Name: real-time measurement of the mitochondrial bioenergetic profile of neutrophils
Uploaded: 2023-06-02T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real-Time Measurement of the Mitochondrial Bioenergetic Profile of Neutrophils at JoVE.com

Vi erkänner Dr. Anthony T. Vella och Dr. Federica Aglianoin från Institutionen för immunologi vid UConn Health för deras utbildning i att använda den metaboliska extracellulära flödesanalysatorn och Dr. Lynn Puddington vid Institutionen för immunologi vid UConn Health för hennes stöd för instrumenten. Vi erkänner Dr. Geneva Hargis från UConn School of Medicine för hennes hjälp med vetenskapligt skrivande och redigering av detta manuskript. Denna forskning stöddes av bidrag från National Institutes of Health, National Heart, Lung and Blood Institute (R01HL145454), National Institute of General Medical Sciences (R35GM147713 och P20GM139763), en startfond från UConn Health och ett karriäråterinträdesstipendium från American Association of Immunologists.

Hepariniserade helblodprover erhölls från friska mänskliga givare efter att ha erhållit informerat samtycke, vilket godkänts av Institutional Review Board of UConn Health i enlighet med Helsingforsdeklarationen. Alla djurförsök följde UConn Health Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) riktlinjer, och godkännande för användning av gnagare erhölls från UConn Health IACUC enligt kriterier som beskrivs i Guide for the Care and Use of Laboratory Animals från National Institutes of Health. Möss av ...

Standardproceduren som mäter mitokondriell andning av neutrofiler med hjälp av den metaboliska extracellulära flödesanalysatorn begränsas av många faktorer, inklusive cellantal, celltillväxt och livskraft. Varje föreningskoncentration varierar beroende på typ och källa till celler i denna analys. Oligomycin och rotenon / antimycin A används mest i en liknande koncentration bland de flesta celltyper. Eftersom den FCCP-inducerade maximala andningsfrekvensen varierar mellan olika celler krävs dock noggrann titr...

Mitokondrier spelar en viktig roll i cellbioenergetik, som genererar adenosintrifosfat (ATP) genom oxidativ fosforylering (OXPHOS). Utöver detta sträcker sig mitokondriernas roll in i generering och avgiftning av reaktiva syrearter, cytoplasmatisk och mitokondriell matriskalciumreglering, cellulär syntes, katabolism och transport av metaboliter inom cellen1. Mitokondriell andning är avgörande i alla celler, eftersom deras dysfunktion kan leda till metaboliska problem 2, inklusive hjärt-kärlsjukdomar3 och en mängd olika neurodegenerativa sjukdomar, såsom åldersrelaterad makuladegeneration4, Parkinsons och Alzheimers sjukdomar5 och Charcot-Marie-Tooths sjukdom2 A (CMT2A)6.
Elektronmikroskopiska studier på neutrofiler avslöjade att det finns relativt få mitokondrier7, och de är starkt beroende av glykolys för sin energiproduktion eftersom mitokondriell andning är mycket låg8. Mitokondrier är dock avgörande för neutrofila funktioner, såsom kemotaxis9 och apoptos10,11,12. En tidigare studie avslöjade ett komplext mitokondriellt nätverk hos humana neutrofiler med hög membranpotential. Den mitokondriella membranpotentialförlusten är en tidig indikator på neutrofil apoptos10. Behandling med mitokondriell uncoupler karbonylcyanid m-klorfenylhydrazon (CCCP) visade signifikant hämning i kemotaxi, tillsammans med en förändring i mitokondriell morfologi 9,10.
Även om den primära energikällan för neutrofiler är glykolys, tillhandahåller mitokondrier ATP som initierar neutrofilaktivering genom att driva den första fasen av purinergisk signalering, vilket ökar Ca2+ signalering, förstärker mitokondriell ATP-produktion och initierar neutrofila funktionella svar13. Dysfunktion i den mitokondriella andningskedjan resulterar i överdriven produktion av giftiga reaktiva syreradikaler (ROS) och leder till patogena skador14,15,16. NETosis, som är processen att bilda neutrofila extracellulära fällor (NET), är en kritisk egenskap hos neutrofiler som hjälper dem att bekämpa patogener17 och bidrar till många patologiska tillstånd, inklusive cancer, trombos och autoimmuna störningar18. Mitokondriellt härledd ROS bidrar till NETosis19, mitokondriellt DNA kan vara en komponent i NET18 och förändrad mitokondriell homeostas försämrar NETosis 20,21,22,23,24. Dessutom, under normal differentiering eller mognad, vänds neutrofil metabolisk omprogrammering genom att begränsa glykolytisk aktivitet, och de engagerar sig i mitokondriell andning och mobiliserar intracellulära lipider25,26.
Den metaboliska extracellulära flödesanalysatorn kan kontinuerligt övervaka och kvantifiera levande cellmitokondriell andning och glykolys. Analysatorn använder en sensorpatron med 96 brunnar och två fluoroforer för att kvantifiera syrekoncentration (O2) och pH-förändringar. Sensorpatronen ligger ovanför cellmonoskiktet under analysen och bildar en ~ 200 nm hög mikrokammare. De optiska fiberbuntarna i analysatorn används för att excitera fluoroforerna och detektera de fluorescerande intensitetsförändringarna. Realtidsförändringar i O2-koncentration och pH beräknas automatiskt och visas som syreförbrukningshastighet (OCR) och extracellulär försurningshastighet (ECAR). Det finns fyra portar på sensorpatronen som gör det möjligt att ladda upp till fyra föreningar i varje brunn under analysmätningarna. Detta protokoll fokuserar på att kvantifiera mitokondriell andning hos mus och humana neutrofiler, såväl som neutrofilliknande HL60-celler, med hjälp av den metaboliska extracellulära flödesanalysatorn.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>37 &#176;C non-CO2&#160;incubator</td>
			<td>Precision</td>
			<td>Economy Model 2EG</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biorender</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Software Application</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Model 5810R</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#160;Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive</td>
			<td>Corning</td>
			<td>102416-100</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep Magnet</td>
			<td>STEMCELL</td>
			<td>18000</td>
			<td>Magnet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySepMouse Neutrophil Enrichment kit</td>
			<td>STEMCELL</td>
			<td>19762A</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad Prism 9</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Software Application</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Serum Albumin Solution (25%)</td>
			<td>GeminiBio</td>
			<td>800-120</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine (VetaKet)</td>
			<td>DAILYMED</td>
			<td>NDC 59399-114-10</td>
			<td>Anesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>SH30256.01</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate buckets</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>UL155</td>
			<td>Accessory</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PolymorphPrep</td>
			<td>PROGEN</td>
			<td>1895 (previous 1114683)</td>
			<td>polysaccharide solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified mouse anti-human CD18 antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>302102</td>
			<td>Clone TS1/18</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11-875-093</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse metabolic extracellular flux analyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>XFe96</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF Cell Mito Stress Test Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>103015-100</td>
			<td>mitochondrial stress test Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swing-bucket rotor</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>A-4-62</td>
			<td>Rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vactrap 2 Vacum Trap</td>
			<td>Fox Lifesciences</td>
			<td>3052101-FLS</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wave</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Software Application</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF 1.0 M Glucose Solution</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>103577-100</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF 100 mM Pyruvate Solution</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>103578-100</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF 200 mM Glutamine Solution</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>103579-100</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF DMEM medium</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>103575-100</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XFe96 FluxPak</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>102601-100</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine (AnaSed Injection)</td>
			<td>DAILYMED</td>
			<td>NDC 59399-110-20</td>
			<td>Anesthetic</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time measurement of the mitochondrial bioenergetic profile of neutrophils

Neutrofiler är den första försvarslinjen och de vanligaste leukocyterna hos människor. Dessa effektorceller utför funktioner som fagocytos och oxidativ burst och skapar neutrofila extracellulära fällor (NET) för mikrobiell clearance. Nya insikter i neutrofilernas metaboliska aktiviteter utmanar det tidiga konceptet att de främst förlitar sig på glykolys. Exakt mätning av metaboliska aktiviteter kan utveckla olika metaboliska behov av neutrofiler, inklusive trikarboxylsyra (TCA) -cykeln (även känd som Krebs-cykeln), oxidativ fosforylering (OXPHOS), pentosfosfatväg (PPP) och fettsyraoxidation (FAO) under fysiologiska förhållanden och i sjukdomstillstånd. Detta dokument beskriver ett steg-för-steg-protokoll och förutsättningar för att mäta syreförbrukningshastighet (OCR) som en indikator på mitokondriell andning på benmärgshärledda neutrofiler från mus, humana blod-härledda neutrofiler och den neutrofilliknande HL60-cellinjen, med hjälp av metabolisk flödesanalys på en metabolisk extracellulär flödesanalysator. Denna metod kan användas för att kvantifiera mitokondriella funktioner hos neutrofiler under normala och sjukdomsförhållanden.

Representativ OCR-dynamik visas som indikerar mitokondriell andning förändringar som svar på oligomycin, FCCP och rotenon / antimycin En blandning av musneutrofiler (figur 3A), humana neutrofiler (figur 3B) och odifferentierade och differentierade HL60-celler (figur 3C). I alla celler minskar oligomycinbehandling OCR-värdet genom att hämma protonkanalen för ATP-syntas; FCCP-behandling återställer OCR-värdet genom att öka f...

Watch this Scientific Journal Video about Real-Time Measurement of the Mitochondrial Bioenergetic Profile of Neutrophils at JoVE.com

Real-Time Measurement of the Mitochondrial Bioenergetic Profile of Neutrophils

Vi beskriver stegvisa protokoll som mäter mitokondriell andning hos mus- och humana neutrofiler och HL60-celler med hjälp av metabolisk extracellulär flödesanalysator.

Realtidsmätning av den mitokondriella bioenergetiska profilen för neutrofiler

Neutrophils are the first line of defense and the most abundant leukocytes in humans. These effector cells perform functions such as phagocytosis and ...

Detta protokoll fokuserar på att kvantifiera mitokondriell andning hos mus och humana neutrofiler, såväl som neutrofilliknande HL60-celler med hjälp av den metaboliska extracellulära flödesanalysatorn. Denna metod gör det möjligt för oss att kvantifiera mitokondriell funktion hos neutrofiler under normala och sjukdomsförhållanden. Detta är en enkel teknik som kan ge insikter i cellernas mitokondriella funktion som svar på läkemedel eller något sjukdomstillstånd.Eftersom olika celler har olika mitokondriell andningseffektivitet måste optimering av cellsådddensitet och reagenskoncentration utföras exakt för att få högkvalitativa resultat. För att påbörja den metaboliska extracellulära flödesanalysen, ta en sensorpatron packad över en specialdesignad 96-brunnsplatta och överför 200 mikroliter kalibreringsmedium till varje brunn på den underliggande plattan. Lyft försiktigt patronen och plattan med calibrant och placera den i en icke-koldioxidfuktad 37 grader Celsius inkubator över natten för hydrering.Därefter, baserat på celltypen, belägg 96-brunnsplattan med en specifik beläggning för att säkerställa celladhesion. Tvätta sedan plattorna med 200 mikroliter steril PBS två gånger. Bered analysmediet i DMEM med ett millimolärt pyruvat, 10 millimolar glukos och två millimolar glutamin.Skaffa mus- och humana neutrofilceller enligt beskrivningen i textmanuskriptet. För neutrofilerna som erhålls från musen, justera celldensiteten till 1,1 gånger 10 till de sjätte cellerna per milliliter genom att tillsätta analysmedium. Så sedan 180 mikroliter av musneutrofilsuspensionen per brunn i den beredda 96-brunnsplattan.På samma sätt justera den humana neutrofila celldensiteten till 2,2 gånger 10 till de sjätte cellerna per milliliter med hjälp av analysmediet. På analysdagen räknar du de neutrofilliknande HL60-cellerna manuellt med hemocytometern. Centrifugera sedan de differentierade eller odifferentierade HL60-cellerna vid 300 G vid rumstemperatur i fem minuter.Tvätta cellerna med DMEM en gång och suspendera dem igen i analysmediet för att uppnå en celldensitet på 1,39 gånger 10 till de sjätte cellerna per milliliter. Därefter frö 180 mikroliter differentierade eller odifferentierade HL60-celler i den förberedda 96-brunnsplattan som innehåller mus- och humana neutrofilprover. Slutligen tillsätt komplett medium till hörnbrunnarna på cellodlingsplattan utan celler för bakgrundskorrigering under sådd.Centrifugera plattan vid 300 G vid rumstemperatur i tre minuter utan paus för att säkerställa korrekt vidhäftning av cellerna på plattans botten. Slutligen inkubera plattan i en timme för att förbalansera cellerna med analysmediet. Öppna mitokondriell stresstestkit och förbered reagenserna enligt tillverkarens instruktioner.Fyll sedan cylinderampullen med reagens, börja med det beredda oligomycinet i port A, FCCP i port B och rotenon/antimycin A-blandningen i port C för injektionsvätskor. Fyll de oanvända portarna med 20 mikroliter analysmedium. Balansera analyssystemet vid 37 grader Celsius minst fem timmar före analysen genom att öppna Wave-programvaran och klicka på fliken Värmare på.Efter att ha nått temperaturen visas det nedre vänstra hörnet av Wave-programvaran redo. Öppna en mall för mitokondriell stressanalyssats i programvaran. Välj injektionsstrategier på vänster sida, klicka sedan på Lägg till och namnge injektionstillståndet som humana neutrofiler eller musneutrofiler eller HL60.Välj port A till D genom att klicka på var och en och klicka på Lägg till förening och ange oligomycin eller FCCP eller rotenon / antimycin A med respektive koncentrationer. Välj Förbehandling på vänster sida, klicka sedan på Lägg till och namnge dem CD18 och Cell Tak separat. Välj celltyp på vänster sida.Klicka sedan på Lägg till och namnge dem mänskliga neutrofiler, musneutrofiler och HL60 eller DHL60 med en matningstäthet beroende på vad som är tillämpligt. Definiera grupperna genom att klicka på Lägg till grupp. Klicka sedan på den understrukna definitionen.Klicka på Plåtkarta i toppmenyn för att observera alla grupper med definitioner till vänster och plattkartan till höger. Dra och släpp för att lägga till varje brunn i gruppen samtidigt som de fyra hörnbrunnarna behålls som bakgrund. För att ställa in protokollet, välj fliken Protokoll i toppmenyn och definiera tre cykler av baslinje, oligomycin, FCCP, rotenon och antimycin A-blandning, genom att ställa in tiden för att blanda som tre minuter, vila som noll minuter och mätning som sju minuter.Gå till sidan Kör analys, ange projektsammanfattningsinformationen som referens och klicka på Starta körning. Ange platsen för att spara filerna så att alla resultat sparas efter avslutad analys. Klicka sedan på Starta körning igen.Efter automatisk laddning av analysen, vänta tills brickan öppnas för att placera sensorpatronen och plattan med 200 mikroliter kalibrerande. Ställ patronens streckkodsriktning vänd åt höger. Kör kalibreringen genom att klicka på Jag är redo, vilket tar cirka 20 minuter.Efter kalibreringen klickar du på Öppna fack, ersätter plattan med den cellsådda plattan och klickar på Jag är redo att fortsätta analysen. När analysen har slutförts sparas data automatiskt. Exportera resultaten till ett kalkylblad eller en annan analysprogramfil.Rita diagrammet och analysera data. Den representativa dynamiken för syreförbrukningshastighet eller OCR indikerade förändringar i mitokondriell andning hos mus och humana neutrofiler, såväl som odifferentierade och differentierade HL60-celler som svar på oligomycin, FCCP och blandningen av rotenon och antimycin A.OCR-värdena minskade i alla celler efter oligomycinbehandling på grund av hämning av protonkanalen för ATP-syntas. FCCP-behandling ökade flödet av elektroner och syreförbrukningen för att återställa OCR-värdet och uppnå maximal andning.En blandning av rotenon och antimycin A blockerade komplex 1 och 3 i elektrontransportkedjan, vilket ledde till eliminering av mitokondriell andning. Minskad mitokondriell andning observerades i HL60-celler efter neutrofilriktad differentiering. Differentierade HL60-celler visade sig ha signifikant lägre basal mitokondriell andning, protonläckagelänkad andning, ATP-länkad andning och icke-mitokondriell andning.Ökningen av maximal andning av differentierade HL60-celler var inte signifikant, medan den outnyttjade andningskapaciteten ökade signifikant. Se till att cellerna är längst ner på plattan, eftersom sensorpatronen inte ska ha några hinder på grund av de flytande cellerna när du läser OCR-värdet. Denna teknik skulle hjälpa forskare att studera effekten av läkemedel eller mitokondriell dysfunktion i neutrofilassocierade studier.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A TIRF Microscopy Technique for Real-time, Simultaneous Imaging of the TCR and its Associated Signaling Proteins

En TIRF Mikroskopi Teknik för Real-time, samtidig avbildning av TCR och dess associerade signalproteiner

Signaling is initiated through the T Cell Receptor (TCR) when it is engaged by antigenic peptide fragments bound by Major Histocompatibility Complex ...

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

Real-time Live avbildning av T-cellsignalering Complex Formation

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

Bioenergetics and the Oxidative Burst: Protocols for the Isolation and Evaluation of Human Leukocytes and Platelets

Bioenergetik och Oxidativ Burst: Protokoll för isolering och utvärdering av humana leukocyter och trombocyter

Mitochondrial dysfunction is known to play a significant role in a number of pathological conditions such as atherosclerosis, diabetes, septic shock, and ...

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

Hög genomströmning Mätning av extracellulärt DNA utsläpp och Kvantitativ NET bildning i humana neutrofiler<em&gt; In Vitro</em

Neutrophil granulocytes are the most abundant leukocytes in the human blood. Neutrophils are the first to arrive at the site of infection. Neutrophils ...

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

Imaging Neutrofiler och Monocyter i Mesenteric Veins av Intravital Mikroskopi på sövda möss i realtid

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

Measuring Dengue Virus RNA in the Culture Supernatant of Infected Cells by Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction

Mäta denguefeber Virus RNA i kultur supernatanten av infekterade celler av realtid kvantitativa Polymerase Chain Reaction

At present, real-time polymerase chain reaction (PCR) technology is an indispensable tool for the detection and quantification of viral genomes in ...

Robust Ligature-Induced Model of Murine Periodontitis for the Evaluation of Oral Neutrophils

Robust Ligature-inducerad modell av murina parodontit för utvärdering av orala neutrofiler

The main advantages of studying the pathophysiology of periodontal disease utilizing murine models are the reduced cost of animals, array of genetically ...

Pan-lyssavirus Real Time RT-PCR for Rabies Diagnosis

Pan-lyssavirus Real Time RT-PCR för rabies diagnos

Molecular assays are rapid, sensitive and specific, and have become central to diagnosing rabies. PCR based assays have been utilized for decades to ...

Monitoring Influenza Virus Survival Outside the Host Using Real-Time Cell Analysis

Övervakning av influensavirusöverlevnad utanför värden med hjälp av cellanalys i realtid

Methods for virus particle quantification represent a critical aspect of many virology studies. Although several reliable techniques exist, they are ...

Real-Time Quantification of Reactive Oxygen Species in Neutrophils Infected with Meningitic Escherichia Coli

Real-Time Quantification of Reactive Oxygen Species in Neutrophils Infected with Meningitic Escherichia Coli

Kvantifiering i realtid av reaktiva syrearter i neutrofiler infekterade med meningitisk escherichia coli

Escherichia coli (E. coli) is the most common Gram-negative bacteria causing neonatal meningitis. The occurrence of bacteremia and bacterial penetration ...