroliter analysemedium. Balanser analysesystemet ved 37 grader Celsius minst fem timer før analysen ved å åpne Wave-programvaren og klikke på Heater On-fanen.Etter å ha nådd temperaturen, viser nedre venstre hjørne av Wave-programvaren klar. Åpne en mal for mitokondrielt stressanalysesett i programvaren. Velg injeksjonsstrategier på venstre side, klikk deretter på Legg til og navngi injeksjonstilstanden som humane nøytrofile granulocytter eller nøytrofile mus eller HL60.Velg port A til D ved å klikke på hver, og klikk på Legg til forbindelse og skriv inn oligomycin eller FCCP eller rotenon / antimycin A med de respektive konsentrasjonene. Velg Forbehandling på venstre side, klikk deretter Legg til og gi dem navn CD18 og Cell Tak separat. Velg Celletype på venstre side.Klikk deretter på Legg til og gi dem navn for humane nøytrofiler, nøytrofiler fra mus og HL60 eller DHL60 med en matetetthet. Definer gruppene ved å klikke på Legg til gruppe. Klikk deretter på den understrekede definisjonen.Klikk på Platekart i toppmenyen for å observere alle gruppene med definisjoner på venstre side og platekartet til høyre. Dra og slipp for å legge til hver brønn i gruppen mens du beholder de fire hjørnebrønnene som bakgrunn. For å konfigurere protokollen, velg kategorien Protokoll i toppmenyen, og definer tre sykluser av baseline, oligomycin, FCCP, rotenon og antimycin A-blanding, ved å sette tiden til å blande som tre minutter, hvile som null minutter og måle som syv minutter.Gå til siden Kjør analyse, oppgi prosjektsammendragsinformasjonen for referanse, og klikk Start kjøring. Gi plasseringen for å lagre filene slik at alle resultatene lagres etter at analysen er fullført. Klikk deretter på Start Run igjen.Etter automatisk lasting av analysen, vent til skuffen åpnes for å plassere sensorkassetten og platen med 200 mikroliter kalibrant. Sett strekkoderetningen for patronen vendt mot høyre. Kjør kalibreringen ved å klikke I'm Ready, noe som tar omtrent 20 minutter.Etter kalibreringen, klikk på Åpne skuff, erstatt platen med cellefrøplaten, og klikk på Jeg er klar for å fortsette analysen. Etter at analysen er fullført, lagres dataene automatisk. Eksporter resultatene til et regneark eller en annen analyseprogramvarefil.Plott grafen og analyser dataene. Den representative dynamikken i oksygenforbrukshastighet eller OCR indikerte endringer i mitokondriell respirasjon i mus og humane nøytrofiler, samt udifferensierte og differensierte HL60-celler som respons på oligomycin, FCCP og blandingen av rotenon og antimycin A.OCR-verdiene ble redusert i alle celler etter oligomycinbehandling på grunn av inhibering av protonkanalen til ATP-syntase. FCCP-behandling økte strømmen av elektroner og oksygenforbruk for å gjenopprette OCR-verdien og oppnå maksimal respirasjon.En blanding av rotenon og antimycin A blokkerte komplekser 1 og 3 av elektrontransportkjeden, noe som førte til eliminering av mitokondriell respirasjon. Redusert mitokondriell respirasjon ble observert i HL60-celler etter nøytrofilrettet differensiering. Differensierte HL60-celler ble funnet å ha signifikant lavere basal mitokondriell respirasjon, protonlekkasjebundet respirasjon, ATP-bundet respirasjon og ikke-mitokondriell respirasjon.Økningen i maksimal respirasjon av differensierte HL60-celler var ikke betydelig, mens den ledige respirasjonskapasiteten ble signifikant økt. Forsikre deg om at cellene er i bunnen av platen, da sensorkassetten ikke skal ha noen hindringer på grunn av de flytende cellene mens du leser OCR-verdien. Denne teknikken vil hjelpe forskere til å studere effekten av narkotika eller mitokondriell dysfunksjon i nøytrofilassosierte studier.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A TIRF Microscopy Technique for Real-time, Simultaneous Imaging of the TCR and its Associated Signaling Proteins

En TIRF Mikroskopi Teknikk for Real-time, samtidig avbildning av TCR og tilhørende signalveier Proteiner

Signaling is initiated through the T Cell Receptor (TCR) when it is engaged by antigenic peptide fragments bound by Major Histocompatibility Complex ...

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

Real-time Live Imaging av T-celle signalisering Complex Formation

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

Bioenergetics and the Oxidative Burst: Protocols for the Isolation and Evaluation of Human Leukocytes and Platelets

Bioenergi og Oksidativt Burst: Protokoller for isolering og evaluering av humane leukocytter og blodplater

Mitochondrial dysfunction is known to play a significant role in a number of pathological conditions such as atherosclerosis, diabetes, septic shock, and ...

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

Høy gjennomstrømning Måling av ekstracellulært DNA Slipp og kvantitative NET-formasjonen i Human Neutrophils<em&gt; In Vitro</em

Neutrophil granulocytes are the most abundant leukocytes in the human blood. Neutrophils are the first to arrive at the site of infection. Neutrophils ...

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

Imaging Neutrofiler og monocytter i mesenterisk Veins av intraMikros på bedøvet Mus i sanntid

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

Measuring Dengue Virus RNA in the Culture Supernatant of Infected Cells by Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction

Måle Dengue Virus RNA i kultur nedbryting av infiserte celler av sanntids kvantitative polymerasekjedereaksjons

At present, real-time polymerase chain reaction (PCR) technology is an indispensable tool for the detection and quantification of viral genomes in ...

Robust Ligature-Induced Model of Murine Periodontitis for the Evaluation of Oral Neutrophils

Robust ligatur-indusert modell av murine periodontitt for evalueringen av muntlig nøytrofile

The main advantages of studying the pathophysiology of periodontal disease utilizing murine models are the reduced cost of animals, array of genetically ...

Pan-lyssavirus Real Time RT-PCR for Rabies Diagnosis

Pan-lyssavirus Real Time RT-PCR for rabies diagnose

Molecular assays are rapid, sensitive and specific, and have become central to diagnosing rabies. PCR based assays have been utilized for decades to ...

Monitoring Influenza Virus Survival Outside the Host Using Real-Time Cell Analysis

Overvåking av influensavirusoverlevelse utenfor verten ved hjelp av sanntidscelleanalyse

Methods for virus particle quantification represent a critical aspect of many virology studies. Although several reliable techniques exist, they are ...

Real-Time Quantification of Reactive Oxygen Species in Neutrophils Infected with Meningitic Escherichia Coli

Real-Time Quantification of Reactive Oxygen Species in Neutrophils Infected with Meningitic Escherichia Coli

Sanntids kvantifisering av reaktive oksygenarter i nøytrofiler smittet med meningittisk escherichia coli

Escherichia coli (E. coli) is the most common Gram-negative bacteria causing neonatal meningitis. The occurrence of bacteremia and bacterial penetration ...