Name: efficient pam-less base editing for zebrafish modeling of human genetic disease with zspry-abe8e
Uploaded: 2023-02-17T13:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Efficient PAM-Less Base Editing for Zebrafish Modeling of Human Genetic Disease with zSpRY-ABE8e at JoVE.com

Agradecemos a Barbara Garbers, PhD, de Liwen Bianji (Edanz) por editar el texto en inglés de un borrador de este manuscrito. Este trabajo fue apoyado por el Programa de Investigación y Desarrollo del Área Clave de la Provincia de Guangdong (2019B030335001), el Programa Nacional de Investigación y Desarrollo Clave de China (2019YFE0106700), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (32070819, 31970782) y el Programa del Fondo de Investigación del Laboratorio Provincial Clave de Biología Patogénica y Epidemiología para Animales Acuáticos Económicos de Guangdong (PBEA2020YB05).

Este estudio se realizó en estricto cumplimiento de las directrices del Comité de Cuidado y Uso de la Universidad Normal del Sur de China.
1. Preparación de ARNg modificado sintéticamente y ARNm de zSpRY-ABE8e
<ol><li>Diseñar el ARNg según publicaciones anteriores37,38.<ol><li>Seleccione preferentemente NRN como la secuencia PAM, ya que zSpRY-ABE8e muestra una mayor preferencia por NRN PAM que NYN PAM (donde R ...

<ol>
	<li>Eichler, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Completing+the+map+of+human+genetic+variation.">Completing the map of human genetic variation.</a> Nature. 447 (7141), 161-165 (2007).</li><li>Koukouli, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotine+reverses+hypofrontality+in+animal+models+of+addiction+and+schizophrenia.">Nicotine reverses hypofrontality in animal models of addiction and schizophrenia.</a> Nature Medicine. 23 (3), 347-354 (2017).</li><li>Kalueff, A. V., Stewart, A. M., Gerlai, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+an+emerging+model+for+studying+complex+brain+disorders.">Zebrafish as an emerging model for studying complex brain disorders.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 35 (2), 63-75 (2014).</li><li>Anzalone, A. V., Koblan, L. W., Liu, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing+with+CRISPR-Cas+nucleases,+base+editors,+transposases+and+prime+editors.">Genome editing with CRISPR-Cas nucleases, base editors, transposases and prime editors.</a> Nature Biotechnology. 38 (7), 824-844 (2020).</li><li>Sander, J. D., Joung, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas+systems+for+editing,+regulating+and+targeting+genomes.">CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes.</a> Nature Biotechnology. 32 (4), 347-355 (2014).</li><li>Komor, A. C., Kim, Y. B., Packer, M. S., Zuris, J. A., Liu, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmable+editing+of+a+target+base+in+genomic+DNA+without+double-stranded+DNA+cleavage.">Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage.</a> Nature. 533 (7603), 420-424 (2016).</li><li>Nishida, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+nucleotide+editing+using+hybrid+prokaryotic+and+vertebrate+adaptive+immune+systems.">Targeted nucleotide editing using hybrid prokaryotic and vertebrate adaptive immune systems.</a> Science. 353 (6305), (2016).</li><li>Gaudelli, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+adenine+base+editors+with+increased+activity+and+therapeutic+application.">Directed evolution of adenine base editors with increased activity and therapeutic application.</a> Nature Biotechnology. 38 (7), 892-900 (2020).</li><li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+RNA-guided+base+editing+in+rabbit.">Highly efficient RNA-guided base editing in rabbit.</a> Nature Communications. 9, 2717 (2018).</li><li>Levy, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytosine+and+adenine+base+editing+of+the+brain,+liver,+retina,+heart+and+skeletal+muscle+of+mice+via+adeno-associated+viruses.">Cytosine and adenine base editing of the brain, liver, retina, heart and skeletal muscle of mice via adeno-associated viruses.</a> Nature Biomedical Engineering. 4 (1), 97-110 (2020).</li><li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+generation+of+mouse+models+of+human+diseases+via+ABE-+and+BE-mediated+base+editing.">Efficient generation of mouse models of human diseases via ABE- and BE-mediated base editing.</a> Nature Communications. 9, 2338 (2018).</li><li>Landrum, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ClinVar:+Public+archive+of+interpretations+of+clinically+relevant+variants.">ClinVar: Public archive of interpretations of clinically relevant variants.</a> Nucleic Acids Research. 44, 862-868 (2016).</li><li>Qin, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precise+A&#8226;T+to+G&#8226;C+base+editing+in+the+zebrafish+genome.">Precise A&#8226;T to G&#8226;C base editing in the zebrafish genome.</a> BMC Biology. 16 (1), 139 (2018).</li><li>Tanaka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+targeted+single-nucleotide+editing+in+zebrafish.">In vivo targeted single-nucleotide editing in zebrafish.</a> Scientific Reports. 8, 11423 (2018).</li><li>Carrington, B., Weinstein, R. N., Sood, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BE4max+and+AncBE4max+are+efficient+in+germline+conversion+of+C:G+to+T:A+base+pairs+in+zebrafish.">BE4max and AncBE4max are efficient in germline conversion of C:G to T:A base pairs in zebrafish.</a> Cells. 9 (7), 1690 (2020).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmable+base+editing+of+zebrafish+genome+using+a+modified+CRISPR-Cas9+system.">Programmable base editing of zebrafish genome using a modified CRISPR-Cas9 system.</a> Nature Communications. 8, 118 (2017).</li><li>Rosello, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precise+base+editing+for+the+in+vivo+study+of+developmental+signaling+and+human+pathologies+in+zebrafish.">Precise base editing for the in vivo study of developmental signaling and human pathologies in zebrafish.</a> eLife. 10, 65552 (2021).</li><li>Liang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SpG+and+SpRY+variants+expand+the+CRISPR+toolbox+for+genome+editing+in+zebrafish.">SpG and SpRY variants expand the CRISPR toolbox for genome editing in zebrafish.</a> Nature Communications. 13, 3421 (2022).</li><li>Qin, W., Lu, X., Lin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmable+base+editing+in+zebrafish+using+a+modified+CRISPR-Cas9+system.">Programmable base editing in zebrafish using a modified CRISPR-Cas9 system.</a> Methods. 150, 19-23 (2018).</li><li>Feng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+CRISPR/Cas9+genome+editing+capacity+in+zebrafish+using+SaCas9.">Expanding CRISPR/Cas9 genome editing capacity in zebrafish using SaCas9.</a> G3. 6 (8), 2517-2521 (2016).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing+in+zebrafish+by+ScCas9+recognizing+NNG+PAM.">Genome editing in zebrafish by ScCas9 recognizing NNG PAM.</a> Cells. 10 (8), 2099 (2021).</li><li>Kleinstiver, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+CRISPR-Cas9+nucleases+with+altered+PAM+specificities.">Engineered CRISPR-Cas9 nucleases with altered PAM specificities.</a> Nature. 523 (7561), 481-485 (2015).</li><li>Liu, K., Petree, C., Requena, T., Varshney, P., Varshney, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+the+CRISPR+toolbox+in+zebrafish+for+studying+development+and+disease.">Expanding the CRISPR toolbox in zebrafish for studying development and disease.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 13 (2019).</li><li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity.">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li><li>Hu, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolved+Cas9+variants+with+broad+PAM+compatibility+and+high+DNA+specificity.">Evolved Cas9 variants with broad PAM compatibility and high DNA specificity.</a> Nature. 556 (7699), 57-63 (2018).</li><li>Nishimasu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+CRISPR-Cas9+nuclease+with+expanded+targeting+space.">Engineered CRISPR-Cas9 nuclease with expanded targeting space.</a> Science. 361 (6408), 1259-1262 (2018).</li><li>Endo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing+in+plants+by+engineered+CRISPR-Cas9+recognizing+NG+PAM.">Genome editing in plants by engineered CRISPR-Cas9 recognizing NG PAM.</a> Nature Plants. 5, 14-17 (2019).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+genome+editing+using+xCas9+with+expanded+PAM+compatibility.">Plant genome editing using xCas9 with expanded PAM compatibility.</a> Journal of Genetics and Genomics. 46 (5), 277-280 (2019).</li><li>Ren, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PAM-less+plant+genome+editing+using+a+CRISPR-SpRY+toolbox.">PAM-less plant genome editing using a CRISPR-SpRY toolbox.</a> Nature Plants. 7, 25-33 (2021).</li><li>Xu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SpRY+greatly+expands+the+genome+editing+scope+in+rice+with+highly+flexible+PAM+recognition.">SpRY greatly expands the genome editing scope in rice with highly flexible PAM recognition.</a> Genome Biology. 22 (1), 6 (2021).</li><li>Walton, R. T., Christie, K. A., Whittaker, M. N., Kleinstiver, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unconstrained+genome+targeting+with+near-PAMless+engineered+CRISPR-Cas9+variants.">Unconstrained genome targeting with near-PAMless engineered CRISPR-Cas9 variants.</a> Science. 368 (6488), 290-296 (2020).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing+mediated+by+SpCas9+variants+with+broad+non-canonical+PAM+compatibility+in+plants.">Genome editing mediated by SpCas9 variants with broad non-canonical PAM compatibility in plants.</a> Molecular Plant. 14 (2), 352-360 (2021).</li><li>Vicencio, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing+in+animals+with+minimal+PAM+CRISPR-Cas9+enzymes.">Genome editing in animals with minimal PAM CRISPR-Cas9 enzymes.</a> Nature Communications. 13, 2601 (2022).</li><li>Rosello, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease+modeling+by+efficient+genome+editing+using+a+near+PAM-less+base+editor+in+vivo.">Disease modeling by efficient genome editing using a near PAM-less base editor in vivo.</a> Nature Communications. 13, 3435 (2022).</li><li>Cornean, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precise+in+vivo+functional+analysis+of+DNA+variants+with+base+editing+using+ACEofBASEs+target+prediction.">Precise in vivo functional analysis of DNA variants with base editing using ACEofBASEs target prediction.</a> eLife. 11, 72124 (2022).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+silencing+by+adenine+base+editor-mediated+start+codon+mutation.">Efficient gene silencing by adenine base editor-mediated start codon mutation.</a> Molecular Therapy. 28 (2), 431-440 (2020).</li><li>Hanna, R. E., Doench, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+analysis+of+CRISPR-Cas+experiments.">Design and analysis of CRISPR-Cas experiments.</a> Nature Biotechnology. 38 (7), 813-823 (2020).</li><li>Doench, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+sgRNA+design+to+maximize+activity+and+minimize+off-target+effects+of+CRISPR-Cas9.">Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9.</a> Nature Biotechnology. 34 (2), 184-191 (2016).</li><li>Kossack, M. E., Draper, B. 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G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EditR:+A+method+to+quantify+base+editing+from+Sanger+sequencing.">EditR: A method to quantify base editing from Sanger sequencing.</a> The CRISPR Journal. 1 (3), 239-250 (2018).</li><li>Gripp, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diamond-Blackfan+anemia+with+mandibulofacial+dystostosis+is+heterogeneous,+including+the+novel+DBA+genes+TSR2+and+RPS28.">Diamond-Blackfan anemia with mandibulofacial dystostosis is heterogeneous, including the novel DBA genes TSR2 and RPS28.</a> American Journal of Medical Genetics Part A. 164 (9), 2240-2249 (2014).</li><li>Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+RNA-guided+genome+editing+in+human+cells+via+delivery+of+purified+Cas9+ribonucleoproteins.">Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins.</a> Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).</li><li>Ramakrishna, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+disruption+by+cell-penetrating+peptide-mediated+delivery+of+Cas9+protein+and+guide+RNA.">Gene disruption by cell-penetrating peptide-mediated delivery of Cas9 protein and guide RNA.</a> Genome Research. 24 (6), 1020-1027 (2014).</li><li>Fu, Y., Reyon, D., Joung, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+genome+editing+in+human+cells+using+CRISPR/Cas+nucleases+and+truncated+guide+RNAs.">Targeted genome editing in human cells using CRISPR/Cas nucleases and truncated guide RNAs.</a> Methods in Enzymology. 546, 21-45 (2014).</li></ol>

Este protocolo describe la construcción de un modelo de enfermedad del pez cebra utilizando el editor base zSpRY-ABE8e. En comparación con la vía HDR tradicional para la sustitución de bases, este protocolo puede lograr una edición de base más eficiente y reducir la aparición de indeles. Al mismo tiempo, este protocolo implica la implementación de la estrategia de eliminación de genes i-Silence recientemente propuesta en el pez cebra. En conjunto, zSpRY-ABE8e mejorará la aplicación de modelos de pez cebra en l...

Las variantes de un solo nucleótido (SNV) que causan mutaciones sin sentido o sin sentido son la fuente más común de mutaciones en el genoma humano1. Para determinar si un SNV en particular es patógeno y para arrojar luz sobre su patogénesis, se requieren modelos animales precisos2. El pez cebra son buenos modelos de enfermedades humanas, exhibiendo un alto grado de homología fisiológica y genética con los humanos, un ciclo de desarrollo corto y una fuerte capacidad reproductiva, lo que es ventajoso para la investigación de características y mecanismos patogénicos, así como para el cribado de drogas3.
El sistema de repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas (CRISPR) / Cas9 se ha aplicado ampliamente en la edición del genoma de varias especies, incluido el pez cebra4. Con la guía de ARNg, el sistema CRISPR / Cas9 puede generar roturas de doble cadena de ADN (DSB) en el sitio objetivo, lo que luego permite la sustitución de base única a través de la recombinación del sitio objetivo con plantillas de ADN del donante a través de la vía de reparación dirigida por homología (HDR). Sin embargo, la eficiencia de este método de reemplazo de bases es bastante baja, ya que el proceso de reparación del ADN celular se lleva a cabo principalmente por la vía de unión final no homóloga (NHEJ), que generalmente se acompaña de mutaciones de inserción y deleción (indel)5. Afortunadamente, la tecnología de edición de base única basada en CRISPR / Cas9 alivia significativamente este problema mediante el uso de editores de base, que permiten una edición de base única más eficiente sin inducir DSB. Se han desarrollado dos clases principales de editores de base, los editores de base de adenina (ABE) y los editores de base de citosina (CBE), para implementar la edición de sustitución de bases para A· T a G· C y C·G a T· A, respectivamente 6,7,8,9,10,11. Estos cuatro tipos de sustituciones de bases cubren el 30% de las variantes patogénicas humanas12. Se ha informado que ambas clases de editores base, incluidos PmCDA1, BE system, CBE4max, ABE7.10 y ABE8e, funcionan en peces cebra, con BE4max y ABE8e especialmente reportados para lograr una alta actividad de edición 13,14,15,16,17,18,19.
Las proteínas Cas9 de diferentes especies, incluyendo Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes y S. canis, se han implementado en la edición de genes de pez cebra, con el Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9) siendo el más ampliamente utilizado20,21,22,23. Sin embargo, SpCas9 sólo puede reconocer sitios objetivo con un motivo adyacente al protoespaciador NGG (PAM), lo que limita su rango editable y puede resultar en que no se encuentre una secuencia adecuada cerca del sitio patógeno de interés24. Para ampliar el rango objetivo, se han diseñado una variedad de variantes de SpCas9 para reconocer diferentes PAM a través de la evolución dirigida y el diseño guiado por la estructura. Sin embargo, pocas variantes son efectivas en animales, especialmente en el pez cebra, lo que limita la aplicación del pez cebra en la investigación de enfermedades relacionadas con SNV25,26,27,28. Recientemente, se ha informado que dos variantes de SpCas9, SpG y SpRY, con restricciones de PAM menos estrictas (NGN para SpG y NNN para SpRY con una mayor preferencia por NRN que NYN) exhiben una alta actividad de edición en células y plantas humanas 29,30,31,32. Posteriormente, también se ha informado que SpG y SpRY, así como varios de sus editores de base mediados, como los CBE mediados por SpRY y los ABE mediados por SpRY, trabajan en peces cebra, lo que mejorará la aplicación de modelos de pez cebra en el estudio mecanicista y la detección farmacológica de enfermedades relacionadas con SNV 18,33,34,35. Además, i-Silence se propuso como una estrategia efectiva y precisa de eliminación de genes a través de la conversión de codones de inicio mediada por ABE de ATG a GTG o ACG36. La combinación de la estrategia i-Silence y el editor base mediado por SpRY zSpRY-ABE8e proporciona un nuevo método para el modelado de enfermedades18. Este protocolo demuestra cómo realizar la edición de genes usando zSpRY-ABE8e en pez cebra para construir un modelo tsr2 (M1V) utilizando la estrategia i-Silence. Se evaluó y analizó la eficiencia de edición y los fenotipos que aparecen en los modelos de pez cebra.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9539</td>
			<td>1.5% Agarose used to make an injection plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Glass Capillaries&#160;</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>BS4 30-0016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture dishes&#160;</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit</td>
			<td>Vazyme</td>
			<td>C115</td>
			<td>Kit for Infusion clone&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Codon optimization service</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drummond Microcaps</td>
			<td>Drummond Microcaps</td>
			<td>P1299-1PAK</td>
			<td>Length:32 mm, capacity:0.5 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasyEdit gRNA service</td>
			<td>GenScript</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Forceps</td>
			<td>Fine Scientific Instrument</td>
			<td>11254-20</td>
			<td>Used to break meedle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flaming/Brown Micropipette Puller&#160;</td>
			<td>Stutter Instrument</td>
			<td>P-97</td>
			<td>Used to pull the glass capillaries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HotStart Taq PCR StarMix</td>
			<td>Genstar</td>
			<td>A033-101</td>
			<td>Used for PCR reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intelligent artificial climate box</td>
			<td>TENLIN</td>
			<td>PRX-1000A</td>
			<td>Used to culture zebrafish embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylcellulose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M0512</td>
			<td>Used to fix zebrafish when photographing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microloader pipette tips&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5242956003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mMACHINE kit&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mut Express II Fast Mutagenesis Kit V2</td>
			<td>Vazyme</td>
			<td>C214-01</td>
			<td>Kit for site-directed mutagenesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pneumatic Microinjector</td>
			<td>ZGene Biotech</td>
			<td>ZGPCP-1500 PLUS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pT3TS-zSpCas9</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>46757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy FFPE kit&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>73504</td>
			<td>Kit for RNA purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sanger Sequencing service</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide, granular</td>
			<td>Sangon</td>
			<td>A100173-0500</td>
			<td>NaOH used for genome extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Microscope</td>
			<td>Olympus&#160;</td>
			<td>SZX10</td>
			<td>Used for photograph of phenotype</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SZ Series Zoom Stereo Microscope</td>
			<td>CNOPTEC</td>
			<td>SZ650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T3 mMESSAGE</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM1348</td>
			<td>Kit for in vitro transcription&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TIANprep Mini Plasmid Kit</td>
			<td>TIANGEN</td>
			<td>DP103-03</td>
			<td>Kit for plasmid extraction kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TIANquick Mini Purification Kit</td>
			<td>TIANGEN</td>
			<td>DP203-02</td>
			<td>Kit for purification for linearized plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E10521</td>
			<td>Used to anesthetize zebrafish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris (hydroxymethyl) aminomethane</td>
			<td>Sangon</td>
			<td>A600194-0500</td>
			<td>Component of Tris&#183;HCl used for genome extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XbaI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0145S</td>
			<td>Restriction endonuclease used for plasmid linearization</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

efficient pam-less base editing for zebrafish modeling of human genetic disease with zspry-abe8e

La tecnología CRISPR / Cas9 ha aumentado el valor del pez cebra para modelar enfermedades genéticas humanas, estudiar la patogénesis de enfermedades y la detección de fármacos, pero las limitaciones del motivo adyacente del protoespaciador (PAM) son un obstáculo importante para crear modelos animales precisos de trastornos genéticos humanos causados por variantes de un solo nucleótido (SNV). Hasta ahora, algunas variantes de SpCas9 con amplia compatibilidad con PAM han demostrado eficiencia en el pez cebra. La aplicación del editor de base de adenina (ABE) mediado por SpRY optimizado, zSpRY-ABE8e y el ARNg modificado sintéticamente en el pez cebra ha permitido una conversión eficiente de la base de adenina-guanina sin restricción de PAM. Aquí se describe un protocolo para la edición eficiente de la base de adenina sin limitación de PAM en peces cebra que usan zSpRY-ABE8e. Al inyectar una mezcla de ARNm de zSpRY-ABE8e y ARNg modificado sintéticamente en embriones de pez cebra, se construyó un modelo de enfermedad del pez cebra con una mutación precisa que simulaba un sitio patogénico del factor de maduración del ribosoma TSR2 (tsr2). Este método proporciona una herramienta valiosa para el establecimiento de modelos de enfermedad precisos para estudiar los mecanismos y tratamientos de la enfermedad.

Se ha descrito que la mutación de TSR2 causa anemia de Diamond Blackfan (DBA)42. Aquí, se construyó un modelo de pez cebra DBA con una mutación tsr2 (M1V) utilizando la estrategia i-Silence. La adenina del codón de inicio del pez cebra tsr2 se convirtió con éxito en guanina utilizando zSpRY-ABE8e (Figura 3).
El análisis EditR de los resultados de la secuenciación de Sanger mostró que había una superposi...

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Efficient PAM-Less Base Editing for Zebrafish Modeling of Human Genetic Disease with zSpRY-ABE8e

Este protocolo describe cómo realizar una edición eficiente de la base de adenina sin limitación de PAM para construir un modelo preciso de la enfermedad del pez cebra utilizando zSpRY-ABE8e.

Edición de base eficiente sin PAM para el modelado de peces cebra de enfermedades genéticas humanas con zSpRY-ABE8e

CRISPR/Cas9 technology has increased the value of zebrafish for modeling human genetic diseases, studying disease pathogenesis, and drug screening, but ...

Este protocolo permite a los investigadores construir una serie de modelos de pez cebra previamente no disponibles de variantes de un solo nucleótido relevantes para la enfermedad. Las limitaciones de PAM son un obstáculo importante para crear modelos animales precisos, y zSpRY-ABE8e permite una conversión eficiente de adenina a base de guanina con baja intermutación y restricción de PAN relajada. Esta herramienta se puede utilizar para construir modelos precisos de pez cebra para estudiar las características patogénicas de los mecanismos de la enfermedad relacionados con los marinos de un solo nucleótido, así como la detección de fármacos para esta enfermedad.Para empezar, configure el sistema extractor de micropipetas y precaliente durante al menos 30 minutos. Para tirar de los capilares de vidrio, seleccione un programa, establezca el valor de la prueba de rampa como calor, 50 como tracción, la velocidad en 100, el tiempo como 50 y la presión en 30. A continuación, instale el tubo capilar asegurándose de que esté en la ranura.Presione pull start/stop" para ejecutar el programa. Para preservar los capilares extraídos, insértelos en espuma que contenga espacios que mantengan la aguja suspendida. Para la experimentación, use el ARNm zSpRY-ABE8e descrito en el manuscrito, y edite fácilmente el ARNg modificado con fosforotioato de 2'O-metilo en ambos extremos.Para el diseño de ARNg, seleccione preferentemente NRN como la secuencia PAM, ya que zSpRY-ABE8e muestra una mayor preferencia por NRN PAM que NYN PAM. Ingrese el nucleótido de adenina objetivo en la ventana de edición altamente activa del tercer al noveno nucleótido a lo largo del protoespaciador. Instale tanques de cría la noche antes de la inyección.Inserte un divisor, colocando dos peces cebra hembra y uno macho en cada tanque. Coloque una tapa sobre cada tanque. A la mañana siguiente, usando puntas, tubos y guantes libres de RNasa, mezcle el ARNm descongelado y el ARNeg en hielo hasta una concentración final de 400 y 200 nanogramos por microlitro, respectivamente.Para configurar el microinyector neumático, primero, cierre la válvula de presión parcial de la bomba de aire. Luego, abra la válvula principal, desenrosque el cilindro de gas y ajuste la presión de la válvula de presión parcial a 0.2 Megapascales. Ahora, encienda el microinyector y configure el modo en temporizador.Ajuste la válvula de presión del parámetro a 20 libras por pulgada cuadrada y el valor del temporizador a 0.040 segundos. Usando pinzas finas, rompa angularmente las agujas de los capilares de vidrio tirado bajo un microscopio estéreo. Con la punta de una pipeta del microcargador, añada la mezcla de ARNm/ARNg a la punta de un capilar de vidrio y conecte la aguja al micromanipulador.Configure el valor de presión y temporizador para producir dos nanolitros de mezcla por inyección utilizando una microcápsula. Después de criar los peces durante 10 a 15 minutos, recoja los huevos en un colador. Examine la etapa celular y la calidad del huevo bajo el microscopio estéreo.Seleccione huevos unicelulares para inyección para mejorar la eficiencia de edición. Alinee los huevos en una placa de inyección de agarosa al 1,5% e inyecte dos nanolitros de la mezcla de ARN en la célula de los embriones con un microscopio. Recoja los huevos en placas de Petri con E3 Buffer e incubarlos a 28 grados centígrados.Retire los huevos muertos y cambie el tampón de cultivo cada 12 horas durante 48 horas después de la fertilización. Después de 48 horas después de la fertilización, recolecte tres grupos de seis embriones inyectados seleccionados al azar en un tubo de PCR. Una vez que se hayan recolectado seis embriones de control seleccionados al azar, use una pipeta para aspirar el tampón E3 residual.Agregue 40 microlitros de hidróxido de sodio milimolar a los embriones. Coloque los tubos en un baño de metal a 95 grados centígrados durante 20 minutos, y luego vórtice durante 15 segundos. Agregue cuatro microlitros de un clorhidrato de Tris molar a pH ocho en cada tubo.Centrifugar los tubos a 2000g durante 10 segundos a temperatura ambiente. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de PCR. Retire un microlitro del sobrenadante del tubo de PCR y utilícelo para la secuenciación de Sanger.Luego guarde el sobrenadante restante a 20 grados centígrados. Para analizar los datos de secuenciación de Sanger, comience cargando el archivo de secuenciación en el cuadro upload ab1 File". Introduzca la secuencia de ARNg de 20 pares de bases en la orientación de 5' a 3' en el cuadro de secuencia de introducción de ARNg.Introduzca la posición base correspondiente en los cuadros 5'start y 3'ends. Obtenga la eficiencia de edición base haciendo clic en edición predictiva" y verificando la calidad de los datos de secuenciación. Se construyó un modelo de pez cebra con anemia de diamante blackfan convirtiendo la adenina del codón de inicio de Tsr2 en guanina.El análisis EditR de los datos de secuencia demostró una superposición de AG en la base de adenina del codón de inicio Tsr2. El fenotipo de los embriones Tsr2 de dos días de edad mostró ojos más pequeños en comparación con los embriones de control. También se observó un pericardio hinchado en los embriones mutantes.Para lograr una edición de base eficiente, siga estrictamente el principio de diseño de directrices mencionado anteriormente, que es un requisito previo para el éxito del experimento. Los modelos precisos son esenciales para el estudio de enfermedades relacionadas con variantes de un solo nucleótido. El desarrollo del SprY-ABE8e proporciona una herramienta eficaz para el modelado preciso, que ayuda a promover la investigación de los mecanismos y tratamientos de la enfermedad.

Research

JoVE Journal

Biology

An Allele-specific Gene Expression Assay to Test the Functional Basis of Genetic Associations

Un alelo-específicas Gene ensayo de expresión para probar la base funcional de las asociaciones genéticas

The number of significant genetic associations with common complex traits is constantly increasing. However, most of these associations have not been ...

Investigación

Biología

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

Derivación eficiente de los Derechos Humanos precursores cardiacos y cardiomiocitos de pluripotentes células madre embrionarias humanas mediante la inducción de moléculas pequeñas

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

Bioquímica y de Evaluación de Rendimiento microscópica de masa grasa en<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

The nematode C. elegans has emerged as an important  model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as  it relates to human ...

In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio

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En Vivo Modelado del Genoma Humano Morbid usando Danio rerio

Here,  we present methods for the development of assays to query potentially clinically  significant nonsynonymous changes using in  vivo complementation ...

Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells

La generación de cardiomiocitos humanos: Protocolo de diferenciación de células madre pluripotentes inducidas humanas Feeder libres

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is ...

Efficient Agroinfiltration of Plants for High-level Transient Expression of Recombinant Proteins

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Rápido y Eficiente de pez cebra Genotipado Utilizando PCR con análisis del derretimiento de alta resolución

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Producción eficiente y purificación de recombinante murino kindlin-3 a partir de células de insecto para estudios biofísicos

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Eficiente generación, por actividad humana células madre pluripotentes de células somáticas humanas con virus Sendai-

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Genetic Barcoding with Fluorescent Proteins for Multiplexed Applications

El código de barras genético con proteínas fluorescentes para aplicaciones multiplexados

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