Name: real-time measurement of the mitochondrial bioenergetic profile of neutrophils
Uploaded: 2023-06-02T13:00:00
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Agradecemos ao Dr. Anthony T. Vella e à Dra. Federica Aglianoin do Departamento de Imunologia da UConn Health por seu treinamento no uso do analisador de fluxo extracelular metabólico, e à Dra. Lynn Puddington no Departamento de Imunologia da UConn Health por seu apoio aos instrumentos. Agradecemos à Dra. Geneva Hargis, da UConn School of Medicine, por sua ajuda na redação científica e edição deste manuscrito. Esta pesquisa foi apoiada por subsídios dos Institutos Nacionais de Saúde, Instituto Nacional do Coração, Pulmão e Sangue (R01HL145454), Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais (R35GM147713 e P20GM139763), um fundo de inicialização da UConn Health e uma bolsa de reentrada na carreira da Associação Americana de Imunologistas.

Amostras de sangue total heparinizadas foram obtidas de doadores humanos saudáveis após a obtenção do consentimento informado, conforme aprovado pelo Comitê de Revisão Institucional da UConn Health de acordo com a Declaração de Helsinque. Todos os experimentos com animais seguiram as diretrizes do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da UConn Health (IACUC), e a aprovação para o uso de roedores foi obtida da IACUC da UConn Health de acordo com os critérios descritos no Guide for the Care and Use ...

O procedimento padrão que mede a respiração mitocondrial de neutrófilos usando o analisador de fluxo extracelular metabólico é limitado por muitos fatores, incluindo número celular, crescimento celular e viabilidade. Cada concentração de composto varia entre o tipo e a fonte de células neste ensaio. Oligomicina e rotenona/antimicina A são usadas principalmente em uma concentração semelhante entre a maioria dos tipos celulares. No entanto, como a frequência respiratória máxima induzida pelo FCCP varia ent...

As mitocôndrias desempenham um papel importante na bioenergética celular, que gera trifosfato de adenosina (ATP) por fosforilação oxidativa (OXPHOS). Além disso, o papel das mitocôndrias se estende à geração e desintoxicação de espécies reativas de oxigênio, regulação do cálcio da matriz citoplasmática e mitocondrial, síntese celular, catabolismo e transporte de metabólitos dentro da célula1. A respiração mitocondrial é essencial em todas as células, pois sua disfunção pode resultar em problemas metabólicos 2, incluindo doenças cardiovasculares3 e uma grande variedade de doenças neurodegenerativas, como degeneração macular relacionada à idade4, Parkinson e Alzheimer5 e doença de Charcot-Marie-Tooth2 A (CMT2A)6.
Estudos de microscopia eletrônica em neutrófilos revelaram que há relativamente poucas mitocôndrias7, e elas dependem fortemente da glicólise para sua produção de energia, uma vez que as taxas de respiração mitocondrial são muito baixas8. Entretanto, as mitocôndrias são cruciais para as funções dos neutrófilos, como quimiotaxia9 e apoptose10,11,12. Um estudo anterior revelou uma complexa rede mitocondrial em neutrófilos humanos com alto potencial de membrana. A perda do potencial de membrana mitocondrial é um indicador precoce de apoptose neutrofílica10. O tratamento com o desacoplador mitocondrial carbonil cianeto m-clorofenil hidrazona (CCCP) mostrou inibição significativa da quimiotaxia, juntamente com alteração na morfologia mitocondrial 9,10.
Embora a principal fonte de energia para os neutrófilos seja a glicólise, as mitocôndrias fornecem o ATP que inicia a ativação dos neutrófilos alimentando a primeira fase da sinalização purinérgica, que aumenta a sinalização de Ca2+, amplifica a produção de ATP mitocondrial e inicia as respostas funcionais dos neutrófilos13. A disfunção da cadeia respiratória mitocondrial resulta na produção excessiva de espécies reativas tóxicas de oxigênio (EROs) e leva a danos patogênicos14,15,16. NETosis, que é o processo de formação de armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs), é uma propriedade crítica dos neutrófilos que os ajuda a lutar contra patógenos17 e contribui para muitas condições patológicas, incluindo câncer, trombose e doenças autoimunes18. As ERO derivadas da mitocôndria contribuem para a NETosis19, o DNA mitocondrial pode ser um componente das NETs18 e a homeostase mitocondrial alterada prejudica a NETosis 20,21,22,23,24. Além disso, durante a diferenciação ou maturação normal, a reprogramação metabólica dos neutrófilos é revertida pela limitação da atividade glicolítica, que se engaja na respiração mitocondrial e mobiliza lipídios intracelulares25,26.
O analisador de fluxo extracelular metabólico pode monitorar e quantificar continuamente a respiração mitocondrial de células vivas e a glicólise. O analisador utiliza um cartucho sensor em formato de placa de 96 poços e dois fluoróforos para quantificar a concentração de oxigênio (O2) e as mudanças de pH. O cartucho do sensor está acima da monocamada da célula durante o ensaio e forma uma microcâmara de ~200 nm de altura. Os feixes de fibras ópticas no analisador são usados para excitar os fluoróforos e detectar as mudanças de intensidade fluorescente. Mudanças em tempo real na concentração de O2 e pH são automaticamente calculadas e mostradas como taxa de consumo de oxigênio (OCR) e taxa de acidificação extracelular (ECAR). Há quatro portas no cartucho do sensor que permitem carregar até quatro compostos em cada poço durante as medições de ensaio. Este protocolo concentra-se em quantificar a respiração mitocondrial de neutrófilos humanos e camundongos, bem como as células HL60 semelhantes a neutrófilos, usando o analisador de fluxo extracelular metabólico.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>37 &#176;C non-CO2&#160;incubator</td>
			<td>Precision</td>
			<td>Economy Model 2EG</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biorender</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Software Application</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Model 5810R</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#160;Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive</td>
			<td>Corning</td>
			<td>102416-100</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep Magnet</td>
			<td>STEMCELL</td>
			<td>18000</td>
			<td>Magnet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySepMouse Neutrophil Enrichment kit</td>
			<td>STEMCELL</td>
			<td>19762A</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad Prism 9</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Software Application</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Serum Albumin Solution (25%)</td>
			<td>GeminiBio</td>
			<td>800-120</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine (VetaKet)</td>
			<td>DAILYMED</td>
			<td>NDC 59399-114-10</td>
			<td>Anesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>SH30256.01</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate buckets</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>UL155</td>
			<td>Accessory</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PolymorphPrep</td>
			<td>PROGEN</td>
			<td>1895 (previous 1114683)</td>
			<td>polysaccharide solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified mouse anti-human CD18 antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>302102</td>
			<td>Clone TS1/18</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11-875-093</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse metabolic extracellular flux analyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>XFe96</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF Cell Mito Stress Test Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>103015-100</td>
			<td>mitochondrial stress test Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swing-bucket rotor</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>A-4-62</td>
			<td>Rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vactrap 2 Vacum Trap</td>
			<td>Fox Lifesciences</td>
			<td>3052101-FLS</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wave</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Software Application</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF 1.0 M Glucose Solution</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>103577-100</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF 100 mM Pyruvate Solution</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>103578-100</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF 200 mM Glutamine Solution</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>103579-100</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF DMEM medium</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>103575-100</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XFe96 FluxPak</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>102601-100</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine (AnaSed Injection)</td>
			<td>DAILYMED</td>
			<td>NDC 59399-110-20</td>
			<td>Anesthetic</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time measurement of the mitochondrial bioenergetic profile of neutrophils

Os neutrófilos são a primeira linha de defesa e os leucócitos mais abundantes em humanos. Essas células efetoras desempenham funções como fagocitose e explosão oxidativa, e criam armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs) para depuração microbiana. Novos conhecimentos sobre as atividades metabólicas dos neutrófilos desafiam o conceito inicial de que eles dependem principalmente da glicólise. A medição precisa das atividades metabólicas pode desdobrar diferentes exigências metabólicas dos neutrófilos, incluindo o ciclo do ácido tricarboxílico (TCA) (também conhecido como ciclo de Krebs), fosforilação oxidativa (OXPHOS), via das pentoses fosfato (PPP) e oxidação de ácidos graxos (FAO) sob condições fisiológicas e em estados patológicos. Este artigo descreve um protocolo passo-a-passo e pré-requisitos para medir a taxa de consumo de oxigênio (OCR) como um indicador da respiração mitocondrial em neutrófilos derivados da medula óssea de camundongos, neutrófilos derivados do sangue humano e a linhagem celular HL60 semelhante a neutrófilos, usando análise de fluxo metabólico em um analisador de fluxo extracelular metabólico. Este método pode ser usado para quantificar as funções mitocondriais de neutrófilos em condições normais e de doença.

Dinâmica representativa de OCR é mostrada indicando as alterações da respiração mitocondrial em resposta à oligomicina, FCCP e mistura de rotenona/antimicina A de neutrófilos de camundongos (Figura 3A), neutrófilos humanos (Figura 3B) e células HL60 indiferenciadas e diferenciadas (Figura 3C). Em todas as células, o tratamento com oligomicina diminui o valor de OCR inibindo o canal de prótons da ATP sintase; O tratamento...

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Real-Time Measurement of the Mitochondrial Bioenergetic Profile of Neutrophils

Descrevemos protocolos stepwise medindo a respiração mitocondrial de neutrófilos humanos e camundongos e células HL60 usando o analisador de fluxo extracelular metabólico.

Mensuração em Tempo Real do Perfil Bioenergético Mitocondrial de Neutrófilos

Neutrophils are the first line of defense and the most abundant leukocytes in humans. These effector cells perform functions such as phagocytosis and ...

Este protocolo concentra-se na quantificação da respiração mitocondrial de neutrófilos humanos e de camundongos, bem como de células HL60 semelhantes a neutrófilos usando o analisador de fluxo extracelular metabólico. Este método permite quantificar a função mitocondrial em neutrófilos em condições normais e de doença. Esta é uma técnica simples que pode fornecer informações sobre a função mitocondrial das células em resposta a drogas ou qualquer condição de doença.Uma vez que diferentes células têm diferentes eficiências respiratórias mitocondriais, a otimização da densidade de semeadura celular e da concentração de reagentes deve ser realizada com precisão para obter resultados de alta qualidade. Para iniciar o ensaio de fluxo extracelular metabólico, pegue um cartucho de sensor embalado sobre uma placa de 96 poços especialmente projetada e transfira 200 microlitros de meio de calibração para cada poço da placa subjacente. Levante cuidadosamente o cartucho e a placa com calibrador e coloque-o em uma incubadora não umidificada de dióxido de carbono a 37 graus Celsius durante a noite para hidratação.Em seguida, com base no tipo de célula, revestir a placa de 96 poços com um revestimento específico para garantir a adesão celular. Depois, lave as placas com 200 microlitros de PBS estéril duas vezes. Preparar o meio de ensaio em DMEM com um piruvato milimolar, glicose 10 milimolares e glutamina milimolar.Procure as células de camundongo e de neutrófilos humanos conforme descrito no manuscrito do texto. Para os neutrófilos obtidos do rato, ajuste a densidade celular para 1,1 vezes 10 à sexta célula por mililitro adicionando meio de ensaio. Em seguida, semeie 180 microlitros da suspensão de neutrófilos de camundongo por poço na placa preparada de 96 poços.Da mesma forma, ajustar a densidade de células de neutrófilos humanos para 2,2 vezes 10 para a sexta células por mililitro usando o meio de ensaio. No dia do ensaio, conte manualmente as células HL60 semelhantes a neutrófilos usando o hemocitômetro. Em seguida, centrifugar as células HL60 diferenciadas ou indiferenciadas a 300G à temperatura ambiente por cinco minutos.Lave as células com DMEM uma vez e suspenda-as novamente no meio de ensaio para atingir uma densidade celular de 1,39 vezes 10 a sexta células por mililitro. Em seguida, semeie 180 microlitros de células HL60 diferenciadas ou indiferenciadas na placa pré-preparada de 96 poços contendo amostras de neutrófilos de camundongos e humanos. Finalmente, adicione meio completo aos poços de canto da placa de cultura de células desprovida de células para correção de fundo durante a semeadura.Centrifugar a placa a 300G à temperatura ambiente durante três minutos sem pausa para garantir a aderência adequada das células no fundo da placa. Finalmente, incubar a placa por uma hora para pré-equilibrar as células com o meio de ensaio. Abra o kit de teste de estresse mitocondrial e prepare os reagentes de acordo com as instruções do fabricante.Em seguida, carregue o cartucho com reagentes, começando com a oligomicina preparada na porta A, FCCP na porta B e mistura de rotenona/antimicina A na porta C para injeções. Preencha as portas não utilizadas com 20 microlitros de meio de ensaio. Equilibre o sistema de ensaio a 37 graus Celsius pelo menos cinco horas antes do ensaio abrindo o software Wave e clicando na guia Heater On.Depois de atingir a temperatura, o canto inferior esquerdo do software Wave mostra-se pronto. Abra um modelo para o kit de ensaio de estresse mitocondrial no software. Selecione estratégias de injeção no lado esquerdo, clique em Adicionar e nomeie a condição de injeção como neutrófilos humanos ou neutrófilos de camundongo ou HL60.Selecione a porta A a D clicando em cada uma delas, clique em Adicionar composto e digite oligomicina ou FCCP ou rotenona/antimicina A com as respectivas concentrações. Selecione Pré-tratamento no lado esquerdo, clique em Adicionar e nomeie-os CD18 e Cell Tak separadamente. Selecione o Tipo de célula no lado esquerdo.Em seguida, clique em Adicionar e nomeie-os como neutrófilos humanos, neutrófilos de camundongo e HL60 ou DHL60 com uma densidade de alimentação, conforme aplicável. Defina os grupos clicando em Adicionar grupo. Em seguida, clique na definição sublinhada.Clique em Mapa de Placas no menu superior para observar todos os grupos com definições no lado esquerdo e o mapa de placas à direita. Arraste e solte para adicionar cada poço ao grupo, mantendo os quatro poços de canto como plano de fundo. Para configurar o protocolo, selecione a guia Protocolo no menu superior e defina três ciclos de mistura de linha de base, oligomicina, FCCP, rotenona e antimicina A, definindo o tempo para misturar como três minutos, descanso como zero minutos e medição como sete minutos.Vá para a página Executar Ensaio, forneça as informações de resumo do projeto para referência e clique em Iniciar Execução. Forneça o local para salvar os arquivos para que todos os resultados sejam salvos após a conclusão do ensaio. Em seguida, clique em Iniciar execução novamente.Após o carregamento automático do ensaio, aguarde a abertura da bandeja para colocar o cartucho sensor e a placa com 200 microlitros de calibrador. Defina a direção do código de barras do cartucho voltada para a direita. Execute a calibração clicando em Estou Pronto, o que leva aproximadamente 20 minutos.Após a calibração, clique em Abrir Bandeja, substitua a placa pela placa semeada e clique em Estou Pronto para continuar o ensaio. Após a conclusão do ensaio, os dados são salvos automaticamente. Exporte os resultados para uma planilha ou outro arquivo de software de análise.Plote o gráfico e analise os dados. A dinâmica representativa da taxa de consumo de oxigênio ou OCR indicou alterações na respiração mitocondrial em neutrófilos humanos e de camundongos, bem como células HL60 indiferenciadas e diferenciadas em resposta à oligomicina, FCCP e à mistura de rotenona e antimicina A. Os valores de OCR diminuíram em todas as células após o tratamento com oligomicina devido à inibição do canal de prótons da ATP sintase. O tratamento com FCCP aumentou o fluxo de elétrons e o consumo de oxigênio para restaurar o valor de OCR e alcançar a respiração máxima.Uma mistura de rotenona e antimicina A bloqueou os complexos 1 e 3 da cadeia de transporte de elétrons, levando à eliminação da respiração mitocondrial. Diminuição da respiração mitocondrial foi observada em células HL60 após diferenciação dirigida por neutrófilos. Células HL60 diferenciadas apresentaram respiração mitocondrial basal significativamente menor, respiração ligada a vazamento de prótons, respiração ligada a ATP e respiração não mitocondrial.O aumento da respiração máxima das células HL60 diferenciadas não foi substancial, enquanto a capacidade respiratória sobressalente aumentou significativamente. Certifique-se de que as células estejam na parte inferior da placa, pois o cartucho do sensor não deve ter obstáculos devido às células flutuantes durante a leitura do valor de OCR. Essa técnica ajudaria os pesquisadores a estudar o efeito de drogas ou disfunção mitocondrial em estudos associados a neutrófilos.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A TIRF Microscopy Technique for Real-time, Simultaneous Imaging of the TCR and its Associated Signaling Proteins

A técnica de microscopia TIRF para imagens em tempo real, simultâneo da TCR e seus associados proteínas sinalizadoras

Signaling is initiated through the T Cell Receptor (TCR) when it is engaged by antigenic peptide fragments bound by Major Histocompatibility Complex ...

Imunologia e Infecção

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

Em tempo real de imagens ao vivo de células T Sinalização de Formação de Complexos

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

Bioenergetics and the Oxidative Burst: Protocols for the Isolation and Evaluation of Human Leukocytes and Platelets

Bioenergética e os oxidativo estourou: Protocolos para o Isolamento e Avaliação de leucócitos humanos e plaquetas

Mitochondrial dysfunction is known to play a significant role in a number of pathological conditions such as atherosclerosis, diabetes, septic shock, and ...

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

High Throughput medição de Extracelular DNA lançamento e Formação NET quantitativa em neutrófilos humanos<em&gt; In Vitro</em

Neutrophil granulocytes are the most abundant leukocytes in the human blood. Neutrophils are the first to arrive at the site of infection. Neutrophils ...

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

Imagiologia neutrófilos e monócitos em Mesenteric Veins por Microscopia intravital em ratos anestesiados em Tempo Real

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

Measuring Dengue Virus RNA in the Culture Supernatant of Infected Cells by Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction

Dengue vírus RNA no sobrenadante de cultura de células infectadas por reação em cadeia da polimerase em tempo real de quantitativos de medição

At present, real-time polymerase chain reaction (PCR) technology is an indispensable tool for the detection and quantification of viral genomes in ...

Robust Ligature-Induced Model of Murine Periodontitis for the Evaluation of Oral Neutrophils

Modelo robusto induzido por ligadura de periodontite de murine para a avaliação de neutrófilos orais

The main advantages of studying the pathophysiology of periodontal disease utilizing murine models are the reduced cost of animals, array of genetically ...

Pan-lyssavirus Real Time RT-PCR for Rabies Diagnosis

Tempo real RT-PCR do Pan-lyssavirus para o diagnóstico da raiva

Molecular assays are rapid, sensitive and specific, and have become central to diagnosing rabies. PCR based assays have been utilized for decades to ...

Monitoring Influenza Virus Survival Outside the Host Using Real-Time Cell Analysis

Monitorando a sobrevivência do vírus da influenza fora do hospedeiro usando análise celular em tempo real

Methods for virus particle quantification represent a critical aspect of many virology studies. Although several reliable techniques exist, they are ...

Real-Time Quantification of Reactive Oxygen Species in Neutrophils Infected with Meningitic Escherichia Coli

Real-Time Quantification of Reactive Oxygen Species in Neutrophils Infected with Meningitic Escherichia Coli

Quantificação em tempo real de espécies de oxigênio reativo em neutrófilos infectados com meningite escherichia coli

Escherichia coli (E. coli) is the most common Gram-negative bacteria causing neonatal meningitis. The occurrence of bacteremia and bacterial penetration ...