Name: efficient pam-less base editing for zebrafish modeling of human genetic disease with zspry-abe8e
Uploaded: 2023-02-17T13:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Efficient PAM-Less Base Editing for Zebrafish Modeling of Human Genetic Disease with zSpRY-ABE8e at JoVE.com

이 원고 초안의 영어 텍스트를 편집해 주신 Liwen Bianji(Edanz)의 Barbara Garbers 박사에게 감사드립니다. 이 작업은 광둥성 핵심 지역 연구 개발 프로그램(2019B030335001), 중국 국가 핵심 R&D 프로그램(2019YFE0106700), 중국 국립 자연 과학 재단(32070819, 31970782), 광둥성 수생 경제 동물을 위한 병원성 생물학 및 역학 핵심 연구소의 연구 기금 프로그램(PBEA2020YB05).

본 연구는 화남사범대학 관리이용위원회의 지침을 엄격히 준수하여 수행되었다.
1. 합성 변형 gRNA 및 zSpRY-ABE8e mRNA 제조
<ol><li>이전 간행물37,38에 따라 gRNA를 설계합니다.<ol><li>zSpRY-ABE8e가 NYN PAM보다 NRN PAM에 대해 더 높은 선호도를 나타내므로(여기서, R은 A 또는 G이고, Y는 C 또는 T임)18, PAM 서열로서 NRN?...

<ol>
	<li>Eichler, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Completing+the+map+of+human+genetic+variation.">Completing the map of human genetic variation.</a> Nature. 447 (7141), 161-165 (2007).</li><li>Koukouli, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotine+reverses+hypofrontality+in+animal+models+of+addiction+and+schizophrenia.">Nicotine reverses hypofrontality in animal models of addiction and schizophrenia.</a> Nature Medicine. 23 (3), 347-354 (2017).</li><li>Kalueff, A. V., Stewart, A. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytosine+and+adenine+base+editing+of+the+brain,+liver,+retina,+heart+and+skeletal+muscle+of+mice+via+adeno-associated+viruses.">Cytosine and adenine base editing of the brain, liver, retina, heart and skeletal muscle of mice via adeno-associated viruses.</a> Nature Biomedical Engineering. 4 (1), 97-110 (2020).</li><li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+generation+of+mouse+models+of+human+diseases+via+ABE-+and+BE-mediated+base+editing.">Efficient generation of mouse models of human diseases via ABE- and BE-mediated base editing.</a> Nature Communications. 9, 2338 (2018).</li><li>Landrum, M. 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N., Sood, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BE4max+and+AncBE4max+are+efficient+in+germline+conversion+of+C:G+to+T:A+base+pairs+in+zebrafish.">BE4max and AncBE4max are efficient in germline conversion of C:G to T:A base pairs in zebrafish.</a> Cells. 9 (7), 1690 (2020).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmable+base+editing+of+zebrafish+genome+using+a+modified+CRISPR-Cas9+system.">Programmable base editing of zebrafish genome using a modified CRISPR-Cas9 system.</a> Nature Communications. 8, 118 (2017).</li><li>Rosello, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precise+base+editing+for+the+in+vivo+study+of+developmental+signaling+and+human+pathologies+in+zebrafish.">Precise base editing for the in vivo study of developmental signaling and human pathologies in zebrafish.</a> eLife. 10, 65552 (2021).</li><li>Liang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SpG+and+SpRY+variants+expand+the+CRISPR+toolbox+for+genome+editing+in+zebrafish.">SpG and SpRY variants expand the CRISPR toolbox for genome editing in zebrafish.</a> Nature Communications. 13, 3421 (2022).</li><li>Qin, W., Lu, X., Lin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmable+base+editing+in+zebrafish+using+a+modified+CRISPR-Cas9+system.">Programmable base editing in zebrafish using a modified CRISPR-Cas9 system.</a> Methods. 150, 19-23 (2018).</li><li>Feng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+CRISPR/Cas9+genome+editing+capacity+in+zebrafish+using+SaCas9.">Expanding CRISPR/Cas9 genome editing capacity in zebrafish using SaCas9.</a> G3. 6 (8), 2517-2521 (2016).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing+in+zebrafish+by+ScCas9+recognizing+NNG+PAM.">Genome editing in zebrafish by ScCas9 recognizing NNG PAM.</a> Cells. 10 (8), 2099 (2021).</li><li>Kleinstiver, B. 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K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+the+CRISPR+toolbox+in+zebrafish+for+studying+development+and+disease.">Expanding the CRISPR toolbox in zebrafish for studying development and disease.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 13 (2019).</li><li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity.">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li><li>Hu, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolved+Cas9+variants+with+broad+PAM+compatibility+and+high+DNA+specificity.">Evolved Cas9 variants with broad PAM compatibility and high DNA specificity.</a> Nature. 556 (7699), 57-63 (2018).</li><li>Nishimasu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+CRISPR-Cas9+nuclease+with+expanded+targeting+space.">Engineered CRISPR-Cas9 nuclease with expanded targeting space.</a> Science. 361 (6408), 1259-1262 (2018).</li><li>Endo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing+in+plants+by+engineered+CRISPR-Cas9+recognizing+NG+PAM.">Genome editing in plants by engineered CRISPR-Cas9 recognizing NG PAM.</a> Nature Plants. 5, 14-17 (2019).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+genome+editing+using+xCas9+with+expanded+PAM+compatibility.">Plant genome editing using xCas9 with expanded PAM compatibility.</a> Journal of Genetics and Genomics. 46 (5), 277-280 (2019).</li><li>Ren, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PAM-less+plant+genome+editing+using+a+CRISPR-SpRY+toolbox.">PAM-less plant genome editing using a CRISPR-SpRY toolbox.</a> Nature Plants. 7, 25-33 (2021).</li><li>Xu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SpRY+greatly+expands+the+genome+editing+scope+in+rice+with+highly+flexible+PAM+recognition.">SpRY greatly expands the genome editing scope in rice with highly flexible PAM recognition.</a> Genome Biology. 22 (1), 6 (2021).</li><li>Walton, R. 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E., Doench, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+analysis+of+CRISPR-Cas+experiments.">Design and analysis of CRISPR-Cas experiments.</a> Nature Biotechnology. 38 (7), 813-823 (2020).</li><li>Doench, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+sgRNA+design+to+maximize+activity+and+minimize+off-target+effects+of+CRISPR-Cas9.">Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9.</a> Nature Biotechnology. 34 (2), 184-191 (2016).</li><li>Kossack, M. E., Draper, B. 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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+RNA-guided+genome+editing+in+human+cells+via+delivery+of+purified+Cas9+ribonucleoproteins.">Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins.</a> Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).</li><li>Ramakrishna, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+disruption+by+cell-penetrating+peptide-mediated+delivery+of+Cas9+protein+and+guide+RNA.">Gene disruption by cell-penetrating peptide-mediated delivery of Cas9 protein and guide RNA.</a> Genome Research. 24 (6), 1020-1027 (2014).</li><li>Fu, Y., Reyon, D., Joung, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+genome+editing+in+human+cells+using+CRISPR/Cas+nucleases+and+truncated+guide+RNAs.">Targeted genome editing in human cells using CRISPR/Cas nucleases and truncated guide RNAs.</a> Methods in Enzymology. 546, 21-45 (2014).</li></ol>

이 프로토콜은 기본 편집기 zSpRY-ABE8e를 사용하여 제브라피쉬 질병 모델을 구성하는 방법을 설명합니다. 염기 치환을 위한 기존 HDR 경로와 비교할 때 이 프로토콜은 보다 효율적인 염기 편집을 달성하고 인델 발생을 줄일 수 있습니다. 동시에, 이 프로토콜은 제브라피쉬에서 최근에 제안된 i-Silence 유전자 녹아웃 전략을 구현하는 것을 포함합니다. 종합하면, zSpRY-ABE8e는 질병 연구에서 제브라피쉬 ?...

미스센스 또는 넌센스 돌연변이를 유발하는 단일 뉴클레오티드 변이체(SNV)는 인간 게놈1에서 가장 흔한 돌연변이 원인입니다. 특정 SNV가 병원성인지 여부를 확인하고 발병기전을 밝히기 위해서는 정확한 동물모델이 필요하다2. 제브라피쉬는 인간과 높은 수준의 생리적, 유전적 상동성, 짧은 발달 주기, 강력한 생식 능력을 나타내는 우수한 인간 질병 모델로, 병원성 특성 및 메커니즘에 대한 연구와 약물 스크리닝에 유리합니다3.
CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas9 시스템은 제브라피시4를 포함한 다양한 종의 게놈 편집에 널리 적용되었습니다. gRNA 유도를 통해 CRISPR/Cas9 시스템은 표적 부위에서 DNA 이중 가닥 절단(DSB)을 생성할 수 있으며, 이는 상동성 지향 복구(HDR) 경로를 통해 표적 부위와 기증자 DNA 템플릿의 재조합을 통해 단일 염기 치환을 가능하게 합니다. 그러나, 이 염기 치환 방법의 효율은 매우 낮은데, 이는 세포 DNA 복구 과정이 주로 삽입 및 결실(indel) 돌연변이를 동반하는 비상동 말단 결합(non-homologous end-joining, NHEJ) 경로에 의해 수행되기 때문이다5. 다행스럽게도 CRISPR/Cas9 기반 단일 염기 편집 기술은 DSB를 유도하지 않고도 보다 효율적인 단일 염기 편집이 가능한 염기 편집기를 사용하여 이 문제를 크게 완화합니다. 염기 편집기의 두 가지 주요 클래스인 아데닌 염기 편집자(ABE)와 시토신 염기 편집자(CBE)는 A· T에서 G· C와 C·G에서 T· A는 각각 6,7,8,9,10,11이다. 이 4가지 유형의 염기 치환은 인간 병원성 변이체의 30%를 차지한다12. PmCDA1, BE 시스템, CBE4max, ABE7.10 및 ABE8e를 포함한 두 종류의 기본 편집기는 제브라피쉬에서 작동하는 것으로 보고되었으며, 특히 BE4max 및 ABE8e는 높은 편집 활동 13,14,15,16,17,18,19를 달성하는 것으로 보고되었습니다.
황색포도상구균(Staphylococcus aureus), 화농성 연쇄상구균(Streptococcus pyogenes), 큰개자리 개(S. canis)를 포함한 다양한 종의 Cas9 단백질이 제브라피쉬 유전자 편집에 구현되었으며, Streptococcus pyogenes Cas9(SpCas9)가 가장 널리 사용되고 있습니다 20,21,22,23. 그러나, SpCas9는 NGG 프로토스페이서 인접 모티프(PAM)가 있는 표적 부위만 인식할 수 있으며, 이는 편집 가능한 범위를 제한하고 병원성 관심 부위 근처에서 적절한 서열을 발견하지 못하게 할 수 있다24. 목표 범위를 확장하기 위해 다양한 SpCas9 변형이 유도 진화 및 구조 유도 설계를 통해 다양한 PAM을 인식하도록 설계되었습니다. 그러나 동물, 특히 제브라피쉬에서 효과적인 변종은 거의 없으며, 이는 SNV 관련 질병 연구에서 제브라피쉬의 적용을 제한합니다25,26,27,28. 최근에, 덜 엄격한 PAM 제한(NYN보다 NRN에 대한 선호도가 더 높은 SpG에 대한 NGN 및 SpRY에 대한 NNN)을 갖는 SpCas9, SpG 및 SpRY의 두 가지 변이체가 인간 세포 및 식물에서 높은 편집 활성을 나타내는 것으로 보고되었습니다 29,30,31,32. 그 후, SpG 및 SpRY뿐만 아니라 SpRY 매개 CBE 및 SpRY 매개 ABE와 같은 다수의 중재 기본 편집기도 제브라피쉬에서 작동하는 것으로 보고되었으며, 이는 SNV 관련 질병의 기계론적 연구 및 약물 스크리닝에서 제브라피쉬 모델의 적용을 향상시킬 것입니다 18,33,34,35. 또한, i-Silence는 ATG에서 GTG 또는 ACG36으로의 ABE 매개 시작 코돈 전환을 통해 효과적이고 정확한 유전자 녹아웃 전략으로 제안되었습니다. i-Silence 전략과 SpRY 매개 베이스 편집기 zSpRY-ABE8e의 조합은 질병 모델링을 위한 새로운 방법을 제공한다(18). 이 프로토콜은 제브라피쉬에서 zSpRY-ABE8e를 사용하여 유전자 편집을 수행하여 i-Silence 전략을 사용하여 tsr2(M1V) 모델을 구성하는 방법을 보여줍니다. 제브라피쉬 모델에 나타나는 편집 효율성과 표현형을 평가하고 분석했습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9539</td>
			<td>1.5% Agarose used to make an injection plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Glass Capillaries&#160;</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>BS4 30-0016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture dishes&#160;</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit</td>
			<td>Vazyme</td>
			<td>C115</td>
			<td>Kit for Infusion clone&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Codon optimization service</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drummond Microcaps</td>
			<td>Drummond Microcaps</td>
			<td>P1299-1PAK</td>
			<td>Length:32 mm, capacity:0.5 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasyEdit gRNA service</td>
			<td>GenScript</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Forceps</td>
			<td>Fine Scientific Instrument</td>
			<td>11254-20</td>
			<td>Used to break meedle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flaming/Brown Micropipette Puller&#160;</td>
			<td>Stutter Instrument</td>
			<td>P-97</td>
			<td>Used to pull the glass capillaries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HotStart Taq PCR StarMix</td>
			<td>Genstar</td>
			<td>A033-101</td>
			<td>Used for PCR reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intelligent artificial climate box</td>
			<td>TENLIN</td>
			<td>PRX-1000A</td>
			<td>Used to culture zebrafish embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylcellulose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M0512</td>
			<td>Used to fix zebrafish when photographing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microloader pipette tips&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5242956003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mMACHINE kit&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mut Express II Fast Mutagenesis Kit V2</td>
			<td>Vazyme</td>
			<td>C214-01</td>
			<td>Kit for site-directed mutagenesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pneumatic Microinjector</td>
			<td>ZGene Biotech</td>
			<td>ZGPCP-1500 PLUS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pT3TS-zSpCas9</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>46757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy FFPE kit&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>73504</td>
			<td>Kit for RNA purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sanger Sequencing service</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide, granular</td>
			<td>Sangon</td>
			<td>A100173-0500</td>
			<td>NaOH used for genome extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Microscope</td>
			<td>Olympus&#160;</td>
			<td>SZX10</td>
			<td>Used for photograph of phenotype</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SZ Series Zoom Stereo Microscope</td>
			<td>CNOPTEC</td>
			<td>SZ650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T3 mMESSAGE</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM1348</td>
			<td>Kit for in vitro transcription&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TIANprep Mini Plasmid Kit</td>
			<td>TIANGEN</td>
			<td>DP103-03</td>
			<td>Kit for plasmid extraction kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TIANquick Mini Purification Kit</td>
			<td>TIANGEN</td>
			<td>DP203-02</td>
			<td>Kit for purification for linearized plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E10521</td>
			<td>Used to anesthetize zebrafish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris (hydroxymethyl) aminomethane</td>
			<td>Sangon</td>
			<td>A600194-0500</td>
			<td>Component of Tris&#183;HCl used for genome extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XbaI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0145S</td>
			<td>Restriction endonuclease used for plasmid linearization</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

efficient pam-less base editing for zebrafish modeling of human genetic disease with zspry-abe8e

CRISPR/Cas9 기술은 인간 유전 질환 모델링, 질병 발병기전 연구 및 약물 스크리닝을 위한 제브라피쉬의 가치를 높였지만, 단일 뉴클레오티드 변이체(SNV)로 인한 인간 유전 질환의 정확한 동물 모델을 만드는 데 있어 프로토스페이서 인접 모티프(PAM)의 한계가 주요 장애물입니다. 지금까지 광범위한 PAM 호환성을 가진 일부 SpCas9 변종은 제브라피쉬에서 효율성을 보여주었습니다. 최적화된 SpRY 매개 아데닌 염기 편집기(ABE), zSpRY-ABE8e 및 합성 변형 gRNA를 제브라피쉬에 적용하면 PAM 제한 없이 효율적인 아데닌-구아닌 염기 전환이 가능해졌습니다. 여기에 설명된 프로토콜은 zSpRY-ABE8e를 사용하여 제브라피쉬에서 PAM 제한 없이 효율적인 아데닌 염기 편집을 위한 프로토콜입니다. zSpRY-ABE8e mRNA와 합성 변형 gRNA의 혼합물을 제브라피쉬 배아에 주입하여 TSR2 리보솜 성숙 인자(tsr2)의 병원성 부위를 시뮬레이션하는 정확한 돌연변이로 제브라피쉬 질병 모델을 구성했습니다. 이 방법은 질병 메커니즘 및 치료법을 연구하기 위한 정확한 질병 모델을 확립하는 데 유용한 도구를 제공합니다.

TSR2의 돌연변이는 다이아몬드 블랙팬 빈혈(DBA)을 유발하는 것으로 보고되었습니다42. 여기에서 DBA 제브라피쉬 모델은 i-Silence 전략을 사용하여 tsr2(M1V) 돌연변이로 구성되었습니다. 제브라피쉬 tsr2의 시작 코돈의 아데닌은 zSpRY-ABE8e를 사용하여 성공적으로 구아닌으로 전환되었습니다(그림 3).
Sanger 염기서열 분석 결?...

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Efficient PAM-Less Base Editing for Zebrafish Modeling of Human Genetic Disease with zSpRY-ABE8e

이 프로토콜은 zSpRY-ABE8e를 사용하여 정확한 제브라피쉬 질병 모델을 구성하기 위해 PAM 제한 없이 효율적인 아데닌 염기 편집을 수행하는 방법을 설명합니다.

zSpRY-ABE8e를 사용한 인간 유전 질환의 Zebrafish 모델링을 위한 효율적인 PAM 없는 염기 편집

CRISPR/Cas9 technology has increased the value of zebrafish for modeling human genetic diseases, studying disease pathogenesis, and drug screening, but ...

이 프로토콜을 통해 연구자들은 질병 관련 단일 뉴클레오티드 변이체에 대해 이전에는 사용할 수 없었던 여러 제브라피쉬 모델을 구축할 수 있습니다. PAM 제한은 정확한 동물 모델을 만드는 데 주요 장애물이며, zSpRY-ABE8e는 낮은 순열과 완화된 PAN 제한으로 효율적인 아데닌 염기 전환을 가능하게 합니다. 이 도구는 단일 뉴클레오티드 마린과 관련된 병원성 특성 질병 메커니즘을 연구하기 위한 정확한 제브라피쉬 모델을 구성하고 이 질병에 대한 약물 스크리닝을 수행하는 데 사용할 수 있습니다.시작하려면 마이크로피펫 풀러 시스템을 설정하고 최소 30분 동안 예열하십시오. 유리 모세관을 당기려면 프로그램을 선택하고 r을 설정하십시오.amp 테스트 값을 열로, 50을 당김으로, 속도를 100으로, 시간을 50으로, 압력을 30으로 설정합니다. 그런 다음 모세관이 홈에 있는지 확인합니다.pull start/stop"을 눌러 프로그램을 실행합니다. 당겨진 모세관을 보존하려면 바늘을 매달아 놓은 틈이 있는 폼에 삽입하십시오. 실험을 위해 원고에 설명된 zSpRY-ABE8e mRNA를 사용하고 양쪽 끝에서 2'O-메틸 포스포로티오에이트로 변형된 sgRNA를 쉽게 편집할 수 있습니다.gRNA 설계의 경우, zSpRY-ABE8e가 NYN PAM보다 NRN PAM에 대해 더 높은 선호도를 나타내므로 NRN을 PAM 서열로 우선적으로 선택합니다. 타겟 아데닌 뉴클레오티드는 프로토스페이서를 따라 세 번째부터 아홉 번째 뉴클레오티드까지 고활성 편집 창에 들어간다. 주사 전날 밤에 번식 탱크를 설치하십시오.칸막이를 삽입하고 각 탱크에 암컷 제브라 피쉬 2 마리와 수컷 제브라 피쉬 1 마리를 놓습니다. 각 탱크 위에 뚜껑을 덮습니다. 다음날 아침, RNase가 없는 팁, 튜브 및 장갑을 사용하여 해동된 mRNA와 EEgRNA를 얼음 위에서 각각 마이크로리터당 400 및 200 나노그램의 최종 농도로 혼합합니다.공압 마이크로 인젝터를 구성하려면 먼저 공기 펌프의 분압 밸브를 닫습니다. 그런 다음 메인 밸브를 열고 가스 실린더의 나사를 풀고 분압 밸브의 압력을 0.2메가파스칼로 조정합니다. 이제 마이크로 인젝터를 켜고 모드를 타이머로 설정합니다.매개변수 압력 밸브를 제곱인치당 20파운드로 조정하고 타이머 값을 0.040초로 조정합니다. 미세 집게를 사용하여 실체 현미경으로 당겨진 유리 모세관의 바늘을 각도로 부러뜨립니다. 마이크로로더 피펫 팁을 사용하여 mRNA/gRNA 혼합물을 유리 모세관 끝에 추가하고 바늘을 미세 매니퓰레이터에 부착합니다.마이크로캡을 사용하여 주입당 2나노리터 혼합물을 생성하도록 압력 및 타이머 값을 구성합니다. 10-15 분 동안 물고기를 사육 한 후 여과기에 알을 모으십시오. 실체 현미경으로 세포 단계와 난자의 질을 검사합니다.편집 효율성을 높이기 위해 주입용 단세포 계란을 선택하십시오. 1.5% 아가로스 주입 플레이트에 난자를 정렬하고 현미경을 사용하여 2나노리터의 RNA 혼합물을 배아 세포에 주입합니다. E3 버퍼가 있는 페트리 접시에 계란을 모아 섭씨 28도에서 배양합니다.죽은 난자를 제거하고 수정 후 48시간 동안 12시간마다 배양 완충액을 교체합니다. 수정 후 48시간 후, 무작위로 선택된 6개의 주입된 배아로 구성된 3개의 풀을 PCR 튜브에 수집합니다. 무작위로 선택된 6개의 대조군 배아가 수집되면 피펫을 사용하여 잔류 E3 완충액을 흡인합니다.배아에 40 밀리 몰의 수산화 나트륨 50 마이크로 리터를 첨가하십시오. 튜브를 섭씨 95도의 금속 욕조에 20분 동안 넣은 다음 15초 동안 소용돌이칩니다. pH 8에서 1몰 트리스 염산염 4마이크로리터를 각 튜브에 추가합니다.튜브를 2000g에서 실온에서 10초 동안 원심분리합니다. 상층액을 새 PCR 튜브로 옮깁니다. PCR 튜브에서 1마이크로리터의 상층액을 제거하고 Sanger 염기서열 분석에 사용합니다.그런 다음 남은 상청액을 섭씨 20도에서 보관하십시오. Sanger 염기서열 분석 데이터를 분석하려면 먼저 염기서열 분석 파일을 ab1 파일 업로드 상자에 업로드합니다. 20개의 염기쌍 gRNA 염기서열을 5'에서 3' 방향으로 gRNA 염기서열 입력 상자에 입력합니다.5' 시작 및 3' 끝 상자에 해당 베이스 위치를 입력합니다. 예측 편집"을 클릭하고 시퀀싱 데이터의 품질을 확인하여 기본 편집 효율성을 얻으십시오. 다이아몬드 블랙팬 빈혈 제브라피쉬 모델은 Tsr2의 시작 코돈의 아데닌을 구아닌으로 전환하여 구성되었습니다.서열 데이터의 EditR 분석은 Tsr2 시작 코돈의 아데닌 염기에서 AG 중첩을 입증했습니다. 생후 2일 된 Tsr2 배아의 표현형은 대조군 배아에 비해 눈이 더 작은 것으로 나타났습니다. 부어오른 심낭도 돌연변이 배아에서 관찰되었습니다.효율적인 기본 편집을 위해서는 실험의 성공을 위한 전제 조건인 앞서 언급한 지침 설계 원칙을 엄격히 준수하십시오. 정확한 모델은 단일 뉴클레오티드 변이체 관련 질병 연구에 필수적입니다. SprY-ABE8e의 개발은 정확한 모델링을 위한 효과적인 도구를 제공하여 질병 메커니즘 및 치료법 연구를 촉진하는 데 도움이 됩니다.

Research

JoVE Journal

Biology

An Allele-specific Gene Expression Assay to Test the Functional Basis of Genetic Associations

유전자 협회의 기능 기초를 테스트하는 Allele 특정 유전자 발현 분석

The number of significant genetic associations with common complex traits is constantly increasing. However, most of these associations have not been ...

연구

생물학

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

작은 분자와 유도 Pluripotent 인간 배아 줄기 세포로부터 인간 심장 엽 성의 전구 물질과 Cardiomyocytes의 효율 유도

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

에서 지방 질량의 생화학 및 높은 처리량 미세 평가<em&gt; Caenorhabditis Elegans</em

The nematode C. elegans has emerged as an important  model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as  it relates to human ...

In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio

In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio

Danio rerio를 사용하여 병적 인 인간 게놈의 생체 모델링에

Here,  we present methods for the development of assays to query potentially clinically  significant nonsynonymous changes using in  vivo complementation ...

Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells

인간의 Cardiomyocytes의 생성 : 피더없는 인간 유도 만능 줄기 세포에서 분화 프로토콜

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is ...

Efficient Agroinfiltration of Plants for High-level Transient Expression of Recombinant Proteins

재조합 단백질의 높은 수준의 과도 발현 식물의 효율적인 Agroinfiltration

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing ...

Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis

고해상도 용융 분석과 PCR을 이용하여 신속하고 효율적인 Zebrafish의 유전자형

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic ...

Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies

의 효율적인 생산 및 정제 재조합 쥐과 Kindlin-3 생물 물리학 연구 곤충 세포에서

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

센다이 바이러스와 인간의 체세포의 효율적인 생성 인간 유도 만능 줄기 세포

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

Genetic Barcoding with Fluorescent Proteins for Multiplexed Applications

멀티 플렉스 애플리케이션을위한 형광 단백질 유전자 바코드

Fluorescent proteins, fluorescent dyes and fluorophores in general have revolutionized the field of molecular cell biology. In particular, the discovery ...