Name: efficient pam-less base editing for zebrafish modeling of human genetic disease with zspry-abe8e
Uploaded: 2023-02-17T13:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Efficient PAM-Less Base Editing for Zebrafish Modeling of Human Genetic Disease with zSpRY-ABE8e at JoVE.com

Мы благодарим Барбару Гарберс, доктора философии из Liwen Bianji (Edanz), за редактирование английского текста черновика этой рукописи. Эта работа была поддержана Программой исследований и разработок в ключевых областях провинции Гуандун (2019B030335001), Национальной ключевой программой исследований и разработок Китая (2019YFE0106700), Национальным фондом естественных наук Китая (32070819, 31970782) и Программой исследовательского фонда Ключевой лаборатории патогенной биологии и эпидемиологии водных экономических животных провинции Гуандун (PBEA2020YB05).

Это исследование было проведено в строгом соответствии с рекомендациями Комитета по уходу и использованию Южно-Китайского педагогического университета.
1. Получение синтетически модифицированной гРНК и мРНК zSpRY-ABE8e
<ol><li>Дизайн гРНК в соответствии с предыдущим...

<ol>
	<li>Eichler, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Completing+the+map+of+human+genetic+variation.">Completing the map of human genetic variation.</a> Nature. 447 (7141), 161-165 (2007).</li><li>Koukouli, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotine+reverses+hypofrontality+in+animal+models+of+addiction+and+schizophrenia.">Nicotine reverses hypofrontality in animal models of addiction and schizophrenia.</a> Nature Medicine. 23 (3), 347-354 (2017).</li><li>Kalueff, A. V., Stewart, A. M., Gerlai, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+an+emerging+model+for+studying+complex+brain+disorders.">Zebrafish as an emerging model for studying complex brain disorders.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 35 (2), 63-75 (2014).</li><li>Anzalone, A. V., Koblan, L. W., Liu, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing+with+CRISPR-Cas+nucleases,+base+editors,+transposases+and+prime+editors.">Genome editing with CRISPR-Cas nucleases, base editors, transposases and prime editors.</a> Nature Biotechnology. 38 (7), 824-844 (2020).</li><li>Sander, J. D., Joung, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas+systems+for+editing,+regulating+and+targeting+genomes.">CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes.</a> Nature Biotechnology. 32 (4), 347-355 (2014).</li><li>Komor, A. C., Kim, Y. B., Packer, M. S., Zuris, J. A., Liu, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmable+editing+of+a+target+base+in+genomic+DNA+without+double-stranded+DNA+cleavage.">Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage.</a> Nature. 533 (7603), 420-424 (2016).</li><li>Nishida, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+nucleotide+editing+using+hybrid+prokaryotic+and+vertebrate+adaptive+immune+systems.">Targeted nucleotide editing using hybrid prokaryotic and vertebrate adaptive immune systems.</a> Science. 353 (6305), (2016).</li><li>Gaudelli, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+adenine+base+editors+with+increased+activity+and+therapeutic+application.">Directed evolution of adenine base editors with increased activity and therapeutic application.</a> Nature Biotechnology. 38 (7), 892-900 (2020).</li><li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+RNA-guided+base+editing+in+rabbit.">Highly efficient RNA-guided base editing in rabbit.</a> Nature Communications. 9, 2717 (2018).</li><li>Levy, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytosine+and+adenine+base+editing+of+the+brain,+liver,+retina,+heart+and+skeletal+muscle+of+mice+via+adeno-associated+viruses.">Cytosine and adenine base editing of the brain, liver, retina, heart and skeletal muscle of mice via adeno-associated viruses.</a> Nature Biomedical Engineering. 4 (1), 97-110 (2020).</li><li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+generation+of+mouse+models+of+human+diseases+via+ABE-+and+BE-mediated+base+editing.">Efficient generation of mouse models of human diseases via ABE- and BE-mediated base editing.</a> Nature Communications. 9, 2338 (2018).</li><li>Landrum, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ClinVar:+Public+archive+of+interpretations+of+clinically+relevant+variants.">ClinVar: Public archive of interpretations of clinically relevant variants.</a> Nucleic Acids Research. 44, 862-868 (2016).</li><li>Qin, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precise+A&#8226;T+to+G&#8226;C+base+editing+in+the+zebrafish+genome.">Precise A&#8226;T to G&#8226;C base editing in the zebrafish genome.</a> BMC Biology. 16 (1), 139 (2018).</li><li>Tanaka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+targeted+single-nucleotide+editing+in+zebrafish.">In vivo targeted single-nucleotide editing in zebrafish.</a> Scientific Reports. 8, 11423 (2018).</li><li>Carrington, B., Weinstein, R. N., Sood, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BE4max+and+AncBE4max+are+efficient+in+germline+conversion+of+C:G+to+T:A+base+pairs+in+zebrafish.">BE4max and AncBE4max are efficient in germline conversion of C:G to T:A base pairs in zebrafish.</a> Cells. 9 (7), 1690 (2020).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmable+base+editing+of+zebrafish+genome+using+a+modified+CRISPR-Cas9+system.">Programmable base editing of zebrafish genome using a modified CRISPR-Cas9 system.</a> Nature Communications. 8, 118 (2017).</li><li>Rosello, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precise+base+editing+for+the+in+vivo+study+of+developmental+signaling+and+human+pathologies+in+zebrafish.">Precise base editing for the in vivo study of developmental signaling and human pathologies in zebrafish.</a> eLife. 10, 65552 (2021).</li><li>Liang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SpG+and+SpRY+variants+expand+the+CRISPR+toolbox+for+genome+editing+in+zebrafish.">SpG and SpRY variants expand the CRISPR toolbox for genome editing in zebrafish.</a> Nature Communications. 13, 3421 (2022).</li><li>Qin, W., Lu, X., Lin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmable+base+editing+in+zebrafish+using+a+modified+CRISPR-Cas9+system.">Programmable base editing in zebrafish using a modified CRISPR-Cas9 system.</a> Methods. 150, 19-23 (2018).</li><li>Feng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+CRISPR/Cas9+genome+editing+capacity+in+zebrafish+using+SaCas9.">Expanding CRISPR/Cas9 genome editing capacity in zebrafish using SaCas9.</a> G3. 6 (8), 2517-2521 (2016).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing+in+zebrafish+by+ScCas9+recognizing+NNG+PAM.">Genome editing in zebrafish by ScCas9 recognizing NNG PAM.</a> Cells. 10 (8), 2099 (2021).</li><li>Kleinstiver, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+CRISPR-Cas9+nucleases+with+altered+PAM+specificities.">Engineered CRISPR-Cas9 nucleases with altered PAM specificities.</a> Nature. 523 (7561), 481-485 (2015).</li><li>Liu, K., Petree, C., Requena, T., Varshney, P., Varshney, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+the+CRISPR+toolbox+in+zebrafish+for+studying+development+and+disease.">Expanding the CRISPR toolbox in zebrafish for studying development and disease.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 13 (2019).</li><li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity.">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li><li>Hu, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolved+Cas9+variants+with+broad+PAM+compatibility+and+high+DNA+specificity.">Evolved Cas9 variants with broad PAM compatibility and high DNA specificity.</a> Nature. 556 (7699), 57-63 (2018).</li><li>Nishimasu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+CRISPR-Cas9+nuclease+with+expanded+targeting+space.">Engineered CRISPR-Cas9 nuclease with expanded targeting space.</a> Science. 361 (6408), 1259-1262 (2018).</li><li>Endo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing+in+plants+by+engineered+CRISPR-Cas9+recognizing+NG+PAM.">Genome editing in plants by engineered CRISPR-Cas9 recognizing NG PAM.</a> Nature Plants. 5, 14-17 (2019).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+genome+editing+using+xCas9+with+expanded+PAM+compatibility.">Plant genome editing using xCas9 with expanded PAM compatibility.</a> Journal of Genetics and Genomics. 46 (5), 277-280 (2019).</li><li>Ren, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PAM-less+plant+genome+editing+using+a+CRISPR-SpRY+toolbox.">PAM-less plant genome editing using a CRISPR-SpRY toolbox.</a> Nature Plants. 7, 25-33 (2021).</li><li>Xu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SpRY+greatly+expands+the+genome+editing+scope+in+rice+with+highly+flexible+PAM+recognition.">SpRY greatly expands the genome editing scope in rice with highly flexible PAM recognition.</a> Genome Biology. 22 (1), 6 (2021).</li><li>Walton, R. T., Christie, K. A., Whittaker, M. N., Kleinstiver, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unconstrained+genome+targeting+with+near-PAMless+engineered+CRISPR-Cas9+variants.">Unconstrained genome targeting with near-PAMless engineered CRISPR-Cas9 variants.</a> Science. 368 (6488), 290-296 (2020).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing+mediated+by+SpCas9+variants+with+broad+non-canonical+PAM+compatibility+in+plants.">Genome editing mediated by SpCas9 variants with broad non-canonical PAM compatibility in plants.</a> Molecular Plant. 14 (2), 352-360 (2021).</li><li>Vicencio, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing+in+animals+with+minimal+PAM+CRISPR-Cas9+enzymes.">Genome editing in animals with minimal PAM CRISPR-Cas9 enzymes.</a> Nature Communications. 13, 2601 (2022).</li><li>Rosello, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease+modeling+by+efficient+genome+editing+using+a+near+PAM-less+base+editor+in+vivo.">Disease modeling by efficient genome editing using a near PAM-less base editor in vivo.</a> Nature Communications. 13, 3435 (2022).</li><li>Cornean, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precise+in+vivo+functional+analysis+of+DNA+variants+with+base+editing+using+ACEofBASEs+target+prediction.">Precise in vivo functional analysis of DNA variants with base editing using ACEofBASEs target prediction.</a> eLife. 11, 72124 (2022).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+silencing+by+adenine+base+editor-mediated+start+codon+mutation.">Efficient gene silencing by adenine base editor-mediated start codon mutation.</a> Molecular Therapy. 28 (2), 431-440 (2020).</li><li>Hanna, R. E., Doench, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+analysis+of+CRISPR-Cas+experiments.">Design and analysis of CRISPR-Cas experiments.</a> Nature Biotechnology. 38 (7), 813-823 (2020).</li><li>Doench, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+sgRNA+design+to+maximize+activity+and+minimize+off-target+effects+of+CRISPR-Cas9.">Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9.</a> Nature Biotechnology. 34 (2), 184-191 (2016).</li><li>Kossack, M. E., Draper, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+regulation+of+sex+determination+and+maintenance+in+zebrafish+(Danio+rerio).">Genetic regulation of sex determination and maintenance in zebrafish (Danio rerio).</a> Current Topics in Developmental Biology. 134, 119-149 (2019).</li><li>Crossley, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+Sanger+sequencing+and+molecular+assay+monitoring.">Guidelines for Sanger sequencing and molecular assay monitoring.</a> Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 32 (6), 767-775 (2020).</li><li>Kluesner, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EditR:+A+method+to+quantify+base+editing+from+Sanger+sequencing.">EditR: A method to quantify base editing from Sanger sequencing.</a> The CRISPR Journal. 1 (3), 239-250 (2018).</li><li>Gripp, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diamond-Blackfan+anemia+with+mandibulofacial+dystostosis+is+heterogeneous,+including+the+novel+DBA+genes+TSR2+and+RPS28.">Diamond-Blackfan anemia with mandibulofacial dystostosis is heterogeneous, including the novel DBA genes TSR2 and RPS28.</a> American Journal of Medical Genetics Part A. 164 (9), 2240-2249 (2014).</li><li>Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+RNA-guided+genome+editing+in+human+cells+via+delivery+of+purified+Cas9+ribonucleoproteins.">Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins.</a> Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).</li><li>Ramakrishna, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+disruption+by+cell-penetrating+peptide-mediated+delivery+of+Cas9+protein+and+guide+RNA.">Gene disruption by cell-penetrating peptide-mediated delivery of Cas9 protein and guide RNA.</a> Genome Research. 24 (6), 1020-1027 (2014).</li><li>Fu, Y., Reyon, D., Joung, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+genome+editing+in+human+cells+using+CRISPR/Cas+nucleases+and+truncated+guide+RNAs.">Targeted genome editing in human cells using CRISPR/Cas nucleases and truncated guide RNAs.</a> Methods in Enzymology. 546, 21-45 (2014).</li></ol>

В этом протоколе описано построение модели болезни рыбок данио-рерио с использованием базового редактора zSpRY-ABE8e. По сравнению с традиционным путем HDR для замены базы, этот протокол может обеспечить более эффективное редактирование базы и уменьшить количество инделов. В то же время это?...

Однонуклеотидные варианты (SNV), вызывающие миссенсовые или нонсенсовые мутации, являются наиболее распространенным источником мутаций в геноме человека1. Чтобы определить, является ли конкретная SNV патогенной, и пролить свет на ее патогенез, требуются точные модели на животных2. Рыбки данио-рерио являются хорошими моделями болезней человека, демонстрируя высокую степень физиологической и генетической гомологии с людьми, короткий цикл развития и сильную репродуктивную способность, что выгодно для исследования патогенных характеристик и механизмов, а также скрининга лекарств3.
Кластерная система коротких палиндромных повторов (CRISPR)/Cas9 с регулярным интервалом широко применяется при редактировании генома различных видов, включая рыбок данио-рерио4. Под руководством гРНК система CRISPR/Cas9 может генерировать двухцепочечные разрывы ДНК (DSB) на целевом участке, что затем позволяет заменять одно основание путем рекомбинации целевого сайта с донорскими матрицами ДНК через путь репарации, направленной на гомологию (HDR). Однако эффективность этого метода замещения оснований довольно низкая, поскольку процесс репарации клеточной ДНК в основном осуществляется путем негомологичного соединения концов (NHEJ), который обычно сопровождается мутациями вставки и делеции (индел)5. К счастью, технология редактирования одной базы на основе CRISPR/Cas9 значительно облегчает эту проблему за счет использования базовых редакторов, которые обеспечивают более эффективное редактирование одной базы без индуцирования DSB. Два основных класса редакторов оснований, редакторы адениновых оснований (ABE) и редакторы цитозиновых оснований (CBE), были разработаны для реализации редактирования с заменой оснований для A· T в G· C и C·G в T· А, соответственно 6,7,8,9,10,11. Эти четыре типа замещения оснований охватывают 30% патогенных вариантов человека12. Сообщалось, что оба класса базовых редакторов, включая PmCDA1, систему BE, CBE4max, ABE7.10 и ABE8e, работают с рыбками данио, причем особенно сообщается, что BE4max и ABE8e достигают высокой активности редактирования 13,14,15,16,17,18,19.
Белки Cas9 различных видов, включая Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes и S. canis, были реализованы при редактировании генов рыбок данио, при этом наиболее широко используется Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9)20,21,22,23. Тем не менее, SpCas9 может распознавать целевые сайты только с примыкающим к NGG протоспейсером мотивом (PAM), что ограничивает его редактируемый диапазон и может привести к тому, что подходящая последовательность не будет найдена вблизи патогенного сайта, представляющегоинтерес 24. Чтобы расширить целевой диапазон, было разработано множество вариантов SpCas9 для распознавания различных PAM посредством направленной эволюции и структурно-ориентированного проектирования. Тем не менее, немногие варианты эффективны для животных, особенно для рыбок данио, что ограничивает применение рыбок данио-рерио в исследованиях заболеваний, связанных с SNV 25,26,27,28. В последнее время сообщалось, что два варианта SpCas9, SpG и SpRY с менее строгими ограничениями PAM (NGN для SpG и NNN для SpRY с более высоким предпочтением NRN, чем NYN), проявляют высокую активность редактирования в клетках и растениях человека 29,30,31,32. Впоследствии сообщалось, что SpG и SpRY, а также ряд их опосредованных базовых редакторов, таких как SpRY-опосредованные CBE и SpRY-опосредованные ABE, также работают с рыбками данио, что расширит применение моделей рыбок данио-рерио в механистическом исследовании и скрининге лекарств заболеваний, связанных с SNV 18,33,34,35. Кроме того, i-Silence был предложен в качестве эффективной и точной стратегии нокаута генов посредством ABE-опосредованного преобразования стартового кодона из ATG в GTG или ACG36. Комбинация стратегии i-Silence и SpRY-опосредованного базового редактора zSpRY-ABE8e обеспечивает новый метод моделирования заболеваний18. Этот протокол демонстрирует, как выполнять редактирование генов с использованием zSpRY-ABE8e у рыбок данио-рерио для построения модели tsr2 (M1V) с использованием стратегии i-Silence. Была оценена и проанализирована эффективность редактирования и фенотипы, которые появляются в моделях рыбок данио.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9539</td>
			<td>1.5% Agarose used to make an injection plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Glass Capillaries&#160;</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>BS4 30-0016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture dishes&#160;</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit</td>
			<td>Vazyme</td>
			<td>C115</td>
			<td>Kit for Infusion clone&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Codon optimization service</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drummond Microcaps</td>
			<td>Drummond Microcaps</td>
			<td>P1299-1PAK</td>
			<td>Length:32 mm, capacity:0.5 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasyEdit gRNA service</td>
			<td>GenScript</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Forceps</td>
			<td>Fine Scientific Instrument</td>
			<td>11254-20</td>
			<td>Used to break meedle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flaming/Brown Micropipette Puller&#160;</td>
			<td>Stutter Instrument</td>
			<td>P-97</td>
			<td>Used to pull the glass capillaries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HotStart Taq PCR StarMix</td>
			<td>Genstar</td>
			<td>A033-101</td>
			<td>Used for PCR reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intelligent artificial climate box</td>
			<td>TENLIN</td>
			<td>PRX-1000A</td>
			<td>Used to culture zebrafish embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylcellulose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M0512</td>
			<td>Used to fix zebrafish when photographing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microloader pipette tips&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5242956003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mMACHINE kit&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mut Express II Fast Mutagenesis Kit V2</td>
			<td>Vazyme</td>
			<td>C214-01</td>
			<td>Kit for site-directed mutagenesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pneumatic Microinjector</td>
			<td>ZGene Biotech</td>
			<td>ZGPCP-1500 PLUS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pT3TS-zSpCas9</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>46757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy FFPE kit&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>73504</td>
			<td>Kit for RNA purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sanger Sequencing service</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide, granular</td>
			<td>Sangon</td>
			<td>A100173-0500</td>
			<td>NaOH used for genome extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Microscope</td>
			<td>Olympus&#160;</td>
			<td>SZX10</td>
			<td>Used for photograph of phenotype</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SZ Series Zoom Stereo Microscope</td>
			<td>CNOPTEC</td>
			<td>SZ650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T3 mMESSAGE</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM1348</td>
			<td>Kit for in vitro transcription&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TIANprep Mini Plasmid Kit</td>
			<td>TIANGEN</td>
			<td>DP103-03</td>
			<td>Kit for plasmid extraction kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TIANquick Mini Purification Kit</td>
			<td>TIANGEN</td>
			<td>DP203-02</td>
			<td>Kit for purification for linearized plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E10521</td>
			<td>Used to anesthetize zebrafish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris (hydroxymethyl) aminomethane</td>
			<td>Sangon</td>
			<td>A600194-0500</td>
			<td>Component of Tris&#183;HCl used for genome extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XbaI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0145S</td>
			<td>Restriction endonuclease used for plasmid linearization</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

efficient pam-less base editing for zebrafish modeling of human genetic disease with zspry-abe8e

Технология CRISPR/Cas9 повысила ценность рыбок данио-рерио для моделирования генетических заболеваний человека, изучения патогенеза заболеваний и скрининга лекарств, но ограничения смежных мотивов протоспейсеров (PAM) являются основным препятствием для создания точных животных моделей генетических нарушений человека, вызванных однонуклеотидными вариантами (SNV). До сих пор некоторые варианты SpCas9 с широкой совместимостью с PAM показали эффективность у рыбок данио. Применение оптимизированного SpRY-опосредованного редактора адениновых оснований (ABE), zSpRY-ABE8e и синтетически модифицированной гРНК у рыбок данио-рерио позволило эффективно конформировать аденин-гуаниновое основание без ограничения PAM. Здесь описан протокол для эффективного редактирования адениновых оснований без ограничения PAM у рыбок данио-рерио с использованием zSpRY-ABE8e. Путем введения смеси мРНК zSpRY-ABE8e и синтетически модифицированной гРНК эмбрионам рыбок данио-рерио была построена модель болезни рыбок данио-рерио с точной мутацией, которая имитировала патогенный сайт фактора созревания рибосомы TSR2 (tsr2). Этот метод является ценным инструментом для создания точных моделей заболеваний для изучения механизмов и методов лечения заболеваний.

Сообщалось, что мутация TSR2 вызывает анемию Даймонда Блэкфана (DBA)42. Здесь была построена модель рыбок данио-рерио DBA с мутацией tsr2 (M1V) с использованием стратегии i-Silence. Аденин стартового кодона рыбок данио-рерио tsr2 был успешно преобразован в гуанин с помощью zSpRY...

Watch this Scientific Journal Video about Efficient PAM-Less Base Editing for Zebrafish Modeling of Human Genetic Disease with zSpRY-ABE8e at JoVE.com

Efficient PAM-Less Base Editing for Zebrafish Modeling of Human Genetic Disease with zSpRY-ABE8e

Этот протокол описывает, как выполнить эффективное редактирование аденинового основания без ограничения PAM для построения точной модели болезни рыбок данио-рерио с использованием zSpRY-ABE8e.

Эффективное редактирование базы без PAM для моделирования генетических заболеваний человека у рыбок данио-рерио с помощью zSpRY-ABE8e

CRISPR/Cas9 technology has increased the value of zebrafish for modeling human genetic diseases, studying disease pathogenesis, and drug screening, but ...

Этот протокол позволяет исследователям построить ряд ранее недоступных моделей рыбок данио-рерио однонуклеотидных вариантов, связанных с заболеванием. Ограничения PAM являются основным препятствием для создания точных моделей на животных, и zSpRY-ABE8e обеспечивает эффективное преобразование аденина в гуаниновое основание с низкой интермутацией и ослабленным ограничением PAN. Этот инструмент может быть использован для построения точных моделей рыбок данио-рерио для изучения патогенных характеристик механизмов заболевания, связанных с однонуклеотидными морскими пехотинцами, а также для скрининга лекарств от этого заболевания.Для начала настройте систему съемников микропипеток и разогрейте не менее 30 минут. Чтобы вытянуть стеклянные капилляры, выберите программу, установите значение импульсного теста как тепло, 50 как тягу, скорость 100, время как 50 и давление как 30. Затем установите капиллярную трубку, убедившись, что она находится в канавке.Нажмите «Потяните старт/стоп», чтобы запустить программу. Чтобы сохранить вытянутые капилляры, вставьте их в пену, содержащую зазоры, удерживающие иглу в подвешенном состоянии. Для экспериментов используйте мРНК zSpRY-ABE8e, описанную в рукописи, и легко редактируйте sgRNA, модифицированную 2'O-метилфосфоротиоатом на обоих концах.Для дизайна гРНК предпочтительно выберите NRN в качестве последовательности PAM, поскольку zSpRY-ABE8e демонстрирует более высокое предпочтение NRN PAM, чем NYN PAM. Введите целевой адениновый нуклеотид в высокоактивное окно редактирования от третьего до девятого нуклеотида вдоль протоспейсера. Установите резервуары для разведения в ночь перед инъекцией.Вставьте разделитель, поместив в каждый аквариум по две самки и одного самца данио. Накройте каждый резервуар крышкой. На следующее утро, используя наконечники, пробирки и перчатки без РНКазы, смешайте размороженную мРНК и EEgRNA на льду до конечной концентрации 400 и 200 нанограммов на микролитр соответственно.Чтобы настроить пневматический микроинжектор, сначала закройте клапан парциального давления воздушного насоса. Затем откройте главный клапан, открутите газовый баллон и отрегулируйте давление клапана парциального давления до 0.2 мегапаскалей. Теперь включаем микроинжектор и устанавливаем режим на таймер.Отрегулируйте параметр нагнетательного клапана на 20 фунтов на квадратный дюйм и значение таймера на 0.040 секунды. С помощью тонких щипцов угловато разбивают иглы вытянутых стеклянных капилляров под стереомикроскопом. Используя наконечник пипетки микрозагрузчика, добавьте смесь мРНК/гРНК к кончику стеклянного капилляра и присоедините иглу к микроманипулятору.Настройте давление и значение таймера для получения смеси в два нанолитра за инъекцию с использованием микроколпачка. После разведения рыбы в течение 10 – 15 минут соберите икру в ситечко. Исследуйте стадию клетки и качество яйцеклетки под стереомикроскопом.Выберите одноклеточные яйцеклетки для инъекций, чтобы повысить эффективность редактирования. Выстройте яйцеклетки на 1,5%-ной пластине для инъекций агарозы и введите два нанолитра смеси РНК в клетку эмбрионов с помощью микроскопа. Соберите яйца в чашках Петри с буфером E3 и инкубируйте их при температуре 28 градусов Цельсия.Удалите мертвые яйца и меняйте культуральный буфер каждые 12 часов в течение 48 часов после оплодотворения. Через 48 часов после оплодотворения соберите три пула из шести случайно выбранных эмбрионов в ПЦР-пробирку. После того, как шесть случайно выбранных контрольных эмбрионов собраны, используйте пипетку для аспирации остаточного буфера E3.Добавьте 40 микролитров 50 миллимолярного гидроксида натрия к эмбрионам. Поместите трубки в металлическую ванну при температуре 95 градусов Цельсия на 20 минут, а затем встряхните в течение 15 секунд. Добавьте четыре микролитра одного молярного гидрохлорида триса при рН восемь в каждую пробирку.Центрифугируйте пробирки при 2000 г в течение 10 секунд при комнатной температуре. Перенесите надосадочную жидкость в новую ПЦР-пробирку. Извлеките один микролитр надосадочной жидкости из ПЦР-пробирки и используйте его для секвенирования по Сэнгеру.Затем храните оставшуюся надосадочную жидкость при температуре 20 градусов Цельсия. Чтобы проанализировать данные секвенирования Сэнгера, начните с загрузки файла виртуализации в поле «Загрузить файл ab1». Введите последовательность гРНК из 20 пар оснований в ориентации от 5 до 3 футов в поле последовательности ввода гРНК.Введите соответствующее базовое положение в поля 5'start и 3'ends. Получите эффективность базового редактирования, нажав на предиктивное редактирование» и проверив качество данных секвенирования. Была построена модель анемии данио-рерио алмаза путем преобразования аденина стартового кодона Tsr2 в гуанин.Анализ данных последовательности EditR показал перекрытие AG в адениновом основании стартового кодона Tsr2. Фенотип двух суточных эмбрионов Tsr2 показал меньшие глаза по сравнению с контрольными эмбрионами. Опухший перикард также наблюдался у мутантных эмбрионов.Чтобы добиться эффективного редактирования базы, пожалуйста, строго следуйте ранее упомянутому принципу проектирования руководящих принципов, что является предпосылкой для успеха эксперимента. Точные модели необходимы для изучения заболеваний, связанных с однонуклеотидным вариантом. Разработка SprY-ABE8e обеспечивает эффективный инструмент для точного моделирования, который помогает продвигать исследования механизмов заболевания и методов лечения.

Research

JoVE Journal

Biology

An Allele-specific Gene Expression Assay to Test the Functional Basis of Genetic Associations

Аллель-специфичная Анализ экспрессии генов для тестирования функциональной основе генетических ассоциаций

The number of significant genetic associations with common complex traits is constantly increasing. However, most of these associations have not been ...

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

Эффективное Вывод прав Сердечная Прекурсоры и кардиомиоциты из плюрипотентных эмбриональных стволовых клеток человека с малыми Индукционная Молекула

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

Биохимические и высокая пропускная способность Микроскопическая оценка жировой массы в<em&gt; Caenorhabditis Элеганс</em

The nematode C. elegans has emerged as an important  model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as  it relates to human ...

In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio

In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio

In Vivo Моделирование Morbid геноме человека Данио рерио использованием

Here,  we present methods for the development of assays to query potentially clinically  significant nonsynonymous changes using in  vivo complementation ...

Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells

Поколению прав кардиомиоцитов: Дифференциация Протокол от Ф-свободной человеческой индуцированных плюрипотентных стволовых клеток

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is ...

Efficient Agroinfiltration of Plants for High-level Transient Expression of Recombinant Proteins

Эффективное Агроинфильтрация растений для высокого уровня переходных Экспрессия рекомбинантных белков

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing ...

Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis

Быстрое и эффективное данио рерио Генотипирование Использование ПЦР с высоким разрешением расплава анализа

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic ...

Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies

Эффективное производство и очистка рекомбинантного мышиного Kindlin-3 от клетках насекомых биофизической исследований

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

Эффективная генерация человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток из человеческих соматических клеток с Сендай-вируса

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

Genetic Barcoding with Fluorescent Proteins for Multiplexed Applications

Генетический штрих кода с флуоресцентных белков для мультиплексированных приложений

Fluorescent proteins, fluorescent dyes and fluorophores in general have revolutionized the field of molecular cell biology. In particular, the discovery ...