Name: efficient pam-less base editing for zebrafish modeling of human genetic disease with zspry-abe8e
Uploaded: 2023-02-17T13:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Efficient PAM-Less Base Editing for Zebrafish Modeling of Human Genetic Disease with zSpRY-ABE8e at JoVE.com

Wir danken Barbara Garbers, PhD, von Liwen Bianji (Edanz) für die Bearbeitung des englischen Textes eines Entwurfs dieses Manuskripts. Diese Arbeit wurde durch das Key-Area Research and Development Program der Provinz Guangdong (2019B030335001), das National Key R&D Program of China (2019YFE0106700), die National Natural Science Foundation of China (32070819, 31970782) und das Research Fund Program des Guangdong Provincial Key Lab of Pathogenic Biology and Epidemiology for Aquatic Economic Animals (PBEA2020YB05) unterstützt.

Diese Studie wurde unter strikter Einhaltung der Richtlinien des Care and Use Committee der South China Normal University durchgeführt.
1. Herstellung synthetisch modifizierter gRNA und zSpRY-ABE8e mRNA
<ol><li>Design der gRNA nach früheren Veröffentlichungen37,38.<ol><li>Wählen Sie vorzugsweise NRN als PAM-Sequenz aus, da zSpRY-ABE8e eine höhere Präferenz für NRN-PAM als NYN-PAM zeigt (wobei R A oder G und Y ...

<ol>
	<li>Eichler, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Completing+the+map+of+human+genetic+variation.">Completing the map of human genetic variation.</a> Nature. 447 (7141), 161-165 (2007).</li><li>Koukouli, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotine+reverses+hypofrontality+in+animal+models+of+addiction+and+schizophrenia.">Nicotine reverses hypofrontality in animal models of addiction and schizophrenia.</a> Nature Medicine. 23 (3), 347-354 (2017).</li><li>Kalueff, A. V., Stewart, A. 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P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+CRISPR-Cas9+nucleases+with+altered+PAM+specificities.">Engineered CRISPR-Cas9 nucleases with altered PAM specificities.</a> Nature. 523 (7561), 481-485 (2015).</li><li>Liu, K., Petree, C., Requena, T., Varshney, P., Varshney, G. 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P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unconstrained+genome+targeting+with+near-PAMless+engineered+CRISPR-Cas9+variants.">Unconstrained genome targeting with near-PAMless engineered CRISPR-Cas9 variants.</a> Science. 368 (6488), 290-296 (2020).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing+mediated+by+SpCas9+variants+with+broad+non-canonical+PAM+compatibility+in+plants.">Genome editing mediated by SpCas9 variants with broad non-canonical PAM compatibility in plants.</a> Molecular Plant. 14 (2), 352-360 (2021).</li><li>Vicencio, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing+in+animals+with+minimal+PAM+CRISPR-Cas9+enzymes.">Genome editing in animals with minimal PAM CRISPR-Cas9 enzymes.</a> Nature Communications. 13, 2601 (2022).</li><li>Rosello, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease+modeling+by+efficient+genome+editing+using+a+near+PAM-less+base+editor+in+vivo.">Disease modeling by efficient genome editing using a near PAM-less base editor in vivo.</a> Nature Communications. 13, 3435 (2022).</li><li>Cornean, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precise+in+vivo+functional+analysis+of+DNA+variants+with+base+editing+using+ACEofBASEs+target+prediction.">Precise in vivo functional analysis of DNA variants with base editing using ACEofBASEs target prediction.</a> eLife. 11, 72124 (2022).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+silencing+by+adenine+base+editor-mediated+start+codon+mutation.">Efficient gene silencing by adenine base editor-mediated start codon mutation.</a> Molecular Therapy. 28 (2), 431-440 (2020).</li><li>Hanna, R. 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K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+genome+editing+in+human+cells+using+CRISPR/Cas+nucleases+and+truncated+guide+RNAs.">Targeted genome editing in human cells using CRISPR/Cas nucleases and truncated guide RNAs.</a> Methods in Enzymology. 546, 21-45 (2014).</li></ol>

Dieses Protokoll beschreibt die Konstruktion eines Zebrafisch-Krankheitsmodells mit Hilfe des Basiseditors zSpRY-ABE8e. Im Vergleich zum herkömmlichen HDR-Pfad für die Basensubstitution kann dieses Protokoll eine effizientere Basisbearbeitung erreichen und das Auftreten von Indels reduzieren. Gleichzeitig beinhaltet dieses Protokoll die Umsetzung der kürzlich vorgeschlagenen i-Silence-Gen-Knockout-Strategie im Zebrafisch. Zusammenfassend wird zSpRY-ABE8e die Anwendung von Zebrafischmodellen in der Krankheitsforschung ...

Einzelnukleotidvarianten (SNVs), die Missense- oder Nonsense-Mutationen verursachen, sind die häufigste Quelle für Mutationen im menschlichen Genom1. Um festzustellen, ob eine bestimmte SNV pathogen ist, und um ihre Pathogenese aufzuklären, sind präzise Tiermodelle erforderlich2. Zebrafische sind gute menschliche Krankheitsmodelle, die ein hohes Maß an physiologischer und genetischer Homologie mit dem Menschen, einen kurzen Entwicklungszyklus und eine starke Fortpflanzungsfähigkeit aufweisen, was für die Erforschung pathogener Eigenschaften und Mechanismen sowie für das Screening von Medikamenten von Vorteil ist3.
Das CRISPR/Cas9-System (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) wurde in großem Umfang in der Genom-Editierung verschiedener Arten, einschließlich Zebrafisch4, eingesetzt. Mit gRNA-Führung kann das CRISPR/Cas9-System DNA-Doppelstrangbrüche (DSBs) an der Zielstelle erzeugen, die dann eine Einzelbasensubstitution durch Rekombination der Zielstelle mit Spender-DNA-Vorlagen über den Homologie-gerichteten Reparaturweg (HDR) ermöglichen. Die Effizienz dieser Basenersatzmethode ist jedoch recht gering, da der zelluläre DNA-Reparaturprozess hauptsächlich über den nicht-homologen End-Joining-Signalweg (NHEJ) durchgeführt wird, der in der Regel von Insertions- und Deletionsmutationen (Indel-Mutationen) begleitet wird5. Glücklicherweise entschärft die CRISPR/Cas9-basierte Single-Base-Editing-Technologie dieses Problem erheblich, indem sie Basis-Editoren verwendet, die eine effizientere Single-Base-Bearbeitung ermöglichen, ohne DSBs zu induzieren. Zwei Hauptklassen von Baseneditoren, Adenin-Basen-Editoren (ABEs) und Cytosin-Basen-Editoren (CBEs), wurden entwickelt, um die Basensubstitutions-Editierung für A· T bis G· C und C·G bis T· A bzw. 6,7,8,9,10,11. Diese vier Arten von Basensubstitutionen decken 30 % der humanpathogenen Variantenab 12. Es wurde berichtet, dass beide Klassen von Basiseditoren, einschließlich PmCDA1, BE-System, CBE4max, ABE7.10 und ABE8e, in Zebrafischen funktionieren, wobei BE4max und ABE8e insbesondere eine hohe Bearbeitungsaktivität erreichen 13,14,15,16,17,18,19.
Cas9-Proteine aus verschiedenen Spezies, darunter Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes und S. canis, wurden in die Genom-Editierung von Zebrafischen implementiert, wobei das Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9) am häufigsten verwendet wurde20,21,22,23. SpCas9 kann jedoch nur Zielstellen mit einem NGG-Protospacer-Nachbarmotiv (PAM) erkennen, was seinen editierbaren Bereich einschränkt und dazu führen kann, dass keine geeignete Sequenz in der Nähe des pathogenen Ortes gefunden wird24. Um den Zielbereich zu erweitern, wurde eine Vielzahl von SpCas9-Varianten entwickelt, um verschiedene PAMs durch gerichtete Evolution und strukturgeführtes Design zu erkennen. Allerdings sind nur wenige Varianten bei Tieren wirksam, insbesondere bei Zebrafischen, was die Anwendung von Zebrafischen in der SNV-bezogenen Krankheitsforschung einschränkt25,26,27,28. Kürzlich wurde berichtet, dass zwei Varianten von SpCas9, SpG und SpRY, mit weniger strengen PAM-Einschränkungen (NGN für SpG und NNN für SpRY mit einer höheren Präferenz für NRN als NYN), eine hohe Editieraktivität in menschlichen Zellen und Pflanzen aufweisen 29,30,31,32. In der Folge wurde berichtet, dass SpG und SpRY sowie eine Reihe ihrer vermittelten Basiseditoren, wie z. B. SpRY-vermittelte CBEs und SpRY-vermittelte ABEs, auch im Zebrafisch funktionieren, was die Anwendung von Zebrafischmodellen in der mechanistischen Untersuchung und dem Arzneimittelscreening von SNV-bedingten Krankheiten verbessern wird 18,33,34,35. Darüber hinaus wurde i-Silence als effektive und genaue Gen-Knockout-Strategie durch ABE-vermittelte Start-Codon-Konversion von ATG zu GTG oder ACG36 vorgeschlagen. Die Kombination aus der i-Silence-Strategie und dem SpRY-vermittelten Basiseditor zSpRY-ABE8e stellt eine neue Methode zur Krankheitsmodellierungdar 18. Dieses Protokoll demonstriert, wie Genom-Editierung mit zSpRY-ABE8e im Zebrafisch durchgeführt werden kann, um ein tsr2 (M1V)-Modell unter Verwendung der i-Silence-Strategie zu konstruieren. Die Editiereffizienz und die Phänotypen, die in Zebrafischmodellen auftreten, wurden bewertet und analysiert.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9539</td>
			<td>1.5% Agarose used to make an injection plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Glass Capillaries&#160;</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>BS4 30-0016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture dishes&#160;</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit</td>
			<td>Vazyme</td>
			<td>C115</td>
			<td>Kit for Infusion clone&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Codon optimization service</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drummond Microcaps</td>
			<td>Drummond Microcaps</td>
			<td>P1299-1PAK</td>
			<td>Length:32 mm, capacity:0.5 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasyEdit gRNA service</td>
			<td>GenScript</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Forceps</td>
			<td>Fine Scientific Instrument</td>
			<td>11254-20</td>
			<td>Used to break meedle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flaming/Brown Micropipette Puller&#160;</td>
			<td>Stutter Instrument</td>
			<td>P-97</td>
			<td>Used to pull the glass capillaries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HotStart Taq PCR StarMix</td>
			<td>Genstar</td>
			<td>A033-101</td>
			<td>Used for PCR reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intelligent artificial climate box</td>
			<td>TENLIN</td>
			<td>PRX-1000A</td>
			<td>Used to culture zebrafish embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylcellulose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M0512</td>
			<td>Used to fix zebrafish when photographing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microloader pipette tips&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5242956003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mMACHINE kit&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mut Express II Fast Mutagenesis Kit V2</td>
			<td>Vazyme</td>
			<td>C214-01</td>
			<td>Kit for site-directed mutagenesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pneumatic Microinjector</td>
			<td>ZGene Biotech</td>
			<td>ZGPCP-1500 PLUS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pT3TS-zSpCas9</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>46757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy FFPE kit&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>73504</td>
			<td>Kit for RNA purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sanger Sequencing service</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide, granular</td>
			<td>Sangon</td>
			<td>A100173-0500</td>
			<td>NaOH used for genome extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Microscope</td>
			<td>Olympus&#160;</td>
			<td>SZX10</td>
			<td>Used for photograph of phenotype</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SZ Series Zoom Stereo Microscope</td>
			<td>CNOPTEC</td>
			<td>SZ650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T3 mMESSAGE</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM1348</td>
			<td>Kit for in vitro transcription&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TIANprep Mini Plasmid Kit</td>
			<td>TIANGEN</td>
			<td>DP103-03</td>
			<td>Kit for plasmid extraction kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TIANquick Mini Purification Kit</td>
			<td>TIANGEN</td>
			<td>DP203-02</td>
			<td>Kit for purification for linearized plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E10521</td>
			<td>Used to anesthetize zebrafish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris (hydroxymethyl) aminomethane</td>
			<td>Sangon</td>
			<td>A600194-0500</td>
			<td>Component of Tris&#183;HCl used for genome extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XbaI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0145S</td>
			<td>Restriction endonuclease used for plasmid linearization</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

efficient pam-less base editing for zebrafish modeling of human genetic disease with zspry-abe8e

Die CRISPR/Cas9-Technologie hat den Wert des Zebrafisches für die Modellierung menschlicher genetischer Krankheiten, die Untersuchung der Krankheitspathogenese und das Screening von Medikamenten erhöht, aber die Einschränkungen des Protospacer-benachbarten Motivs (PAM) sind ein großes Hindernis für die Erstellung genauer Tiermodelle menschlicher genetischer Erkrankungen, die durch Einzelnukleotidvarianten (SNVs) verursacht werden. Bisher haben einige SpCas9-Varianten mit breiter PAM-Kompatibilität ihre Wirksamkeit im Zebrafisch gezeigt. Die Anwendung des optimierten SpRY-vermittelten Adenin-Basen-Editors (ABE), zSpRY-ABE8e und synthetisch modifizierter gRNA im Zebrafisch hat eine effiziente Adenin-Guanin-Basenumwandlung ohne PAM-Einschränkung ermöglicht. Hier wird ein Protokoll zur effizienten Adeninbasen-Editierung ohne PAM-Begrenzung im Zebrafisch unter Verwendung von zSpRY-ABE8e beschrieben. Durch die Injektion einer Mischung aus zSpRY-ABE8e mRNA und synthetisch modifizierter gRNA in Zebrafischembryonen wurde ein Zebrafisch-Krankheitsmodell mit einer präzisen Mutation konstruiert, das eine pathogene Stelle des TSR2-Ribosomenreifungsfaktors (tsr2) simulierte. Diese Methode stellt ein wertvolles Werkzeug für die Etablierung genauer Krankheitsmodelle zur Untersuchung von Krankheitsmechanismen und -behandlungen dar.

Es wurde berichtet, dass die Mutation von TSR2 eine Diamond Blackfan-Anämie (DBA) verursacht42. In dieser Arbeit wurde ein DBA-Zebrafischmodell mit einer tsr2 (M1V)-Mutation unter Verwendung der i-Silence-Strategie konstruiert. Das Adenin des Startcodons des Zebrafisches tsr2 wurde mit Hilfe von zSpRY-ABE8e erfolgreich in Guanin umgewandelt (Abbildung 3).
Die EditR-Analyse der Sanger-Sequenzierungsergebnisse zeig...

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Efficient PAM-Less Base Editing for Zebrafish Modeling of Human Genetic Disease with zSpRY-ABE8e

Dieses Protokoll beschreibt, wie eine effiziente Adeninbasen-Editierung ohne PAM-Beschränkung durchgeführt werden kann, um ein präzises Zebrafisch-Krankheitsmodell mit zSpRY-ABE8e zu konstruieren.

Effizientes PAM-loses Baseneditieren für die Zebrafisch-Modellierung menschlicher genetischer Erkrankungen mit zSpRY-ABE8e

CRISPR/Cas9 technology has increased the value of zebrafish for modeling human genetic diseases, studying disease pathogenesis, and drug screening, but ...

Dieses Protokoll ermöglicht es den Forschern, eine Reihe von bisher nicht verfügbaren Zebrafischmodellen von krankheitsrelevanten Einzelnukleotidvarianten zu erstellen. PAM-Einschränkungen sind ein großes Hindernis für die Erstellung genauer Tiermodelle, und zSpRY-ABE8e ermöglicht eine effiziente Umwandlung von Adenin in Guanin-Basen mit geringer Intermutation und entspannter PAN-Restriktion. Dieses Werkzeug kann verwendet werden, um genaue Zebrafischmodelle zu konstruieren, um die pathogenen Eigenschaften von Krankheitsmechanismen im Zusammenhang mit Einzelnukleotidmarinen zu untersuchen und Medikamente auf diese Krankheit zu untersuchen.Richten Sie zunächst das Mikropipettenziehsystem ein und heizen Sie es mindestens 30 Minuten lang vor. Um die Glaskapillaren zu ziehen, wählen Sie ein Programm aus, stellen Sie den Rampentestwert als Wärme, 50 als Zug, die Geschwindigkeit als 100, die Zeit als 50 und den Druck als 30 ein. Installieren Sie als Nächstes das Kapillarrohr und stellen Sie sicher, dass es sich in der Nut befindet.Drücken Sie Pull Start/Stop", um das Programm auszuführen. Um die gezogenen Kapillaren zu schonen, führen Sie sie in Schaumstoff ein, der Lücken enthält, so dass die Nadel in der Schwebe bleibt. Verwenden Sie für Experimente die im Manuskript beschriebene zSpRY-ABE8e-mRNA und editieren Sie sgRNA, die an beiden Enden mit 2'O-Methylphosphorothioat modifiziert wurde.Für das gRNA-Design ist bevorzugt NRN als PAM-Sequenz zu wählen, da zSpRY-ABE8e eine höhere Präferenz für NRN-PAM als NYN-PAM zeigt. Geben Sie das Ziel-Adenin-Nukleotid in das hochaktive Editierfenster vom dritten bis zum neunten Nukleotid entlang des Protospacers ein. Stellen Sie in der Nacht vor der Injektion Aufzuchtbecken.Setzen Sie eine Trennwand ein und legen Sie zwei weibliche und einen männlichen Zebrafisch in jedes Becken. Legen Sie einen Deckel über jeden Tank. Am nächsten Morgen mischen Sie die aufgetaute mRNA und EEgRNA auf Eis mit RNase-freien Spitzen, Röhrchen und Handschuhen auf eine Endkonzentration von 400 bzw. 200 Nanogramm pro Mikroliter.Um den pneumatischen Mikroinjektor zu konfigurieren, schließen Sie zunächst das Partialdruckventil der Luftpumpe. Öffnen Sie dann das Hauptventil, schrauben Sie die Gasflasche ab und stellen Sie den Druck des Partialdruckventils auf 0,2 Megapascal ein. Schalten Sie nun den Mikroinjektor ein und stellen Sie den Modus auf Timer.Stellen Sie den Parameter Druckventil auf 20 Pfund pro Quadratzoll und den Timer-Wert auf 0,040 Sekunden ein. Brechen Sie mit einer feinen Pinzette die Nadeln der gezogenen Glaskapillaren unter einem Stereomikroskop schräg auf. Geben Sie das mRNA/gRNA-Gemisch mit einer Microloader-Pipettenspitze in die Spitze einer Glaskapillare und befestigen Sie die Nadel am Mikromanipulator.Konfigurieren Sie den Druck- und Timer-Wert so, dass mit einer Mikrokappe ein Zwei-Nanoliter-Gemisch pro Injektion erzeugt wird. Nachdem Sie den Fisch 10 bis 15 Minuten lang gezüchtet haben, sammeln Sie die Eier in einem Sieb. Untersuchen Sie das Zellstadium und die Eiqualität unter dem Stereomikroskop.Wählen Sie einzellige Eizellen für die Injektion aus, um die Bearbeitungseffizienz zu verbessern. Legen Sie die Eizellen auf eine 1,5%ige Agarose-Injektionsplatte und injizieren Sie zwei Nanoliter der RNA-Mischung mit einem Mikroskop in die Zelle der Embryonen. Sammeln Sie die Eier in Petrischalen mit E3-Puffer und bebrüten Sie sie bei 28 Grad Celsius.Entfernen Sie die toten Eizellen und wechseln Sie den Kulturpuffer 48 Stunden nach der Befruchtung alle 12 Stunden. Nach 48 Stunden nach der Befruchtung werden drei Pools mit sechs zufällig ausgewählten injizierten Embryonen in ein PCR-Röhrchen gesammelt. Sobald sechs zufällig ausgewählte Kontrollembryonen entnommen wurden, verwenden Sie eine Pipette, um den verbleibenden E3-Puffer abzusaugen.Fügen Sie den Embryonen 40 Mikroliter 50 millimolare Natriumhydroxid hinzu. Legen Sie die Röhrchen für 20 Minuten in ein Metallbad bei 95 Grad Celsius und wirbeln Sie sie dann 15 Sekunden lang. Geben Sie vier Mikroliter eines molaren Trishydrochlorids bei einem pH-Wert von acht in jedes Röhrchen.Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 2000 g für 10 Sekunden bei Raumtemperatur. Übertragen Sie den Überstand in ein neues PCR-Röhrchen. Entfernen Sie einen Mikroliter des Überstands aus dem PCR-Röhrchen und verwenden Sie ihn für die Sanger-Sequenzierung.Den restlichen Überstand dann bei 20 Grad Celsius lagern. Um die Sanger-Sequenzierungsdaten zu analysieren, laden Sie zunächst die Sequenzierungsdatei in das Feld "ab1-Datei hochladen" hoch. Geben Sie die gRNA-Sequenz mit 20 Basenpaaren in der Orientierung von 5's bis 3' in das Feld "gRNA"-Sequenz eingeben ein.Geben Sie die entsprechende Basisposition in die Felder 5'start und 3'ends ein. Erzielen Sie die Effizienz der Basisbearbeitung, indem Sie auf "Predictive Editing" klicken und die Qualität der Sequenzierungsdaten überprüfen. Ein Diamond-Blackfan-Anämie-Zebrafischmodell wurde konstruiert, indem das Adenin des Startcodons von Tsr2 in Guanin umgewandelt wurde.Die EditR-Analyse der Sequenzdaten zeigte eine AG-Überlappung an der Adeninbase des Tsr2-Startcodons. Der Phänotyp der beiden einen Tag alten Tsr2-Embryonen zeigte im Vergleich zu den Kontrollembryonen kleinere Augen. Auch bei den mutierten Embryonen wurde ein geschwollener Perikard beobachtet.Um eine effiziente Basenbearbeitung zu erreichen, halten Sie sich bitte strikt an das zuvor erwähnte Guideline-Design-Prinzip, das Voraussetzung für den Erfolg des Experiments ist. Genaue Modelle sind für die Untersuchung von Krankheiten, die mit Einzelnukleotidvarianten in Verbindung stehen, unerlässlich. Die Entwicklung des SprY-ABE8e bietet ein effektives Werkzeug für eine genaue Modellierung, das dazu beiträgt, die Erforschung von Krankheitsmechanismen und -behandlungen zu fördern.

Research

JoVE Journal

Biology

An Allele-specific Gene Expression Assay to Test the Functional Basis of Genetic Associations

Ein Allel-spezifische Gene Expression Assay zur Funktionsanalyse Grundlage genetischer Verbände testen

The number of significant genetic associations with common complex traits is constantly increasing. However, most of these associations have not been ...

Forschung

Biologie

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

Effiziente Ableitung von Human Cardiac Vorstufen und Kardiomyozyten aus pluripotenten humanen embryonalen Stammzellen mit Small Molecule Induction

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

Biochemische und High Throughput Mikroskopische Beurteilung der Fettmasse in<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

The nematode C. elegans has emerged as an important  model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as  it relates to human ...

In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio

In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio

In Vivo Modellierung des Morbid Human Genome mit Danio rerio

Here,  we present methods for the development of assays to query potentially clinically  significant nonsynonymous changes using in  vivo complementation ...

Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells

Generation of Human Cardiomyocytes: Eine Differenzierung Protokoll von Feeder-freien menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is ...

Efficient Agroinfiltration of Plants for High-level Transient Expression of Recombinant Proteins

Effiziente Agroinfiltration von Pflanzen für High-Level-Transient Expression von rekombinanten Proteinen

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing ...

Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis

Schnelle und effiziente Verwendung von Zebrafisch-Genotypisierung PCR mit Hochauflösende Schmelzanalyse

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic ...

Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies

Effizienten Herstellung und Reinigung von rekombinantem murinem Kindlin-3 von Insektenzellen für biophysikalische Studien

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

Effiziente Erzeugung Menschen induzierten pluripotenten Stammzellen aus menschlichen Körperzellen mit Sendai-Virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

Genetic Barcoding with Fluorescent Proteins for Multiplexed Applications

Genetische Barcoding mit Fluoreszierende Proteine ​​für Multiplex-Anwendungen

Fluorescent proteins, fluorescent dyes and fluorophores in general have revolutionized the field of molecular cell biology. In particular, the discovery ...