Name: real-time measurement of the mitochondrial bioenergetic profile of neutrophils
Uploaded: 2023-06-02T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real-Time Measurement of the Mitochondrial Bioenergetic Profile of Neutrophils at JoVE.com

Мы выражаем благодарность доктору Энтони Т. Велле и доктору Федерике Альяноин из отделения иммунологии UConn Health за их обучение использованию анализатора метаболического внеклеточного потока, а также доктору Линн Паддингтон из отделения иммунологии UConn Health за ее поддержку инструментов. Мы выражаем благодарность доктору Женеве Харгис из Медицинской школы Университета Коннектикута за ее помощь в написании и редактировании этой рукописи. Это исследование было поддержано грантами Национального института здравоохранения, Национального института сердца, легких и крови (R01HL145454), Национального института общих медицинских наук (R35GM147713 и P20GM139763), стартап-фонда UConn Health и стипендии Американской ассоциации иммунологов.

Гепаринизированные образцы цельной крови были получены от здоровых доноров после получения информированного согласия, одобренного Институциональным наблюдательным советом UConn Health в соответствии с Хельсинкской декларацией. Все эксперименты на животных проводились в соответствии с ?...

Стандартная процедура, которая измеряет митохондриальное дыхание нейтрофилов с помощью метаболического анализатора внеклеточного потока, ограничена многими факторами, включая количество клеток, рост клеток и жизнеспособность. Концентрация каждого соединения варьируется в зависим?...

Митохондрии играют важную роль в биоэнергетике клеток, которая генерирует аденозинтрифосфат (АТФ) путем окислительного фосфорилирования (OXPHOS). В дополнение к этому, роль митохондрий распространяется на генерацию и детоксикацию активных форм кислорода, цитоплазматическую и митохондриальную матриксную регуляцию кальция, клеточный синтез, катаболизм и транспорт метаболитов внутри клетки1. Митохондриальное дыхание необходимо для всех клеток, так как их дисфункция может привести к метаболическим проблемам 2, включая сердечно-сосудистые заболевания3 и широкий спектр нейродегенеративных заболеваний, таких как возрастная макулярная дегенерация4, болезни Паркинсона и Альцгеймера5 и болезнь Шарко-Мари-Тута2 A (CMT2A)6.
Электронно-микроскопические исследования нейтрофилов показали, что митохондрий7 относительно немного, и они в значительной степени зависят от гликолиза для производства энергии, поскольку скорость митохондриального дыхания очень низкая8. Однако митохондрии имеют решающее значение для функций нейтрофилов, таких как хемотаксис9 и апоптоз10,11,12. Предыдущее исследование выявило сложную митохондриальную сеть в нейтрофилах человека с высоким мембранным потенциалом. Потеря потенциала митохондриальной мембраны является ранним индикатором апоптоза нейтрофилов10. Лечение митохондриальным разъединителем карбонильного цианида м-хлорфенилгидразоном (CCCP) показало значительное ингибирование хемотаксиса, а также изменение морфологии митохондрий 9,10.
Хотя основным источником энергии для нейтрофилов является гликолиз, митохондрии обеспечивают АТФ, которая инициирует активацию нейтрофилов, подпитывая первую фазу пуринергической передачи сигналов, которая усиливает передачу сигналов Ca2+, усиливает продукцию митохондриальной АТФ и инициирует функциональные реакции нейтрофилов13. Дисфункция митохондриальной дыхательной цепи приводит к избыточной продукции токсичных активных форм кислорода (АФК) и приводит к патогенным повреждениям14,15,16. Нетоз, который представляет собой процесс образования нейтрофильных внеклеточных ловушек (НЭО), является важнейшим свойством нейтрофилов, которое помогает им бороться с патогенами17 и способствует развитию многих патологических состояний, включая рак, тромбоз и аутоиммунные расстройства18. АФК митохондриального происхождения способствуют NETosis19, митохондриальная ДНК может быть компонентом NETs18, а измененный митохондриальный гомеостаз ухудшает NETosis 20,21,22,23,24. Кроме того, во время нормальной дифференцировки или созревания метаболическое перепрограммирование нейтрофилов обращается вспять, ограничивая гликолитическую активность, и они участвуют в митохондриальном дыхании и мобилизуют внутриклеточные липиды25,26.
Анализатор метаболического внеклеточного потока может непрерывно контролировать и количественно определять митохондриальное дыхание и гликолиз живых клеток. В анализаторе используется 96-луночный картридж пластинчатого формата и два флуорофора для количественного определения концентрации кислорода (O2) и изменений pH. Сенсорный картридж находится над монослоем ячейки во время анализа и образует микрокамеру высотой ~200 нм. Пучки оптических волокон в анализаторе используются для возбуждения флуорофоров и обнаружения изменений интенсивности флуоресценции. Изменения концентрации O2 и рН в режиме реального времени автоматически рассчитываются и отображаются как скорость потребления кислорода (OCR) и скорость внеклеточного подкисления (ECAR). На картридже датчика имеется четыре порта, которые позволяют загружать до четырех соединений в каждую скважину во время измерений. Этот протокол фокусируется на количественной оценке митохондриального дыхания нейтрофилов мыши и человека, а также нейтрофилоподобных клеток HL60 с использованием анализатора метаболического внеклеточного потока.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>37 &#176;C non-CO2&#160;incubator</td>
			<td>Precision</td>
			<td>Economy Model 2EG</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biorender</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Software Application</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Model 5810R</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#160;Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive</td>
			<td>Corning</td>
			<td>102416-100</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep Magnet</td>
			<td>STEMCELL</td>
			<td>18000</td>
			<td>Magnet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySepMouse Neutrophil Enrichment kit</td>
			<td>STEMCELL</td>
			<td>19762A</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad Prism 9</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Software Application</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Serum Albumin Solution (25%)</td>
			<td>GeminiBio</td>
			<td>800-120</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine (VetaKet)</td>
			<td>DAILYMED</td>
			<td>NDC 59399-114-10</td>
			<td>Anesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>SH30256.01</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate buckets</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>UL155</td>
			<td>Accessory</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PolymorphPrep</td>
			<td>PROGEN</td>
			<td>1895 (previous 1114683)</td>
			<td>polysaccharide solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified mouse anti-human CD18 antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>302102</td>
			<td>Clone TS1/18</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11-875-093</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse metabolic extracellular flux analyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>XFe96</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF Cell Mito Stress Test Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>103015-100</td>
			<td>mitochondrial stress test Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swing-bucket rotor</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>A-4-62</td>
			<td>Rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vactrap 2 Vacum Trap</td>
			<td>Fox Lifesciences</td>
			<td>3052101-FLS</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wave</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Software Application</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF 1.0 M Glucose Solution</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>103577-100</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF 100 mM Pyruvate Solution</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>103578-100</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF 200 mM Glutamine Solution</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>103579-100</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF DMEM medium</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>103575-100</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XFe96 FluxPak</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>102601-100</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine (AnaSed Injection)</td>
			<td>DAILYMED</td>
			<td>NDC 59399-110-20</td>
			<td>Anesthetic</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time measurement of the mitochondrial bioenergetic profile of neutrophils

Нейтрофилы являются первой линией защиты и наиболее распространенными лейкоцитами у человека. Эти эффекторные клетки выполняют такие функции, как фагоцитоз и окислительный взрыв, и создают нейтрофильные внеклеточные ловушки (НЭО) для микробного клиренса. Новое понимание метаболической активности нейтрофилов бросает вызов ранней концепции о том, что они в первую очередь полагаются на гликолиз. Точное измерение метаболической активности может выявить различные метаболические потребности нейтрофилов, включая цикл трикарбоновой кислоты (ТСА) (также известный как цикл Кребса), окислительное фосфорилирование (OXPHOS), пентозофосфатный путь (PPP) и окисление жирных кислот (FAO) в физиологических условиях и в болезненных состояниях. В этой статье описывается пошаговый протокол и предварительные требования для измерения скорости потребления кислорода (OCR) в качестве индикатора митохондриального дыхания на нейтрофилах, полученных из костного мозга мыши, нейтрофилах, полученных из крови человека, и нейтрофильной клеточной линии HL60 с использованием анализа метаболического потока на анализаторе метаболического внеклеточного потока. Этот метод может быть использован для количественной оценки митохондриальных функций нейтрофилов в норме и при заболеваниях.

Показана репрезентативная динамика OCR, указывающая на изменения митохондриального дыхания в ответ на олигомицин, FCCP и смесь ротенона/антимицина А нейтрофилов мыши (рис. 3A), нейтрофилов человека (рис. 3B) и недифференцированных и дифференцированных клеток ...

Watch this Scientific Journal Video about Real-Time Measurement of the Mitochondrial Bioenergetic Profile of Neutrophils at JoVE.com

Real-Time Measurement of the Mitochondrial Bioenergetic Profile of Neutrophils

Описаны ступенчатые протоколы измерения митохондриального дыхания нейтрофилов мыши и человека и клеток HL60 с использованием анализатора метаболического внеклеточного потока.

Измерение митохондриального биоэнергетического профиля нейтрофилов в режиме реального времени

Neutrophils are the first line of defense and the most abundant leukocytes in humans. These effector cells perform functions such as phagocytosis and ...

Этот протокол фокусируется на количественной оценке митохондриального дыхания нейтрофилов мыши и человека, а также нейтрофилоподобных клеток HL60 с использованием анализатора метаболического внеклеточного потока. Этот метод позволяет количественно оценить функцию митохондрий в нейтрофилах в норме и при заболевании. Это простой метод, который может дать представление о митохондриальной функции клеток в ответ на лекарства или любое заболевание.Поскольку разные клетки имеют разную эффективность дыхания митохондрий, для получения высококачественных результатов необходимо точно оптимизировать плотность посева клеток и концентрацию реагентов. Чтобы начать анализ метаболического внеклеточного потока, возьмите картридж датчика, упакованный в специально разработанную 96-луночную пластину, и перенесите 200 микролитров калибровочной среды в каждую лунку нижележащей пластины. Осторожно поднимите картридж и пластину с калибром и поместите их в инкубатор, увлажненный до 37 градусов по Цельсию без углекислого газа, на ночь для увлажнения.Затем, в зависимости от типа ячейки, покройте 96-луночную пластину специальным покрытием, чтобы обеспечить адгезию ячейки. После этого дважды вымойте тарелки 200 микролитрами стерильного PBS. Приготовьте тестовую среду в DMEM с одним миллимолярным пируватом, 10 миллимолярной глюкозой и двумя миллимолярными глутаминами.Закупите нейтрофильные клетки мыши и человека, как описано в текстовой рукописи. Для нейтрофилов, полученных от мыши, отрегулируйте плотность клеток в 1,1 раза от 10 до шестой клетки на миллилитр, добавив анализную среду. Затем засейте 180 микролитров суспензии нейтрофилов мыши в каждую лунку в подготовленную 96-луночную пластину.Точно так же отрегулируйте плотность нейтрофильных клеток человека в 2,2 раза от 10 до шестой клетки на миллилитр, используя тестовую среду. В день анализа подсчитайте нейтрофилоподобные клетки HL60 вручную с помощью гемоцитометра. Затем центрифугируют дифференцированные или недифференцированные клетки HL60 при 300G при комнатной температуре в течение пяти минут.Промойте клетки DMEM один раз и повторно суспендируйте их в анализной среде для достижения плотности клеток от 1,39 до 10 до шестой клетки на миллилитр. Затем засевают 180 микролитров дифференцированных или недифференцированных клеток HL60 в предварительно подготовленную 96-луночную пластину, содержащую образцы нейтрофилов мыши и человека. Наконец, добавьте полную среду в угловые лунки пластины для клеточных культур, лишенные клеток, для коррекции фона во время посева.Центрифугируйте пластину при 300 г при комнатной температуре в течение трех минут без перерыва, чтобы обеспечить надлежащее прилегание ячеек к нижней части пластины. Наконец, инкубируйте планшет в течение одного часа, чтобы предварительно уравновесить клетки с анализирующей средой. Откройте набор для митохондриального стресс-теста и подготовьте реагенты в соответствии с инструкциями производителя.Затем загрузите картридж с реагентами, начиная с приготовленного олигомицина в порт А, FCCP в порт B и смеси ротенона/антимицина А в порт C для инъекций. Заполните неиспользуемые порты 20 микролитрами анализирующей среды. Уравновесьте систему анализа при 37 градусах Цельсия не менее чем за пять часов до анализа, открыв программное обеспечение Wave и щелкнув вкладку «Нагреватель вкл.».После достижения температуры в левом нижнем углу программного обеспечения Wave отображается готовность. Откройте шаблон для набора для анализа митохондриального стресса в программном обеспечении. Выберите стратегии инъекций слева, затем нажмите «Добавить» и назовите условие инъекции нейтрофилами человека, нейтрофилами мыши или HL60.Выберите порты от A до D, щелкнув по каждому, и нажмите «Добавить соединение» и введите олигомицин или FCCP или ротенон/антимицин A с соответствующими концентрациями. Выберите «Предварительная обработка» слева, затем нажмите «Добавить» и назовите их CD18 и Cell Tak отдельно. Выберите тип ячейки с левой стороны.Затем нажмите «Добавить» и назовите их нейтрофилами человека, нейтрофилами мыши и HL60 или DHL60 с плотностью кормления, если применимо. Определите группы, нажав «Добавить группу». Затем нажмите на подчеркнутое определение.Нажмите «Карта плит» в верхнем меню, чтобы увидеть все группы с определениями слева и карту плит справа. Перетащите указатель, чтобы добавить каждую лунку в группу, сохранив при этом четыре угловых колодца в качестве фона. Чтобы настроить протокол, выберите вкладку «Протокол» в верхнем меню и определите три цикла базовой смеси, олигомицина, FCCP, ротенона и антимицина А, установив время смешивания как три минуты, отдых как ноль минут и измерение как семь минут.Перейдите на страницу "Выполнить анализ", введите сводные сведения о проекте для справки и нажмите кнопку "Начать выполнение". Укажите место для сохранения файлов, чтобы все результаты были сохранены после завершения анализа. Затем снова нажмите «Запустить запуск».После автоматической загрузки анализа подождите, пока лоток откроется, чтобы поместить картридж датчика и пластину с калибром 200 микролитров. Установите направление штрих-кода картриджа вправо. Запустите калибровку, нажав кнопку «Я готов», которая займет примерно 20 минут.После калибровки нажмите «Открыть лоток», замените пластину пластиной с засеянной ячейкой и нажмите «Я готов», чтобы продолжить анализ. После завершения анализа данные автоматически сохраняются. Экспортируйте результаты в электронную таблицу или другой файл программного обеспечения для анализа.Постройте график и проанализируйте данные. Репрезентативная динамика скорости потребления кислорода или OCR указывала на изменения митохондриального дыхания у нейтрофилов мыши и человека, а также недифференцированных и дифференцированных клеток HL60 в ответ на олигомицин, FCCP и смесь ротенона и антимицина А. Значения OCR снизились во всех клетках после лечения олигомицином из-за ингибирования протонного канала АТФ-синтазы. Лечение FCCP увеличило поток электронов и потребление кислорода для восстановления значения OCR и достижения максимального дыхания.Смесь ротенона и антимицина А блокировала комплексы 1 и 3 цепи переноса электронов, приводя к элиминации митохондриального дыхания. Снижение митохондриального дыхания наблюдалось в клетках HL60 после нейтрофил-направленной дифференцировки. Было обнаружено, что дифференцированные клетки HL60 имеют значительно более низкое базальное митохондриальное дыхание, дыхание, связанное с утечкой протона, дыхание, связанное с АТФ, и немитохондриальное дыхание.Увеличение максимального дыхания дифференцированных клеток HL60 было незначительным, в то время как резервная дыхательная способность была достоверно увеличена. Убедитесь, что ячейки находятся в нижней части пластины, так как картридж датчика не должен иметь никаких препятствий из-за плавающих ячеек при считывании значения OCR. Этот метод поможет исследователям изучить влияние лекарств или митохондриальной дисфункции в исследованиях, связанных с нейтрофилами.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A TIRF Microscopy Technique for Real-time, Simultaneous Imaging of the TCR and its Associated Signaling Proteins

Техника для TIRF микроскопии в реальном времени, одновременная съемка TCR и его ассоциированных сигнальных белков

Signaling is initiated through the T Cell Receptor (TCR) when it is engaged by antigenic peptide fragments bound by Major Histocompatibility Complex ...

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

В режиме реального времени Живая съемка Т-клеточного сигнального комплекса Формирование

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

Bioenergetics and the Oxidative Burst: Protocols for the Isolation and Evaluation of Human Leukocytes and Platelets

Биоэнергетика и окислительного: протоколах выделения и оценки человека лейкоцитов и тромбоцитов

Mitochondrial dysfunction is known to play a significant role in a number of pathological conditions such as atherosclerosis, diabetes, septic shock, and ...

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

Высокая пропускная способность измерения внеклеточной ДНК-релиз и количественный NET Формирование в нейтрофилах человека<em&gt; In Vitro</em

Neutrophil granulocytes are the most abundant leukocytes in the human blood. Neutrophils are the first to arrive at the site of infection. Neutrophils ...

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

Воображение нейтрофилов и моноцитов в брыжеечных вен Прижизненное микроскопии на наркотизированных мышей в реальном времени

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

Measuring Dengue Virus RNA in the Culture Supernatant of Infected Cells by Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction

Измерения вирус денге РНК в надосадке культуры зараженных клеток в реальном времени количественные полимеразной цепной реакции

At present, real-time polymerase chain reaction (PCR) technology is an indispensable tool for the detection and quantification of viral genomes in ...

Robust Ligature-Induced Model of Murine Periodontitis for the Evaluation of Oral Neutrophils

Надежная Лигатура индуцированной модели Мурин пародонтит для оценки устных нейтрофилов

The main advantages of studying the pathophysiology of periodontal disease utilizing murine models are the reduced cost of animals, array of genetically ...

Pan-lyssavirus Real Time RT-PCR for Rabies Diagnosis

Пан-лиссавирус в режиме реального времени RT-PCR для диагностики бешенства

Molecular assays are rapid, sensitive and specific, and have become central to diagnosing rabies. PCR based assays have been utilized for decades to ...

Monitoring Influenza Virus Survival Outside the Host Using Real-Time Cell Analysis

Мониторинг выживаемости вируса гриппа вне хозяина с помощью анализа клеток в режиме реального времени

Methods for virus particle quantification represent a critical aspect of many virology studies. Although several reliable techniques exist, they are ...

Real-Time Quantification of Reactive Oxygen Species in Neutrophils Infected with Meningitic Escherichia Coli

Real-Time Quantification of Reactive Oxygen Species in Neutrophils Infected with Meningitic Escherichia Coli

Количественная оценка видов реактивного кислорода в нейтрофилах, инфицированных менингитом Escherichia Coli в реальном времени

Escherichia coli (E. coli) is the most common Gram-negative bacteria causing neonatal meningitis. The occurrence of bacteremia and bacterial penetration ...