Name: efficient pam-less base editing for zebrafish modeling of human genetic disease with zspry-abe8e
Uploaded: 2023-02-17T13:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Efficient PAM-Less Base Editing for Zebrafish Modeling of Human Genetic Disease with zSpRY-ABE8e at JoVE.com

Vi takker Barbara Garbers, PhD, fra Liwen Bianji (Edanz) for å redigere den engelske teksten til et utkast til dette manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av Key-Area Research and Development Program of Guangdong Province (2019B030335001), National Key R &D Program of China (2019YFE0106700), National Natural Science Foundation of China (32070819, 31970782), og Research Fund Program of Guangdong Provincial Key Lab of Pathogenic Biology and Epidemiology for Aquatic Economic Animals (PBEA2020YB05).

Denne studien ble utført i strengt samsvar med retningslinjene fra Care and Use Committee ved South China Normal University.
1. Klargjøring av syntetisk modifisert gRNA og zSpRY-ABE8e mRNA
<ol><li>Design gRNA i henhold til tidligere publikasjoner37,38.<ol><li>Velg fortrinnsvis NRN som PAM-sekvens, da zSpRY-ABE8e viser en høyere preferanse for NRN PAM enn NYN PAM (der R er A eller G, og Y er C eller T)<sup class="x...

<ol>
	<li>Eichler, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Completing+the+map+of+human+genetic+variation.">Completing the map of human genetic variation.</a> Nature. 447 (7141), 161-165 (2007).</li><li>Koukouli, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotine+reverses+hypofrontality+in+animal+models+of+addiction+and+schizophrenia.">Nicotine reverses hypofrontality in animal models of addiction and schizophrenia.</a> Nature Medicine. 23 (3), 347-354 (2017).</li><li>Kalueff, A. V., Stewart, A. M., Gerlai, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+an+emerging+model+for+studying+complex+brain+disorders.">Zebrafish as an emerging model for studying complex brain disorders.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 35 (2), 63-75 (2014).</li><li>Anzalone, A. V., Koblan, L. W., Liu, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing+with+CRISPR-Cas+nucleases,+base+editors,+transposases+and+prime+editors.">Genome editing with CRISPR-Cas nucleases, base editors, transposases and prime editors.</a> Nature Biotechnology. 38 (7), 824-844 (2020).</li><li>Sander, J. D., Joung, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas+systems+for+editing,+regulating+and+targeting+genomes.">CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes.</a> Nature Biotechnology. 32 (4), 347-355 (2014).</li><li>Komor, A. C., Kim, Y. B., Packer, M. S., Zuris, J. A., Liu, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmable+editing+of+a+target+base+in+genomic+DNA+without+double-stranded+DNA+cleavage.">Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage.</a> Nature. 533 (7603), 420-424 (2016).</li><li>Nishida, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+nucleotide+editing+using+hybrid+prokaryotic+and+vertebrate+adaptive+immune+systems.">Targeted nucleotide editing using hybrid prokaryotic and vertebrate adaptive immune systems.</a> Science. 353 (6305), (2016).</li><li>Gaudelli, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+adenine+base+editors+with+increased+activity+and+therapeutic+application.">Directed evolution of adenine base editors with increased activity and therapeutic application.</a> Nature Biotechnology. 38 (7), 892-900 (2020).</li><li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+RNA-guided+base+editing+in+rabbit.">Highly efficient RNA-guided base editing in rabbit.</a> Nature Communications. 9, 2717 (2018).</li><li>Levy, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytosine+and+adenine+base+editing+of+the+brain,+liver,+retina,+heart+and+skeletal+muscle+of+mice+via+adeno-associated+viruses.">Cytosine and adenine base editing of the brain, liver, retina, heart and skeletal muscle of mice via adeno-associated viruses.</a> Nature Biomedical Engineering. 4 (1), 97-110 (2020).</li><li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+generation+of+mouse+models+of+human+diseases+via+ABE-+and+BE-mediated+base+editing.">Efficient generation of mouse models of human diseases via ABE- and BE-mediated base editing.</a> Nature Communications. 9, 2338 (2018).</li><li>Landrum, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ClinVar:+Public+archive+of+interpretations+of+clinically+relevant+variants.">ClinVar: Public archive of interpretations of clinically relevant variants.</a> Nucleic Acids Research. 44, 862-868 (2016).</li><li>Qin, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precise+A&#8226;T+to+G&#8226;C+base+editing+in+the+zebrafish+genome.">Precise A&#8226;T to G&#8226;C base editing in the zebrafish genome.</a> BMC Biology. 16 (1), 139 (2018).</li><li>Tanaka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+targeted+single-nucleotide+editing+in+zebrafish.">In vivo targeted single-nucleotide editing in zebrafish.</a> Scientific Reports. 8, 11423 (2018).</li><li>Carrington, B., Weinstein, R. N., Sood, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BE4max+and+AncBE4max+are+efficient+in+germline+conversion+of+C:G+to+T:A+base+pairs+in+zebrafish.">BE4max and AncBE4max are efficient in germline conversion of C:G to T:A base pairs in zebrafish.</a> Cells. 9 (7), 1690 (2020).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmable+base+editing+of+zebrafish+genome+using+a+modified+CRISPR-Cas9+system.">Programmable base editing of zebrafish genome using a modified CRISPR-Cas9 system.</a> Nature Communications. 8, 118 (2017).</li><li>Rosello, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precise+base+editing+for+the+in+vivo+study+of+developmental+signaling+and+human+pathologies+in+zebrafish.">Precise base editing for the in vivo study of developmental signaling and human pathologies in zebrafish.</a> eLife. 10, 65552 (2021).</li><li>Liang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SpG+and+SpRY+variants+expand+the+CRISPR+toolbox+for+genome+editing+in+zebrafish.">SpG and SpRY variants expand the CRISPR toolbox for genome editing in zebrafish.</a> Nature Communications. 13, 3421 (2022).</li><li>Qin, W., Lu, X., Lin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmable+base+editing+in+zebrafish+using+a+modified+CRISPR-Cas9+system.">Programmable base editing in zebrafish using a modified CRISPR-Cas9 system.</a> Methods. 150, 19-23 (2018).</li><li>Feng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+CRISPR/Cas9+genome+editing+capacity+in+zebrafish+using+SaCas9.">Expanding CRISPR/Cas9 genome editing capacity in zebrafish using SaCas9.</a> G3. 6 (8), 2517-2521 (2016).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing+in+zebrafish+by+ScCas9+recognizing+NNG+PAM.">Genome editing in zebrafish by ScCas9 recognizing NNG PAM.</a> Cells. 10 (8), 2099 (2021).</li><li>Kleinstiver, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+CRISPR-Cas9+nucleases+with+altered+PAM+specificities.">Engineered CRISPR-Cas9 nucleases with altered PAM specificities.</a> Nature. 523 (7561), 481-485 (2015).</li><li>Liu, K., Petree, C., Requena, T., Varshney, P., Varshney, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+the+CRISPR+toolbox+in+zebrafish+for+studying+development+and+disease.">Expanding the CRISPR toolbox in zebrafish for studying development and disease.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 13 (2019).</li><li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity.">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li><li>Hu, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolved+Cas9+variants+with+broad+PAM+compatibility+and+high+DNA+specificity.">Evolved Cas9 variants with broad PAM compatibility and high DNA specificity.</a> Nature. 556 (7699), 57-63 (2018).</li><li>Nishimasu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+CRISPR-Cas9+nuclease+with+expanded+targeting+space.">Engineered CRISPR-Cas9 nuclease with expanded targeting space.</a> Science. 361 (6408), 1259-1262 (2018).</li><li>Endo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing+in+plants+by+engineered+CRISPR-Cas9+recognizing+NG+PAM.">Genome editing in plants by engineered CRISPR-Cas9 recognizing NG PAM.</a> Nature Plants. 5, 14-17 (2019).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+genome+editing+using+xCas9+with+expanded+PAM+compatibility.">Plant genome editing using xCas9 with expanded PAM compatibility.</a> Journal of Genetics and Genomics. 46 (5), 277-280 (2019).</li><li>Ren, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PAM-less+plant+genome+editing+using+a+CRISPR-SpRY+toolbox.">PAM-less plant genome editing using a CRISPR-SpRY toolbox.</a> Nature Plants. 7, 25-33 (2021).</li><li>Xu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SpRY+greatly+expands+the+genome+editing+scope+in+rice+with+highly+flexible+PAM+recognition.">SpRY greatly expands the genome editing scope in rice with highly flexible PAM recognition.</a> Genome Biology. 22 (1), 6 (2021).</li><li>Walton, R. T., Christie, K. A., Whittaker, M. N., Kleinstiver, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unconstrained+genome+targeting+with+near-PAMless+engineered+CRISPR-Cas9+variants.">Unconstrained genome targeting with near-PAMless engineered CRISPR-Cas9 variants.</a> Science. 368 (6488), 290-296 (2020).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing+mediated+by+SpCas9+variants+with+broad+non-canonical+PAM+compatibility+in+plants.">Genome editing mediated by SpCas9 variants with broad non-canonical PAM compatibility in plants.</a> Molecular Plant. 14 (2), 352-360 (2021).</li><li>Vicencio, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing+in+animals+with+minimal+PAM+CRISPR-Cas9+enzymes.">Genome editing in animals with minimal PAM CRISPR-Cas9 enzymes.</a> Nature Communications. 13, 2601 (2022).</li><li>Rosello, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease+modeling+by+efficient+genome+editing+using+a+near+PAM-less+base+editor+in+vivo.">Disease modeling by efficient genome editing using a near PAM-less base editor in vivo.</a> Nature Communications. 13, 3435 (2022).</li><li>Cornean, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precise+in+vivo+functional+analysis+of+DNA+variants+with+base+editing+using+ACEofBASEs+target+prediction.">Precise in vivo functional analysis of DNA variants with base editing using ACEofBASEs target prediction.</a> eLife. 11, 72124 (2022).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+silencing+by+adenine+base+editor-mediated+start+codon+mutation.">Efficient gene silencing by adenine base editor-mediated start codon mutation.</a> Molecular Therapy. 28 (2), 431-440 (2020).</li><li>Hanna, R. E., Doench, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+analysis+of+CRISPR-Cas+experiments.">Design and analysis of CRISPR-Cas experiments.</a> Nature Biotechnology. 38 (7), 813-823 (2020).</li><li>Doench, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+sgRNA+design+to+maximize+activity+and+minimize+off-target+effects+of+CRISPR-Cas9.">Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9.</a> Nature Biotechnology. 34 (2), 184-191 (2016).</li><li>Kossack, M. E., Draper, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+regulation+of+sex+determination+and+maintenance+in+zebrafish+(Danio+rerio).">Genetic regulation of sex determination and maintenance in zebrafish (Danio rerio).</a> Current Topics in Developmental Biology. 134, 119-149 (2019).</li><li>Crossley, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+Sanger+sequencing+and+molecular+assay+monitoring.">Guidelines for Sanger sequencing and molecular assay monitoring.</a> Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 32 (6), 767-775 (2020).</li><li>Kluesner, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EditR:+A+method+to+quantify+base+editing+from+Sanger+sequencing.">EditR: A method to quantify base editing from Sanger sequencing.</a> The CRISPR Journal. 1 (3), 239-250 (2018).</li><li>Gripp, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diamond-Blackfan+anemia+with+mandibulofacial+dystostosis+is+heterogeneous,+including+the+novel+DBA+genes+TSR2+and+RPS28.">Diamond-Blackfan anemia with mandibulofacial dystostosis is heterogeneous, including the novel DBA genes TSR2 and RPS28.</a> American Journal of Medical Genetics Part A. 164 (9), 2240-2249 (2014).</li><li>Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+RNA-guided+genome+editing+in+human+cells+via+delivery+of+purified+Cas9+ribonucleoproteins.">Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins.</a> Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).</li><li>Ramakrishna, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+disruption+by+cell-penetrating+peptide-mediated+delivery+of+Cas9+protein+and+guide+RNA.">Gene disruption by cell-penetrating peptide-mediated delivery of Cas9 protein and guide RNA.</a> Genome Research. 24 (6), 1020-1027 (2014).</li><li>Fu, Y., Reyon, D., Joung, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+genome+editing+in+human+cells+using+CRISPR/Cas+nucleases+and+truncated+guide+RNAs.">Targeted genome editing in human cells using CRISPR/Cas nucleases and truncated guide RNAs.</a> Methods in Enzymology. 546, 21-45 (2014).</li></ol>

Denne protokollen beskriver konstruksjonen av en sebrafisksykdomsmodell ved hjelp av baseeditoren zSpRY-ABE8e. Sammenlignet med den tradisjonelle HDR-banen for basesubstitusjon, kan denne protokollen oppnå mer effektiv baseredigering og redusere forekomsten av indels. Samtidig innebærer denne protokollen å implementere den nylig foreslåtte i-Silence gen-knockout-strategien i sebrafisk. Til sammen vil zSpRY-ABE8e forbedre anvendelsen av sebrafiskmodeller i sykdomsforskning.
Off-target-effek...

Enkeltnukleotidvarianter (SNV) som forårsaker missense eller nonsensemutasjoner er den vanligste kilden til mutasjoner i det menneskelige genom1. For å avgjøre om en bestemt SNV er patogen, og for å kaste lys over patogenesen, kreves presise dyremodeller2. Sebrafisk er gode sykdomsmodeller for mennesker, med høy grad av fysiologisk og genetisk homologi hos mennesker, kort utviklingssyklus og sterk reproduksjonsevne, noe som er fordelaktig for forskning på sykdomsfremkallende egenskaper og mekanismer, samt medikamentscreening3.
Det grupperte regelmessig interspaced korte palindromiske repetisjoner (CRISPR) / Cas9-systemet har blitt mye brukt i genomredigering av forskjellige arter, inkludert sebrafisk4. Med gRNA-veiledning kan CRISPR/Cas9-systemet generere DNA-dobbeltstrengede brudd (DSB) på målstedet, som deretter tillater enkeltbasesubstitusjon gjennom rekombinasjon av målstedet med donor-DNA-maler via HDR-banen (homology-directed repair). Imidlertid er effektiviteten til denne baseerstatningsmetoden ganske lav, da den cellulære DNA-reparasjonsprosessen hovedsakelig utføres av den ikke-homologe endekoblingsveien (NHEJ), som vanligvis ledsages av innsetting og sletting (indel) mutasjoner5. Heldigvis lindrer CRISPR/Cas9-basert enkeltbaseredigeringsteknologi dette problemet betydelig ved å bruke basisredigerere, som muliggjør mer effektiv enkeltbaseredigering uten å indusere DSB-er. To hovedklasser av basisredaktører, adeninbaseredaktører (ABE) og cytosinbaseredaktører (CBE), er utviklet for å implementere redigering av basesubstitusjon for A· T til G · C og C·G til T· A, henholdsvis 6,7,8,9,10,11. Disse fire typene basesubstitusjoner dekker 30% av humanpatogene varianter12. Begge klasser av baseredaktører, inkludert PmCDA1, BE-system, CBE4max, ABE7.10 og ABE8e, har blitt rapportert å fungere i sebrafisk, med BE4max og ABE8e spesielt rapportert å oppnå høy redigeringsaktivitet 13,14,15,16,17,18,19.
Cas9-proteiner fra forskjellige arter, inkludert Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes og S. canis, har blitt implementert i sebrafiskgenredigering, med Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9) som brukes mest20,21,22,23. SpCas9 kan imidlertid bare gjenkjenne målsteder med et NGG-protospacer tilstøtende motiv (PAM), noe som begrenser det redigerbare området og kan føre til at ingen passende sekvens blir funnet nær det patogene stedet av interesse24. For å utvide målområdet har en rekke SpCas9-varianter blitt konstruert for å gjenkjenne forskjellige PAM-er gjennom rettet evolusjon og strukturstyrt design. Imidlertid er få varianter effektive hos dyr, spesielt i sebrafisk, noe som begrenser anvendelsen av sebrafisk i SNV-relatert sykdomsforskning25,26,27,28. Nylig har to varianter av SpCas9, SpG og SpRY, med mindre strenge PAM-restriksjoner (NGN for SpG og NNN for SpRY med høyere preferanse for NRN enn NYN) blitt rapportert å vise høy redigeringsaktivitet i humane celler og planter 29,30,31,32. Deretter har SpG og SpRY, samt en rekke av deres medierte baseredaktører, som SpRY-medierte CBEer og SpRY-medierte ABEer, også blitt rapportert å fungere i sebrafisk, noe som vil forbedre anvendelsen av sebrafiskmodeller i den mekanistiske studien og legemiddelscreening av SNV-relaterte sykdommer 18,33,34,35. Videre ble i-Silence foreslått som en effektiv og nøyaktig gen-knockout-strategi gjennom ABE-mediert startkodonkonvertering fra ATG til GTG eller ACG36. Kombinasjonen av i-Silence-strategien og den SpRY-medierte baseeditoren zSpRY-ABE8e gir en ny metode for sykdomsmodellering18. Denne protokollen demonstrerer hvordan man utfører genredigering ved hjelp av zSpRY-ABE8e i sebrafisk for å konstruere en tsr2 (M1V) modell ved hjelp av i-Silence-strategien. Redigeringseffektiviteten og fenotypene som vises i sebrafiskmodeller ble vurdert og analysert.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9539</td>
			<td>1.5% Agarose used to make an injection plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Glass Capillaries&#160;</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>BS4 30-0016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture dishes&#160;</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit</td>
			<td>Vazyme</td>
			<td>C115</td>
			<td>Kit for Infusion clone&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Codon optimization service</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drummond Microcaps</td>
			<td>Drummond Microcaps</td>
			<td>P1299-1PAK</td>
			<td>Length:32 mm, capacity:0.5 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasyEdit gRNA service</td>
			<td>GenScript</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Forceps</td>
			<td>Fine Scientific Instrument</td>
			<td>11254-20</td>
			<td>Used to break meedle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flaming/Brown Micropipette Puller&#160;</td>
			<td>Stutter Instrument</td>
			<td>P-97</td>
			<td>Used to pull the glass capillaries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HotStart Taq PCR StarMix</td>
			<td>Genstar</td>
			<td>A033-101</td>
			<td>Used for PCR reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intelligent artificial climate box</td>
			<td>TENLIN</td>
			<td>PRX-1000A</td>
			<td>Used to culture zebrafish embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylcellulose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M0512</td>
			<td>Used to fix zebrafish when photographing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microloader pipette tips&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5242956003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mMACHINE kit&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mut Express II Fast Mutagenesis Kit V2</td>
			<td>Vazyme</td>
			<td>C214-01</td>
			<td>Kit for site-directed mutagenesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pneumatic Microinjector</td>
			<td>ZGene Biotech</td>
			<td>ZGPCP-1500 PLUS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pT3TS-zSpCas9</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>46757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy FFPE kit&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>73504</td>
			<td>Kit for RNA purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sanger Sequencing service</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide, granular</td>
			<td>Sangon</td>
			<td>A100173-0500</td>
			<td>NaOH used for genome extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Microscope</td>
			<td>Olympus&#160;</td>
			<td>SZX10</td>
			<td>Used for photograph of phenotype</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SZ Series Zoom Stereo Microscope</td>
			<td>CNOPTEC</td>
			<td>SZ650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T3 mMESSAGE</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM1348</td>
			<td>Kit for in vitro transcription&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TIANprep Mini Plasmid Kit</td>
			<td>TIANGEN</td>
			<td>DP103-03</td>
			<td>Kit for plasmid extraction kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TIANquick Mini Purification Kit</td>
			<td>TIANGEN</td>
			<td>DP203-02</td>
			<td>Kit for purification for linearized plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E10521</td>
			<td>Used to anesthetize zebrafish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris (hydroxymethyl) aminomethane</td>
			<td>Sangon</td>
			<td>A600194-0500</td>
			<td>Component of Tris&#183;HCl used for genome extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XbaI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0145S</td>
			<td>Restriction endonuclease used for plasmid linearization</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

efficient pam-less base editing for zebrafish modeling of human genetic disease with zspry-abe8e

CRISPR / Cas9-teknologi har økt verdien av sebrafisk for modellering av humane genetiske sykdommer, studier av sykdomspatogenese og legemiddelscreening, men begrensninger i protospacer tilstøtende motiv (PAM) er et stort hinder for å skape nøyaktige dyremodeller av humane genetiske lidelser forårsaket av enkeltnukleotidvarianter (SNV). Til nå har noen SpCas9-varianter med bred PAM-kompatibilitet vist effektivitet i sebrafisk. Anvendelsen av den optimaliserte SpRY-medierte adeninbaseeditoren (ABE), zSpRY-ABE8e og syntetisk modifisert gRNA i sebrafisk har muliggjort effektiv adenin-guaninbasekonvertering uten PAM-begrensning. Beskrevet her er en protokoll for effektiv adeninbaseredigering uten PAM-begrensning i sebrafisk ved bruk av zSpRY-ABE8e. Ved å injisere en blanding av zSpRY-ABE8e mRNA og syntetisk modifisert gRNA i sebrafiskembryoer, ble en sebrafisksykdomsmodell konstruert med en presis mutasjon som simulerte et patogent sted for TSR2-ribosommodningsfaktoren (tsr2). Denne metoden gir et verdifullt verktøy for etablering av nøyaktige sykdomsmodeller for å studere sykdomsmekanismer og behandlinger.

Mutasjonen av TSR2 har blitt rapportert å forårsake Diamond Blackfan anemi (DBA) 42. Her ble en DBA sebrafiskmodell konstruert med en tsr2 (M1V) mutasjon ved hjelp av i-Silence-strategien. Adenin av startkodonet til sebrafisken tsr2 ble vellykket konvertert til guanin ved bruk av zSpRY-ABE8e (figur 3).
EditR-analysen av Sanger-sekvenseringsresultatene viste at det var en A/G-overlapping ved adeninbasen i tsr...

Watch this Scientific Journal Video about Efficient PAM-Less Base Editing for Zebrafish Modeling of Human Genetic Disease with zSpRY-ABE8e at JoVE.com

Efficient PAM-Less Base Editing for Zebrafish Modeling of Human Genetic Disease with zSpRY-ABE8e

Denne protokollen beskriver hvordan man utfører effektiv adeninbaseredigering uten PAM-begrensning for å konstruere en presis sebrafisksykdomsmodell ved bruk av zSpRY-ABE8e.

Effektiv PAM-mindre baseredigering for sebrafiskmodellering av menneskelig genetisk sykdom med zSpRY-ABE8e

CRISPR/Cas9 technology has increased the value of zebrafish for modeling human genetic diseases, studying disease pathogenesis, and drug screening, but ...

Denne protokollen tillater forskere å bygge en rekke tidligere utilgjengelige sebrafiskmodeller av sykdomsrelevante enkeltnukleotidvarianter. PAM-begrensninger er store hindringer for å lage nøyaktige dyremodeller, og zSpRY-ABE8e muliggjør effektiv adenin- til guaninbasekonvertering med lav intermutasjon og avslappet PAN-begrensning. Dette verktøyet kan brukes til å konstruere nøyaktige sebrafiskmodeller for å studere sykdomssykdomsmekanismer relatert til enkeltnukleotidmariner, samt medikamentscreening for denne sykdommen.For å begynne, sett opp mikropipettavtrekkersystemet og forvarm i minst 30 minutter. For å trekke glasskapillærene, velg et program, sett rampetestverdien som varme, 50 som trekk, hastigheten til 100, tid som 50 og trykk som 30. Deretter installerer du kapillærrøret slik at det er i sporet.Trykk på pull start / stop "for å kjøre programmet. For å bevare de trukne kapillærene, sett dem inn i skum som inneholder hull som holder nålen suspendert. For eksperimentering, bruk zSpRY-ABE8e mRNA beskrevet i manuskriptet, og rediger enkelt sgRNA modifisert med 2'O-metylfosforotioat i begge ender.For gRNA-designet, velg fortrinnsvis NRN som PAM-sekvensen, da zSpRY-ABE8e viser en høyere preferanse for NRN PAM enn NYN PAM. Skriv inn målet adenin nukleotid er i det svært aktive redigeringsvinduet fra det tredje til det niende nukleotidet langs protospaceren. Sett opp avlstanker kvelden før injeksjonen.Sett inn en skillelinje, plasser to kvinnelige og en hannsebrafisk i hver tank. Legg et lokk over hver tank. Neste morgen, ved hjelp av RNase-frie spisser, rør og hansker, bland det tinte mRNA og EEgRNA på is til en endelig konsentrasjon på henholdsvis 400 og 200 nanogram per mikroliter.For å konfigurere den pneumatiske mikroinjektoren, lukk først deltrykksventilen til luftpumpen. Åpne deretter hovedventilen, skru av gasssylinderen og juster trykket på partialtrykkventilen til 0,2 megapascal. Nå, slå på mikroinjektoren og sett modusen til timer.Juster parametertrykkventilen til 20 pund per kvadrattomme og timerverdien til 0.040 sekunder. Bruk fine tang, bryt nålene til de trukne glasskapillærene under et stereomikroskop. Bruk en mikroloaderpipettespiss til å tilsette mRNA/gRNA-blandingen på tuppen av en glasskapillær og feste nålen til mikromanipulatoren.Konfigurer trykk- og timerverdien for å produsere to nanoliters blanding per injeksjon ved hjelp av en mikrohette. Etter avl av fisken i 10 til 15 minutter, samle eggene i en sil. Undersøk cellestadiet og eggkvaliteten under stereomikroskopet.Velg encellede egg til injeksjon for å forbedre redigeringseffektiviteten. Linje eggene opp på en 1,5% agarose injeksjonsplate og injiser to nanoliter av RNA-blandingen inn i embryoens celle ved hjelp av et mikroskop. Samle eggene i petriskåler med E3 Buffer og rug dem ved 28 grader Celsius.Fjern de døde eggene og endre kulturbufferen hver 12. time i 48 timer etter befruktning. Etter 48 timer etter befruktning, samle tre bassenger med seks tilfeldig utvalgte injiserte embryoer i et PCR-rør. Når seks tilfeldig utvalgte kontrollembryoer er samlet, bruk en pipette for å aspirere den gjenværende E3-bufferen.Tilsett 40 mikroliter 50 millimolært natriumhydroksid til embryoene. Plasser rørene i et metallbad ved 95 grader Celsius i 20 minutter, og deretter virvel i 15 sekunder. Tilsett fire mikroliter av en molar Tris-hydroklorid ved pH åtte i hvert rør.Sentrifuger rørene ved 2000g i 10 sekunder ved romtemperatur. Overfør supernatanten til et nytt PCR-rør. Fjern en mikroliter av supernatanten fra PCR-røret og bruk den til Sanger-sekvensering.Oppbevar deretter den gjenværende supernatanten ved 20 grader Celsius. For å analysere Sanger-sekvenseringsdataene, begynn med å laste opp sekvenseringsfilen til opplasting ab1 File"-boksen. Skriv inn 20 basepar gRNA-sekvensen i 5'til 3'-retningen i skriv inn gRNA"-sekvensboksen.Skriv inn den tilsvarende basisposisjonen i boksene 5'start og 3'end. Få basen redigering effektivitet ved å klikke på prediktiv redigering "og sjekke kvaliteten på sekvenseringsdata. En diamant blackfan anemi sebrafisk modell ble konstruert ved å konvertere adenin av startkodonet til Tsr2 til guanin.EditR-analysen av sekvensdata viste en AG-overlapping ved adeninbasen av Tsr2-startkodonet. Fenotypen til de to dager gamle Tsr2-embryoene viste mindre øyne sammenlignet med kontrollembryoene. Et hovent perikard ble også observert i de muterte embryoene.For å oppnå effektiv basisredigering, må du følge det tidligere nevnte retningslinjedesignprinsippet, som er en forutsetning for eksperimentets suksess. Nøyaktige modeller er avgjørende for studiet av enkeltnukleotidvariantrelaterte sykdommer. Utviklingen av SprY-ABE8e gir et effektivt verktøy for nøyaktig modellering, noe som bidrar til å fremme forskning på sykdomsmekanismer og behandlinger.

Research

JoVE Journal

Biology

An Allele-specific Gene Expression Assay to Test the Functional Basis of Genetic Associations

The number of significant genetic associations with common complex traits is constantly increasing. However, most of these associations have not been ...

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

Effektiv Utledning av Human Cardiac Forstadier og cardiomyocytes fra pluripotent humane embryonale stamceller med lite molekyl Induksjon

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

Biokjemiske og høy gjennomstrømning mikroskopisk vurdering av fettmasse i<em&gt; Caenorhabditis Elegans</em

The nematode C. elegans has emerged as an important  model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as  it relates to human ...

In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio

In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio

In Vivo Modeling av Morbid Human Genome hjelp Danio rerio

Here,  we present methods for the development of assays to query potentially clinically  significant nonsynonymous changes using in  vivo complementation ...

Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells

Generation of Human Cardiomyocytes: En Differensiering Protokoll fra mater-frie menneskeskapte pluripotent stamceller

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is ...

Efficient Agroinfiltration of Plants for High-level Transient Expression of Recombinant Proteins

Effektiv Agroinfiltration of Plants for High-level Forbigående Expression of rekombinante proteiner

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing ...

Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis

Rask og effektiv Sebrafisk Genotyping Bruke PCR med høy oppløsning Melt Analysis

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic ...

Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies

Effektiv produksjon og rensing av rekombinant mus Kindlin-3 fra insektceller for biofysiske studier

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

Effektiv Generation Menneskelig indusert pluripotent stamceller fra menneskelige somatiske celler med Sendai-virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

Genetic Barcoding with Fluorescent Proteins for Multiplexed Applications

Genetisk strekkoding med Fluorescent Proteiner for multiplekset Applications

Fluorescent proteins, fluorescent dyes and fluorophores in general have revolutionized the field of molecular cell biology. In particular, the discovery ...