Name: efficient pam-less base editing for zebrafish modeling of human genetic disease with zspry-abe8e
Uploaded: 2023-02-17T13:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Efficient PAM-Less Base Editing for Zebrafish Modeling of Human Genetic Disease with zSpRY-ABE8e at JoVE.com

この原稿の草稿の英語テキストを編集してくれたLiwen Bianji(Edanz)のBarbara Garbers博士に感謝します。この研究は、広東省の主要地域研究開発プログラム(2019B030335001)、中国の国家重点研究開発プログラム(2019YFE0106700)、中国国家自然科学財団(32070819、31970782)、および広東省の水生経済動物の病原生物学および疫学の主要研究所の研究基金プログラム(PBEA2020YB05)によってサポートされました。

この研究は、華南師範大学のケアアンドユース委員会のガイドラインに厳密に準拠して実施されました。
1. 合成修飾gRNAおよびzSpRY-ABE8e mRNAの調製
<ol><li>以前の文献37、38に従ってgRNAを設計する。<ol><li>zSpRY-ABE8eはNYN PAMよりもNRN PAMの選好が高いため、PAM配列としてNRNを優先的に選択します(RはAまたはG、YはCまたはT)<s...

<ol>
	<li>Eichler, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Completing+the+map+of+human+genetic+variation.">Completing the map of human genetic variation.</a> Nature. 447 (7141), 161-165 (2007).</li><li>Koukouli, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotine+reverses+hypofrontality+in+animal+models+of+addiction+and+schizophrenia.">Nicotine reverses hypofrontality in animal models of addiction and schizophrenia.</a> Nature Medicine. 23 (3), 347-354 (2017).</li><li>Kalueff, A. V., Stewart, A. M., Gerlai, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+an+emerging+model+for+studying+complex+brain+disorders.">Zebrafish as an emerging model for studying complex brain disorders.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 35 (2), 63-75 (2014).</li><li>Anzalone, A. V., Koblan, L. W., Liu, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing+with+CRISPR-Cas+nucleases,+base+editors,+transposases+and+prime+editors.">Genome editing with CRISPR-Cas nucleases, base editors, transposases and prime editors.</a> Nature Biotechnology. 38 (7), 824-844 (2020).</li><li>Sander, J. D., Joung, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas+systems+for+editing,+regulating+and+targeting+genomes.">CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes.</a> Nature Biotechnology. 32 (4), 347-355 (2014).</li><li>Komor, A. C., Kim, Y. B., Packer, M. S., Zuris, J. A., Liu, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmable+editing+of+a+target+base+in+genomic+DNA+without+double-stranded+DNA+cleavage.">Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage.</a> Nature. 533 (7603), 420-424 (2016).</li><li>Nishida, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+nucleotide+editing+using+hybrid+prokaryotic+and+vertebrate+adaptive+immune+systems.">Targeted nucleotide editing using hybrid prokaryotic and vertebrate adaptive immune systems.</a> Science. 353 (6305), (2016).</li><li>Gaudelli, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+adenine+base+editors+with+increased+activity+and+therapeutic+application.">Directed evolution of adenine base editors with increased activity and therapeutic application.</a> Nature Biotechnology. 38 (7), 892-900 (2020).</li><li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+RNA-guided+base+editing+in+rabbit.">Highly efficient RNA-guided base editing in rabbit.</a> Nature Communications. 9, 2717 (2018).</li><li>Levy, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytosine+and+adenine+base+editing+of+the+brain,+liver,+retina,+heart+and+skeletal+muscle+of+mice+via+adeno-associated+viruses.">Cytosine and adenine base editing of the brain, liver, retina, heart and skeletal muscle of mice via adeno-associated viruses.</a> Nature Biomedical Engineering. 4 (1), 97-110 (2020).</li><li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+generation+of+mouse+models+of+human+diseases+via+ABE-+and+BE-mediated+base+editing.">Efficient generation of mouse models of human diseases via ABE- and BE-mediated base editing.</a> Nature Communications. 9, 2338 (2018).</li><li>Landrum, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ClinVar:+Public+archive+of+interpretations+of+clinically+relevant+variants.">ClinVar: Public archive of interpretations of clinically relevant variants.</a> Nucleic Acids Research. 44, 862-868 (2016).</li><li>Qin, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precise+A&#8226;T+to+G&#8226;C+base+editing+in+the+zebrafish+genome.">Precise A&#8226;T to G&#8226;C base editing in the zebrafish genome.</a> BMC Biology. 16 (1), 139 (2018).</li><li>Tanaka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+targeted+single-nucleotide+editing+in+zebrafish.">In vivo targeted single-nucleotide editing in zebrafish.</a> Scientific Reports. 8, 11423 (2018).</li><li>Carrington, B., Weinstein, R. N., Sood, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BE4max+and+AncBE4max+are+efficient+in+germline+conversion+of+C:G+to+T:A+base+pairs+in+zebrafish.">BE4max and AncBE4max are efficient in germline conversion of C:G to T:A base pairs in zebrafish.</a> Cells. 9 (7), 1690 (2020).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmable+base+editing+of+zebrafish+genome+using+a+modified+CRISPR-Cas9+system.">Programmable base editing of zebrafish genome using a modified CRISPR-Cas9 system.</a> Nature Communications. 8, 118 (2017).</li><li>Rosello, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precise+base+editing+for+the+in+vivo+study+of+developmental+signaling+and+human+pathologies+in+zebrafish.">Precise base editing for the in vivo study of developmental signaling and human pathologies in zebrafish.</a> eLife. 10, 65552 (2021).</li><li>Liang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SpG+and+SpRY+variants+expand+the+CRISPR+toolbox+for+genome+editing+in+zebrafish.">SpG and SpRY variants expand the CRISPR toolbox for genome editing in zebrafish.</a> Nature Communications. 13, 3421 (2022).</li><li>Qin, W., Lu, X., Lin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmable+base+editing+in+zebrafish+using+a+modified+CRISPR-Cas9+system.">Programmable base editing in zebrafish using a modified CRISPR-Cas9 system.</a> Methods. 150, 19-23 (2018).</li><li>Feng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+CRISPR/Cas9+genome+editing+capacity+in+zebrafish+using+SaCas9.">Expanding CRISPR/Cas9 genome editing capacity in zebrafish using SaCas9.</a> G3. 6 (8), 2517-2521 (2016).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing+in+zebrafish+by+ScCas9+recognizing+NNG+PAM.">Genome editing in zebrafish by ScCas9 recognizing NNG PAM.</a> Cells. 10 (8), 2099 (2021).</li><li>Kleinstiver, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+CRISPR-Cas9+nucleases+with+altered+PAM+specificities.">Engineered CRISPR-Cas9 nucleases with altered PAM specificities.</a> Nature. 523 (7561), 481-485 (2015).</li><li>Liu, K., Petree, C., Requena, T., Varshney, P., Varshney, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+the+CRISPR+toolbox+in+zebrafish+for+studying+development+and+disease.">Expanding the CRISPR toolbox in zebrafish for studying development and disease.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 13 (2019).</li><li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity.">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li><li>Hu, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolved+Cas9+variants+with+broad+PAM+compatibility+and+high+DNA+specificity.">Evolved Cas9 variants with broad PAM compatibility and high DNA specificity.</a> Nature. 556 (7699), 57-63 (2018).</li><li>Nishimasu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+CRISPR-Cas9+nuclease+with+expanded+targeting+space.">Engineered CRISPR-Cas9 nuclease with expanded targeting space.</a> Science. 361 (6408), 1259-1262 (2018).</li><li>Endo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing+in+plants+by+engineered+CRISPR-Cas9+recognizing+NG+PAM.">Genome editing in plants by engineered CRISPR-Cas9 recognizing NG PAM.</a> Nature Plants. 5, 14-17 (2019).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+genome+editing+using+xCas9+with+expanded+PAM+compatibility.">Plant genome editing using xCas9 with expanded PAM compatibility.</a> Journal of Genetics and Genomics. 46 (5), 277-280 (2019).</li><li>Ren, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PAM-less+plant+genome+editing+using+a+CRISPR-SpRY+toolbox.">PAM-less plant genome editing using a CRISPR-SpRY toolbox.</a> Nature Plants. 7, 25-33 (2021).</li><li>Xu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SpRY+greatly+expands+the+genome+editing+scope+in+rice+with+highly+flexible+PAM+recognition.">SpRY greatly expands the genome editing scope in rice with highly flexible PAM recognition.</a> Genome Biology. 22 (1), 6 (2021).</li><li>Walton, R. T., Christie, K. A., Whittaker, M. N., Kleinstiver, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unconstrained+genome+targeting+with+near-PAMless+engineered+CRISPR-Cas9+variants.">Unconstrained genome targeting with near-PAMless engineered CRISPR-Cas9 variants.</a> Science. 368 (6488), 290-296 (2020).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing+mediated+by+SpCas9+variants+with+broad+non-canonical+PAM+compatibility+in+plants.">Genome editing mediated by SpCas9 variants with broad non-canonical PAM compatibility in plants.</a> Molecular Plant. 14 (2), 352-360 (2021).</li><li>Vicencio, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing+in+animals+with+minimal+PAM+CRISPR-Cas9+enzymes.">Genome editing in animals with minimal PAM CRISPR-Cas9 enzymes.</a> Nature Communications. 13, 2601 (2022).</li><li>Rosello, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease+modeling+by+efficient+genome+editing+using+a+near+PAM-less+base+editor+in+vivo.">Disease modeling by efficient genome editing using a near PAM-less base editor in vivo.</a> Nature Communications. 13, 3435 (2022).</li><li>Cornean, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precise+in+vivo+functional+analysis+of+DNA+variants+with+base+editing+using+ACEofBASEs+target+prediction.">Precise in vivo functional analysis of DNA variants with base editing using ACEofBASEs target prediction.</a> eLife. 11, 72124 (2022).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+silencing+by+adenine+base+editor-mediated+start+codon+mutation.">Efficient gene silencing by adenine base editor-mediated start codon mutation.</a> Molecular Therapy. 28 (2), 431-440 (2020).</li><li>Hanna, R. E., Doench, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+analysis+of+CRISPR-Cas+experiments.">Design and analysis of CRISPR-Cas experiments.</a> Nature Biotechnology. 38 (7), 813-823 (2020).</li><li>Doench, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+sgRNA+design+to+maximize+activity+and+minimize+off-target+effects+of+CRISPR-Cas9.">Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9.</a> Nature Biotechnology. 34 (2), 184-191 (2016).</li><li>Kossack, M. E., Draper, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+regulation+of+sex+determination+and+maintenance+in+zebrafish+(Danio+rerio).">Genetic regulation of sex determination and maintenance in zebrafish (Danio rerio).</a> Current Topics in Developmental Biology. 134, 119-149 (2019).</li><li>Crossley, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+Sanger+sequencing+and+molecular+assay+monitoring.">Guidelines for Sanger sequencing and molecular assay monitoring.</a> Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 32 (6), 767-775 (2020).</li><li>Kluesner, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EditR:+A+method+to+quantify+base+editing+from+Sanger+sequencing.">EditR: A method to quantify base editing from Sanger sequencing.</a> The CRISPR Journal. 1 (3), 239-250 (2018).</li><li>Gripp, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diamond-Blackfan+anemia+with+mandibulofacial+dystostosis+is+heterogeneous,+including+the+novel+DBA+genes+TSR2+and+RPS28.">Diamond-Blackfan anemia with mandibulofacial dystostosis is heterogeneous, including the novel DBA genes TSR2 and RPS28.</a> American Journal of Medical Genetics Part A. 164 (9), 2240-2249 (2014).</li><li>Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+RNA-guided+genome+editing+in+human+cells+via+delivery+of+purified+Cas9+ribonucleoproteins.">Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins.</a> Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).</li><li>Ramakrishna, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+disruption+by+cell-penetrating+peptide-mediated+delivery+of+Cas9+protein+and+guide+RNA.">Gene disruption by cell-penetrating peptide-mediated delivery of Cas9 protein and guide RNA.</a> Genome Research. 24 (6), 1020-1027 (2014).</li><li>Fu, Y., Reyon, D., Joung, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+genome+editing+in+human+cells+using+CRISPR/Cas+nucleases+and+truncated+guide+RNAs.">Targeted genome editing in human cells using CRISPR/Cas nucleases and truncated guide RNAs.</a> Methods in Enzymology. 546, 21-45 (2014).</li></ol>

このプロトコルは、ベースエディタzSpRY-ABE8eを使用したゼブラフィッシュ病モデルの構築を記述します。塩基置換のための従来のHDR経路と比較して、このプロトコルはより効率的な塩基編集を達成し、インデルの発生を減らすことができます。同時に、このプロトコルには、最近提案されたi-Silence遺伝子ノックアウト戦略をゼブラフィッシュに実装することが含まれます。まとめると、zSpRY-AB...

ミスセンス変異またはナンセンス変異を引き起こす一塩基変異体(SNV)は、ヒトゲノム1における最も一般的な変異源です。特定のSNVが病原性であるかどうかを判断し、その病因を明らかにするためには、正確な動物モデルが必要です2。ゼブラフィッシュは、ヒトとの高度な生理学的および遺伝的相同性、短い発生サイクル、および強力な繁殖能力を示す優れたヒト疾患モデルであり、病原性の特徴とメカニズムの研究、および薬物スクリーニングに有利です3。
クラスター化された規則的に間隔を空けた短い回文反復(CRISPR)/Cas9システムは、ゼブラフィッシュ4を含むさまざまな種のゲノム編集に広く適用されています。gRNAガイダンスにより、CRISPR/Cas9システムは標的部位でDNA二本鎖切断(DSB)を生成することができ、相同性指向性修復(HDR)経路を介して標的部位とドナーDNAテンプレートとの組換えによる一塩基置換が可能になります。しかし、細胞DNA修復プロセスは主に非相同末端結合(NHEJ)経路によって行われ、通常は挿入および欠失(インデル)変異を伴うため、この塩基置換法の効率は非常に低いです5。幸いなことに、CRISPR/Cas9ベースのシングルベース編集技術は、DSBを誘導することなくより効率的なシングルベース編集を可能にするベースエディタを使用することで、この問題を大幅に軽減します。Two major classes of base editors, adenine base editors (ABEs) and cytosine base editors (CBEs), have been developed to implement base substitution editing for A·T から G·C および C·G から T ·A、それぞれ6、7、8、9、10、11。これらの4種類の塩基置換は、ヒト病原性多様体の30%をカバーしています12。PmCDA1、BEシステム、CBE4max、ABE7.10、ABE8eを含む両方のクラスのベースエディタは、ゼブラフィッシュで動作することが報告されており、特にBE4maxとABE8eは高い編集活動を達成することが報告されています13,14,15,16,17,18,19。
黄色ブドウ球菌、化膿レンサ球菌、およびS.canisを含む異なる種のCas9タンパク質は、ゼブラフィッシュ遺伝子編集に実装されており、化膿レンサ球菌Cas9(SpCas9)が最も広く使用されています20,21,22,23。 しかしながら、SpCas9は、NGGプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)を有する標的部位しか認識できず、これはその編集可能な範囲を制限し、その結果、目的の病原性部位の近くに適切な配列が見出されない可能性がある24。ターゲット範囲を拡大するために、さまざまなSpCas9バリアントが、指向性進化と構造ガイド付き設計を通じてさまざまなPAMを認識するように設計されています。しかし、動物、特にゼブラフィッシュに有効な変異体はほとんどなく、SNV関連疾患研究におけるゼブラフィッシュの適用を制限しています25,26,27,28。最近、SpCas9の2つのバリアント、SpGおよびSpRYは、PAM制限がそれほど厳しくない(SpGのNGNおよびSpRYのNNNはNYNよりもNRNの選好が高い)が、ヒトの細胞および植物において高い編集活性を示すことが報告されている29,30,31,32。その後、SpGとSpRY、およびSpRYを介したCBEやSpRYを介したABEなどの多くの媒介ベースエディターもゼブラフィッシュで機能することが報告されており、SNV関連疾患の機構研究と薬物スクリーニングにおけるゼブラフィッシュモデルの適用を強化します18,33,34,35.さらに、i-Silenceは、ABEを介したATGからGTGまたはACG36への開始コドン変換による効果的で正確な遺伝子ノックアウト戦略として提案されました。i-Silence戦略とSpRYを介したベースエディターzSpRY-ABE8eの組み合わせは、疾患モデリングのための新しい方法を提供します18。このプロトコルは、ゼブラフィッシュでzSpRY-ABE8eを使用して遺伝子編集を実行し、i-Silence戦略を使用してtsr2(M1V)モデルを構築する方法を示しています。ゼブラフィッシュモデルに現れる編集効率と表現型を評価および分析しました。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9539</td>
			<td>1.5% Agarose used to make an injection plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Glass Capillaries&#160;</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>BS4 30-0016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture dishes&#160;</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit</td>
			<td>Vazyme</td>
			<td>C115</td>
			<td>Kit for Infusion clone&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Codon optimization service</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drummond Microcaps</td>
			<td>Drummond Microcaps</td>
			<td>P1299-1PAK</td>
			<td>Length:32 mm, capacity:0.5 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasyEdit gRNA service</td>
			<td>GenScript</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Forceps</td>
			<td>Fine Scientific Instrument</td>
			<td>11254-20</td>
			<td>Used to break meedle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flaming/Brown Micropipette Puller&#160;</td>
			<td>Stutter Instrument</td>
			<td>P-97</td>
			<td>Used to pull the glass capillaries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HotStart Taq PCR StarMix</td>
			<td>Genstar</td>
			<td>A033-101</td>
			<td>Used for PCR reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intelligent artificial climate box</td>
			<td>TENLIN</td>
			<td>PRX-1000A</td>
			<td>Used to culture zebrafish embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylcellulose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M0512</td>
			<td>Used to fix zebrafish when photographing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microloader pipette tips&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5242956003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mMACHINE kit&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mut Express II Fast Mutagenesis Kit V2</td>
			<td>Vazyme</td>
			<td>C214-01</td>
			<td>Kit for site-directed mutagenesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pneumatic Microinjector</td>
			<td>ZGene Biotech</td>
			<td>ZGPCP-1500 PLUS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pT3TS-zSpCas9</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>46757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy FFPE kit&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>73504</td>
			<td>Kit for RNA purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sanger Sequencing service</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide, granular</td>
			<td>Sangon</td>
			<td>A100173-0500</td>
			<td>NaOH used for genome extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Microscope</td>
			<td>Olympus&#160;</td>
			<td>SZX10</td>
			<td>Used for photograph of phenotype</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SZ Series Zoom Stereo Microscope</td>
			<td>CNOPTEC</td>
			<td>SZ650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T3 mMESSAGE</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM1348</td>
			<td>Kit for in vitro transcription&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TIANprep Mini Plasmid Kit</td>
			<td>TIANGEN</td>
			<td>DP103-03</td>
			<td>Kit for plasmid extraction kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TIANquick Mini Purification Kit</td>
			<td>TIANGEN</td>
			<td>DP203-02</td>
			<td>Kit for purification for linearized plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E10521</td>
			<td>Used to anesthetize zebrafish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris (hydroxymethyl) aminomethane</td>
			<td>Sangon</td>
			<td>A600194-0500</td>
			<td>Component of Tris&#183;HCl used for genome extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XbaI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0145S</td>
			<td>Restriction endonuclease used for plasmid linearization</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

efficient pam-less base editing for zebrafish modeling of human genetic disease with zspry-abe8e

CRISPR/Cas9技術は、ヒト遺伝病のモデル化、疾患病因の研究、および薬物スクリーニングのためのゼブラフィッシュの価値を高めましたが、プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)の制限は、一塩基変異体(SNV)によって引き起こされるヒト遺伝性疾患の正確な動物モデルを作成する上で大きな障害となっています。これまで、幅広いPAM互換性を持ついくつかのSpCas9バリアントは、ゼブラフィッシュで効率を示してきました。最適化されたSpRY媒介アデニン塩基エディター(ABE)、zSpRY-ABE8e、および合成修飾gRNAをゼブラフィッシュに適用することで、PAMの制限なしに効率的なアデニン-グアニン塩基変換が可能になりました。ここで説明するのは、zSpRY-ABE8eを用いたゼブラフィッシュにおけるPAM制限のない効率的なアデニン塩基編集のためのプロトコルである。zSpRY-ABE8e mRNAと合成修飾gRNAの混合物をゼブラフィッシュ胚に注入することにより、TSR2リボソーム成熟因子(tsr2)の病原部位を模擬した正確な変異を有するゼブラフィッシュ病モデルを構築した。この方法は、疾患メカニズムと治療法を研究するための正確な疾患モデルを確立するための貴重なツールを提供します。

TSR2の変異は、ダイヤモンドブラックファン貧血(DBA)を引き起こすことが報告されています42。ここでは、i-Silence戦略を使用してtsr2(M1V)変異を持つDBAゼブラフィッシュモデルを構築しました。ゼブラフィッシュtsr2のスタートコドンのアデニンは、zSpRY-ABE8eを用いてグアニンへの変換に成功しました(図3)。
サンガー...

Watch this Scientific Journal Video about Efficient PAM-Less Base Editing for Zebrafish Modeling of Human Genetic Disease with zSpRY-ABE8e at JoVE.com

Efficient PAM-Less Base Editing for Zebrafish Modeling of Human Genetic Disease with zSpRY-ABE8e

このプロトコルは、zSpRY-ABE8eを使用して正確なゼブラフィッシュ病モデルを構築するために、PAMの制限なしに効率的なアデニン塩基編集を実行する方法について説明します。

zSpRY-ABE8eを用いたゼブラフィッシュヒト遺伝病モデリングのための効率的なPAMレスベース編集

CRISPR/Cas9 technology has increased the value of zebrafish for modeling human genetic diseases, studying disease pathogenesis, and drug screening, but ...

このプロトコルにより、研究者は、疾患に関連する一塩基変異体のこれまで利用できなかった多くのゼブラフィッシュモデルを構築することができます。PAMの制限は正確な動物モデルを作成する上で大きな障害であり、zSpRY-ABE8eは、低い相互変異と緩和されたPAN制限により、効率的なアデニンからグアニンへの塩基変換を可能にします。このツールは、一塩基海兵隊に関連する病原性疾患メカニズムを研究するための正確なゼブラフィッシュモデルの構築、およびこの病気の薬物スクリーニングに使用できます。まず、マイクロピペットプーラーシステムをセットアップし、少なくとも30分間予熱します。ガラスキャピラリーを引っ張るには、プログラムを選択し、ランプテスト値を熱、50を引っ張り、速度を100、時間を50、圧力を30に設定します。次に、キャピラリーチューブが溝にあることを確認します。プルスタート/ストップを押してプログラムを実行します。引っ張られた毛細血管を保存するには、針を吊り下げたまま隙間のあるフォームに挿入します。実験には、原稿に記載されているzSpRY-ABE8e mRNAを使用し、両末端を2'O-メチルホスホロチオエートで修飾したsgRNAを簡単に編集します。gRNAデザインでは、zSpRY-ABE8eはNYN PAMよりもNRN PAMに対する高い選好性を示すため、PAM配列としてNRNを優先的に選択します。 ターゲットアデニンヌクレオチドは、プロトスペーサーに沿って3番目から9番目のヌクレオチドまで高活性編集ウィンドウに入る。注射の前夜に繁殖タンクを設置します。仕切りを挿入し、各タンクに2匹のメスと1匹のオスのゼブラフィッシュを配置します。各タンクに蓋をします。翌朝、RNaseフリーのチップ、チューブ、手袋を使用して、解凍したmRNAとEEgRNAを氷上で混合し、それぞれマイクロリットルあたり400ナノグラムと200ナノグラムの最終濃度にします。空気圧マイクロインジェクターを構成するには、まず、エアポンプの分圧バルブを閉じます。次に、メインバルブを開き、ガスボンベのネジを外し、分圧バルブの圧力を0.2メガパスカルに調整します。次に、マイクロインジェクターの電源を入れ、モードをタイマーに設定します。パラメータ圧力バルブを20ポンド/平方インチに調整し、タイマー値を0.040秒に調整します。細かい鉗子を使用して、実体顕微鏡下で引っ張られたガラス毛細血管の針を角度を付けて壊します。マイクロローダーピペットチップを使用して、mRNA/gRNA混合物をガラスキャピラリーの先端に加え、針をマイクロマニピュレーターに取り付けます。マイクロキャップを使用して注入ごとに2ナノリットルの混合物を生成するように圧力とタイマーの値を構成します。魚を10〜15分間飼育した後、卵をこしで集めます。実体顕微鏡で細胞の病期と卵の質を調べます。単細胞卵を注入して編集効率を向上させます。卵を1.5%アガロース注射プレートに並べ、顕微鏡を使用して2ナノリットルのRNA混合物を胚の細胞に注入します。E3バッファーでペトリ皿に卵を集め、摂氏28度でインキュベートします。死んだ卵を取り除き、受精後48時間、12時間ごとに培養バッファーを交換します。受精後48時間後、ランダムに選択された6つの注入胚の3つのプールをPCRチューブに集めます。無作為に選択された6つの対照胚を採取したら、ピペットを使用して残留E3バッファーを吸引します。40マイクロリットルの50ミリモル水酸化ナトリウムを胚に加える。チューブを摂氏95度の金属浴に20分間置き、次に15秒間ボルテックスします。pH 8の1モル塩酸トリスを各チューブに4マイクロリットル加えます。チューブを2000gで室温で10秒間遠心分離します。上清を新しいPCRチューブに移します。PCRチューブから1マイクロリットルの上清を取り除き、サンガーシーケンシングに使用します。その後、残りの上清を摂氏20度で保管します。サンガーシーケンシングデータを解析するには、まずシーケンシングファイルをアップロードab1 Fileボックスにアップロードします。20塩基対のgRNA配列を5'〜3'方向のgRNA配列を「gRNAを入力」配列ボックスに入力します。対応するベース位置を 5'開始ボックスと 3'終了ボックスに入力します。予測編集」をクリックし、シーケンスデータの品質を確認することで、基本的な編集効率を取得します。Tsr2の開始コドンのアデニンをグアニンに変換することにより、ダイヤモンドブラックファン貧血ゼブラフィッシュモデルを構築した。配列データのEditR解析は、Tsr2開始コドンのアデニン塩基におけるAGオーバーラップを示した。2日齢のTsr2胚の表現型は、対照胚と比較してより小さな目を示した。突然変異胚にも心膜の腫れが観察された。効率的なベース編集を実現するためには、実験を成功させるための前提条件である前述のガイドライン設計原則に厳密に従ってください。正確なモデルは、一塩基変異関連疾患の研究に不可欠です。SprY-ABE8eの開発は、正確なモデリングのための効果的なツールを提供し、疾患メカニズムと治療法の研究を促進するのに役立ちます。

Research

JoVE Journal

Biology

An Allele-specific Gene Expression Assay to Test the Functional Basis of Genetic Associations

遺伝的関連の機能的基準をテストするための対立遺伝子特異的遺伝子発現アッセイ

The number of significant genetic associations with common complex traits is constantly increasing. However, most of these associations have not been ...

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

小分子の誘導と多能性ヒト胚性幹細胞からヒト心筋前駆体と心筋細胞の効率的な導出

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

内脂肪量の生化学的および高スループット微視的評価<em&gt;線虫（Caenorhabditis elegans）</em

The nematode C. elegans has emerged as an important  model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as  it relates to human ...

In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio

In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio

ゼブラフィッシュを用いた病的ヒトゲノムの in vivoモデルで

Here,  we present methods for the development of assays to query potentially clinically  significant nonsynonymous changes using in  vivo complementation ...

Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells

ヒト心筋細胞の生成：フィーダーフリーヒト人工多能性幹細胞からの分化プロトコル

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is ...

Efficient Agroinfiltration of Plants for High-level Transient Expression of Recombinant Proteins

組換えタンパク質の高レベルの一過性発現のための植物の効率的なアグロ

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing ...

Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis

高解像度メルト解析を用いたPCRを使用して、迅速かつ効率的なゼブラフィッシュ遺伝子型決定

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic ...

Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies

生物物理学研究のための昆虫細胞からの効率的な生産と組換えマウスKindlin-3の精製

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

仙台ウイルスのヒト体細胞からの効率的な次世代ヒューマン誘導多能性幹細胞

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

Genetic Barcoding with Fluorescent Proteins for Multiplexed Applications

多重化アプリケーションのための蛍光タンパク質との遺伝バーコーディング

Fluorescent proteins, fluorescent dyes and fluorophores in general have revolutionized the field of molecular cell biology. In particular, the discovery ...