Name: ferric chloride-induced arterial thrombosis and sample collection for 3d electron microscopy analysis
Uploaded: 2023-03-17T13:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ferric Chloride-Induced Arterial Thrombosis and Sample Collection for 3D Electron Microscopy Analysis at JoVE.com

Os autores agradecem aos membros do Whiteheart Laboratory por sua cuidadosa análise deste manuscrito. O trabalho foi apoiado por subsídios do NIH, NHLBI (HL56652, HL138179 e HL150818), e um Prêmio de Mérito do Departamento de Assuntos de Veteranos para S.W.W., R01 HL 155519 para B.S., e concessão do programa intramuros NIBIB para R.D.L.

Todos os experimentos aqui discutidos foram revisados e aprovados pelo Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) da Universidade de Kentucky.
NOTA: Os instrumentos cirúrgicos estão listados na Figura 1 e na Tabela de Materiais. Foram utilizados camundongos C57BL/6J, com 8-10 semanas de idade, machos/fêmeas ou cepas geneticamente manipuladas (Knockout ou Knockin).
1. Lesão da artéria carótida induzi...

<ol>
	<li>Lozano, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+and+regional+mortality+from+235+causes+of+death+for+20+age+groups+in+1990+and+2010:+a+systematic+analysis+for+the+Global+Burden+of+Disease+Study+2010.">Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010.</a> Lancet. 380 (9859), 2095-2128 (2012).</li><li>Raskob, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thrombosis:+a+major+contributor+to+global+disease+burden.">Thrombosis: a major contributor to global disease burden.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (11), 2363-2371 (2014).</li><li>Walton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lead+aspartate,+an+en+bloc+contrast+stain+particularly+useful+for+ultrastructural+enzymology.">Lead aspartate, an en bloc contrast stain particularly useful for ultrastructural enzymology.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 27 (10), 1337-1342 (1979).</li><li>Palta, S., Saroa, R., Palta, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+the+coagulation+system.">Overview of the coagulation system.</a> Indian Journal of Anaesthesia. 58 (5), 515-523 (2014).</li><li>Joshi, S., Whiteheart, S. 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Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+action+of+platelets+and+crucial+blood+coagulation+pathways+in+hemostasis.">Mechanism action of platelets and crucial blood coagulation pathways in hemostasis.</a> International Journal of Hematology-Oncology and Stem Cell Research. 11 (4), 319-327 (2017).</li><li>Alexopoulos, D., Katogiannis, K., Sfantou, D., Lekakis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+antiplatelet+treatment+in+coronary+artery+disease+patients:+A+necessary+evil+or+an+overzealous+practice.">Combination antiplatelet treatment in coronary artery disease patients: A necessary evil or an overzealous practice.</a> Platelets. 29 (3), 228-237 (2018).</li><li>Kurz, K. D., Main, B. W., Sandusky, G. 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V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+standardization+of+in+vivo+thrombosis+studies+in+mice.">Towards standardization of in vivo thrombosis studies in mice.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 9 (8), 1641-1644 (2011).</li><li>Marsh Lyle, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+thrombin+inhibitor+efficacy+in+a+novel+rabbit+model+of+simultaneous+arterial+and+venous+thrombosis.">Assessment of thrombin inhibitor efficacy in a novel rabbit model of simultaneous arterial and venous thrombosis.</a> Thrombosis and Haemostasis. 79 (3), 656-662 (1998).</li><li>Kato, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+arterial+thrombosis+by+a+protease-activated+receptor+1+antagonist,+FR171113,+in+the+guinea+pig.">Inhibition of arterial thrombosis by a protease-activated receptor 1 antagonist, FR171113, in the guinea pig.</a> European Journal of Pharmacology. 473 (2-3), 163-169 (2003).</li><li>Huttinger, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ferric+chloride-induced+canine+carotid+artery+thrombosis:+a+large+animal+model+of+vascular+injury.">Ferric chloride-induced canine carotid artery thrombosis: a large animal model of vascular injury.</a> Journal of Visualized Experiments. (139), e57981 (2018).</li><li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antithrombotic+therapy+by+regulating+the+ROS-mediated+thrombosis+microenvironment+and+specific+nonpharmaceutical+thrombolysis+Using+Prussian+blue+nanodroplets.">Antithrombotic therapy by regulating the ROS-mediated thrombosis microenvironment and specific nonpharmaceutical thrombolysis Using Prussian blue nanodroplets.</a> Small. 18 (15), 2106252 (2022).</li><li>Liu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet+membrane+cloaked+nanotubes+to+accelerate+thrombolysis+by+thrombus+clot-targeting+and+penetration.">Platelet membrane cloaked nanotubes to accelerate thrombolysis by thrombus clot-targeting and penetration.</a> Small. , 2205260 (2022).</li><li>Refaat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Near-infrared+light-responsive+liposomes+for+protein+delivery:+Towards+bleeding-free+photothermally-assisted+thrombolysis.">Near-infrared light-responsive liposomes for protein delivery: Towards bleeding-free photothermally-assisted thrombolysis.</a> Journal of Controlled Release. 337, 212-223 (2021).</li><li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomimetic+nanoplatelets+to+target+delivery+hirudin+for+site-specific+photothermal/photodynamic+thrombolysis+and+preventing+venous+thrombus+formation.">Biomimetic nanoplatelets to target delivery hirudin for site-specific photothermal/photodynamic thrombolysis and preventing venous thrombus formation.</a> Small. 18 (51), 2203184 (2022).</li><li>Subramaniam, S., Kanse, S. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolving+the+multifaceted+mechanisms+of+the+ferric+chloride+thrombosis+model+using+an+interdisciplinary+microfluidic+approach.">Resolving the multifaceted mechanisms of the ferric chloride thrombosis model using an interdisciplinary microfluidic approach.</a> Blood. 126 (6), 817-824 (2015).</li><li>Eckly, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+underlying+FeCl3-induced+arterial+thrombosis.">Mechanisms underlying FeCl3-induced arterial thrombosis.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 9 (4), 779-789 (2011).</li><li>Woollard, K. J., Sturgeon, S., Chin-Dusting, J. P. F., Salem, H. H., Jackson, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erythrocyte+hemolysis+and+hemoglobin+oxidation+promote+ferric+chloride-induced+vascular+injury.">Erythrocyte hemolysis and hemoglobin oxidation promote ferric chloride-induced vascular injury.</a> Journal of Biological Chemistry. 284 (19), 13110-13118 (2009).</li><li>Shim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+ferric+chloride-induced+arterial+thrombosis+model+of+mice+and+the+role+of+red+blood+cells+in+thrombosis+acceleration.">Characterization of ferric chloride-induced arterial thrombosis model of mice and the role of red blood cells in thrombosis acceleration.</a> Yonsei Medical Journal. 62 (11), 1032-1041 (2021).</li><li>Ghosh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+prothrombotic+potential+of+four-factor+prothrombin+complex+concentrate+(4F-PCC)+in+animal+models.">Evaluation of the prothrombotic potential of four-factor prothrombin complex concentrate (4F-PCC) in animal models.</a> PLoS One. 16 (10), 0258192 (2021).</li><li>Wilbs, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+peptide+FXII+inhibitor+provides+safe+anticoagulation+in+a+thrombosis+model+and+in+artificial+lungs.">Cyclic peptide FXII inhibitor provides safe anticoagulation in a thrombosis model and in artificial lungs.</a> Nature Communications. 11 (1), 3890 (2020).</li><li>Wei, Y., Deng, X., Sheng, G., Guo, X. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rabbit+model+of+cerebral+venous+sinus+thrombosis+established+by+ferric+chloride+and+thrombin+injection.">A rabbit model of cerebral venous sinus thrombosis established by ferric chloride and thrombin injection.</a> Neuroscience Letters. 662, 205-212 (2018).</li><li>Jacob-Ferreira, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antithrombotic+activity+of+Batroxase,+a+metalloprotease+from+Bothrops+atrox+venom,+in+a+model+of+venous+thrombosis.">Antithrombotic activity of Batroxase, a metalloprotease from Bothrops atrox venom, in a model of venous thrombosis.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 95, 263-267 (2017).</li><li>Zhou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rabbit+model+of+cerebral+microembolic+signals+for+translational+research:+preclinical+validation+for+aspirin+and+clopidogrel.">A rabbit model of cerebral microembolic signals for translational research: preclinical validation for aspirin and clopidogrel.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 14 (9), 1855-1866 (2016).</li><li>Yang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+evodiamine+on+collagen-induced+platelet+activation+and+thrombosis.">Effect of evodiamine on collagen-induced platelet activation and thrombosis.</a> BioMed Research International. 2022, 4893859 (2022).</li><li>Li, W., McIntyre, T. M., Silverstein, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ferric+chloride-induced+murine+carotid+arterial+injury:+A+model+of+redox+pathology.">Ferric chloride-induced murine carotid arterial injury: A model of redox pathology.</a> Redox Biology. 1 (1), 50-55 (2013).</li><li>Li, W., Nieman, M., Sen Gupta, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ferric+chloride-induced+murine+thrombosis+models.">Ferric chloride-induced murine thrombosis models.</a> Journal of Visualized Experiments. (115), e54479 (2016).</li><li>Holly, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ether+lipid+metabolism+by+AADACL1+regulates+platelet+function+and+thrombosis.">Ether lipid metabolism by AADACL1 regulates platelet function and thrombosis.</a> Blood Advances. 3 (22), 3818-3828 (2019).</li><li>Bird, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+the+therapeutic+index+of+marketed+anti-coagulants+and+anti-platelet+agents+by+guinea+pig+models+of+thrombosis+and+hemostasis.">Prediction of the therapeutic index of marketed anti-coagulants and anti-platelet agents by guinea pig models of thrombosis and hemostasis.</a> Thrombosis Research. 123 (1), 146-158 (2008).</li></ol>

A aplicação tópica de FeCl3 na vasculatura para induzir trombose é uma técnica amplamente utilizada e tem sido fundamental no estabelecimento de papéis para vários receptores plaquetários, vias de sinalização de ligantes e seus inibidores20,21,22,23. O mecanismo pelo qual a FeCl3 causa trombose é multifacetado; Anteriormente, o desnudamento endotelial era consid...

A trombose é a formação de um coágulo sanguíneo que bloqueia parcial ou completamente um vaso sanguíneo, impedindo o fluxo natural do sangue. Isso leva a eventos cardiovasculares graves e fatais, como doença cardíaca isquêmica e acidentes vasculares cerebrais. As doenças cardiovasculares são a principal causa de morbidade e mortalidade, sendo responsáveis por uma em cada quatro mortes nomundo1,2,3. Embora a trombose se manifeste como um mau funcionamento do sistema vascular, pode ser resultado de uma infecção microbiana ou viral subjacente, distúrbio imunológico, malignidade ou condição metabólica. O fluxo sanguíneo é mantido pela complexa interação entre diversos componentes do sistema vascular, incluindo células endoteliais, hemácias/leucócitos, plaquetas e fatores de coagulação4. Na lesão vascular, as plaquetas interagem com proteínas adesivas na matriz subendotelial e liberam seu conteúdo granular, que recruta mais plaquetas5. Concomitantemente, a cascata de coagulação é ativada, levando à formação e deposição de fibrina. Em última análise, forma-se um coágulo contendo plaquetas e hemácias aprisionadas dentro de uma tela de fibrina6. Embora drogas antiplaquetárias e anticoagulantes estejam disponíveis para modular a trombose, o sangramento espúrio continua sendo uma grande preocupação com essas terapias, exigindo ajuste fino das dosagens e combinações dessas drogas. Assim, ainda é urgente a descoberta de novas drogas antitrombóticas7.
A trombose é estudada usando vários métodos para infligir lesão vascular: mecânica (ligadura do vaso), térmica (lesão a laser) e lesão química (aplicação de FeCl3/Rosa Bengala). A natureza da trombose varia dependendo da localização (arterial vs. venosa), método ou extensão da lesão. Dentre todos esses tipos, a lesão vascular induzida por FeCl3 é o método mais utilizado. Tem sido empregada em camundongos, ratos, coelhos, cobaias e cães 8,9,10,11,12. O método é relativamente simples, fácil de usar e, se os principais parâmetros forem padronizados, é sensível e reprodutível em vários sistemas vasculares (por exemplo, artérias [carótida e femoral], veias [jugular] e arteríolas [cremaster e mesentérica]) (Tabela Suplementar 1).
Este modelo também pode ser usado para aprofundar nossa compreensão da mecânica e morfologia da formação de coágulos. Esta técnica oferece exclusivamente a vantagem de parar a trombose em vários pontos de fluxo, para estudar os estágios intermediários do processo antes que ele se torne oclusivo. Avanços recentes na pesquisa da trombose têm utilizado esse modelo para focar a atenção em métodos não farmacológicos detrombólise13 ou na liberação não invasiva de agentes antitrombóticos e/ou fibrinolíticos14,15. Vários grupos têm demonstrado que, quando as membranas plaquetárias são revestidas com essas terapêuticas, os fármacos podem ser ativados por estimulação térmica para atingir coágulos16. As técnicas aqui descritas podem ser úteis para estudos como a validação de seus achados em nível plaquetário único. Neste manuscrito, o Protocolo 1 descreve o procedimento básico de lesão vascular mediada por FeCl3, enquanto o Protocolo 2 descreve o método de coleta e correção da amostra de lesão vascular para posterior análise por microscopia eletrônica.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.9% Saline&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>BP358-212</td>
			<td>NaCl used to make a solution of 0.9% saline&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Syringe&#160;</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company&#160;</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>190 Proof Ethanol&#160;</td>
			<td>KOPTEC</td>
			<td>V1101&#160;</td>
			<td>Used to make a 70% ethanol solution to use for prepping the mouse for surgery&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,2,2 Tribromoethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>48402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 Yard Black Braided Silk Suture (5-0)</td>
			<td>DEKNATEL</td>
			<td>136082-1204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26G x 3/8 Needle&#160;</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company&#160;</td>
			<td>305110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-methyl-2-butanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>240486</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7.5 mL Transfer Pipet, Graduated to 3 mL</td>
			<td>Globe Scientific Inc.</td>
			<td>135010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol Prep Pads (70% Isopropyl Alcohol)</td>
			<td>Medline</td>
			<td>MDS090735</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Araldite GY 502&#160;</td>
			<td>Electron microscopy Services&#160;</td>
			<td>10900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Dish 35mm X 10mm&#160;</td>
			<td>Corning Incorporated&#160;</td>
			<td>430165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compact Scale&#160;</td>
			<td>Ward&#39;s Science&#160;</td>
			<td>470314-390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Scissors, 12.5 cm long</td>
			<td>World Precision Instrument</td>
			<td>15922-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMP-30 activator&#160;</td>
			<td>Electron microscopy Services&#160;</td>
			<td>13600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dodenyl Succinic Anhydride/ DDSA</td>
			<td>Electron microscopy Services&#160;</td>
			<td>13700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doggy Poo Bags/animal carcass disposal bag</td>
			<td>Crown Products&#160;</td>
			<td>PP-RB-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doppler FlowProbe</td>
			<td>Transonic Systems Inc.</td>
			<td>MA0.5PSB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMBED 812 resin&#160;</td>
			<td>Electron microscopy Services&#160;</td>
			<td>14900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl Alcohol, anhydrous 200 proof&#160;</td>
			<td>Electron microscopy Services&#160;</td>
			<td>15055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye Dressing Forceps, 4&#34; Full Curved, Standard, 0.8mm Wide Tips</td>
			<td>Integra Miltex</td>
			<td>18-784</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Paper&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28310-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors - Sharp-Blunt</td>
			<td>Fine Science Tools&#160;</td>
			<td>14028-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Finger Loop Ear Punches&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools&#160;</td>
			<td>24212-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze Sponges 2&#8221; x 2&#8221; &#8211; 12 Ply&#160;</td>
			<td>Dukal Corporation</td>
			<td>2128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde (10% solution)</td>
			<td>Electron microscopy Services&#160;</td>
			<td>16120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Integra Miltex Carbon Steel Surgical Blade #10</td>
			<td>Integra&#174; Miltex&#174;</td>
			<td>4110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron (III) Chloride&#160;</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>157740-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knife Handle Miltex&#174; Extra Fine Stainless Steel Size 3</td>
			<td>Integra Lifesciences&#160;</td>
			<td>157510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-aspartic acid</td>
			<td>Sigma&#160;Fisher</td>
			<td>&#160;A93100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-aspartic acid</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>BP374-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead Nitrate&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>L-62</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LEICA S8AP0 Microscope</td>
			<td>LEICA</td>
			<td>No longer available</td>
			<td>No longer available from the company</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LEICA S8AP0 Microscope Stand&#160;</td>
			<td>LEICA</td>
			<td>10447255</td>
			<td>No longer available from the company</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light-Duty Tissue Wipers&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82003-822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Dissecting Forceps; 1x2 Teeth, Full Curve; 0.8 mm Tip Width; 4&#34; Length</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument Company</td>
			<td>RS-5157</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium Tetroxide 4% aqueous solution&#160;</td>
			<td>Electron microscopy Services&#160;</td>
			<td>19150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (16% solution)</td>
			<td>Electron microscopy Services&#160;</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium ferricyanide</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>P-8131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propylene Oxide, ACS reagent&#160;</td>
			<td>Electron microscopy Services&#160;</td>
			<td>20401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rainin Classic Pipette PR-10</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17008649</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Research Flowmeter&#160;</td>
			<td>Transonic Systems Inc.</td>
			<td>T402B01481</td>
			<td>Model: T402</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scotch Magic Invisible Tape, 3/4&#34; x 1000&#34;, Clear</td>
			<td>Scotch&#160;</td>
			<td>305289</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Animal Heated Pad</td>
			<td>K&#38;H Manufacturing Inc.</td>
			<td>Model: HM10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Cacodylate Buffer 0.2M, pH7.4</td>
			<td>Electron microscopy Services&#160;</td>
			<td>11623</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Cotton Tipped Applicators&#160;</td>
			<td>Puritan Medical Products&#160;</td>
			<td>25-806 1WC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steromaster Illuminator&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>12-562-21</td>
			<td>No longer available from the company</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Dumont #7 Forceps&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools&#160;</td>
			<td>11271-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiocarbohydrazide (TCH)</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>88535</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal Low Retention Pipet Tip Reloads (0.1-10 &#181;L)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76323-394</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl Acetate</td>
			<td>Electron microscopy Services&#160;</td>
			<td>22400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Veet Gel Cream Hair Remover</td>
			<td>Reckitt Benckiser</td>
			<td>3116875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White Antistatic Hexagonal Weigh Boats, Medium, 64 x 15 x 19 mm</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>S38975</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WinDAQ/100 Software for Windows</td>
			<td>DATAQ Instruments, Inc.</td>
			<td>Version 3.38</td>
			<td>Freely available to download. https://www.dataq.com/products/windaq/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEISS AxioCam Icc 1</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>57615</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ferric chloride-induced arterial thrombosis and sample collection for 3d electron microscopy analysis

As doenças cardiovasculares são uma das principais causas de mortalidade e morbidade em todo o mundo. A trombose aberrante é uma característica comum de condições sistêmicas, como diabetes e obesidade, e de doenças inflamatórias crônicas, como aterosclerose, câncer e doenças autoimunes. Na lesão vascular, geralmente o sistema de coagulação, as plaquetas e o endotélio atuam de forma orquestrada para evitar o sangramento, formando um coágulo no local da lesão. Anormalidades nesse processo levam a sangramento excessivo ou trombose descontrolada/atividade antitrombótica insuficiente, o que se traduz em oclusão do vaso e suas sequelas. O modelo de lesão carotídea induzida por FeCl3 é uma ferramenta valiosa para investigar como a trombose se inicia e progride in vivo. Esse modelo envolve dano endotelial/desnudamento e subsequente formação de coágulos no local lesado. Ele fornece um ensaio quantitativo altamente sensível para monitorar o dano vascular e a formação de coágulos em resposta a diferentes graus de dano vascular. Uma vez otimizada, esta técnica padrão pode ser usada para estudar os mecanismos moleculares subjacentes à trombose, bem como as alterações ultraestruturais nas plaquetas em um trombo crescente. Este ensaio também é útil para estudar a eficácia de agentes antitrombóticos e antiplaquetários. Este artigo explica como iniciar e monitorar a trombose arterial induzida por FeCl3 e como coletar amostras para análise por microscopia eletrônica.

Os dados são geralmente apresentados como tempo para a oclusão, ou tempo necessário para formar um trombo totalmente oclusivo. Esses dados podem ser plotados como uma curva de sobrevida de Kaplan-Meier (Figura 4A)19, um gráfico de pontos com barras mostrando o fluxo sanguíneo terminal no momento da cessação do fluxo sanguíneo ou do término de um experimento (Figura 4B), ou como um gráfico de linhas (Figura 4C).<strong class="xfi...

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Ferric Chloride-Induced Arterial Thrombosis and Sample Collection for 3D Electron Microscopy Analysis

O presente protocolo descreve como usar uma lesão mediada por FeCl3 para induzir trombose arterial e como coletar e preparar amostras de lesão arterial em vários estágios da trombose para análise por microscopia eletrônica.

Trombose Arterial Induzida por Cloreto Férrico e Coleta de Amostras para Análise de Microscopia Eletrônica 3D

Cardiovascular diseases are a leading cause of mortality and morbidity worldwide. Aberrant thrombosis is a common feature of systemic conditions like ...

Com esse método, pode-se determinar quais componentes das plaquetas e do sistema hemostático são importantes para a trombose. Além disso, esse método pode determinar como o crescimento e a arquitetura do trombo são afetados em nível celular. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite uma maneira reprodutível de estudar vários estágios da trombose em nível estrutural.Uma pessoa nova nesta técnica deve evitar o manuseio excessivo do tecido na área cirúrgica. Isso pode levar a sangramento e pode complicar demais a identificação da artéria carótida. Comece a marcar o local da lesão após expor a artéria carótida, circundando vagamente a região entre dois fios cirúrgicos de tamanho 0,1 milímetro.Coloque a sonda sob a artéria distal do fio inferior. Insira a peça plástica sob a artéria entre os dois fios para marcar o local da lesão de cloreto de ferro. Realizar medições de fluxo antes de realizar a lesão para observar o fluxo basal.Realizar a lesão colocando papel de filtro embebido em cloreto de ferro na artéria por três minutos. Remova o papel de filtro após três minutos para evitar a extensão variável da lesão e facilitar a contagem de fluxo pela sonda. Adicione soro fisiológico no local da lesão para remover qualquer excesso de cloreto de ferro residual.Monitore a leitura do fluxo. Quando o fluxo cair abaixo de 50% do valor inicial, remova o teste. Seque rapidamente a área e adicione o fixador para fixar a área da lesão externamente.Em seguida, segure prontamente a artéria próxima à área da lesão com pinças. Corte a jusante da rosca inferior e a montante da linha superior. Coloque o tecido na placa de cultura de tecido plástico na mesma orientação em que foi coletado e adicione algumas gotas do fixador.Usando um bisturi, limpe o tecido extra ao redor da artéria. Certifique-se de registrar a orientação do fluxo sanguíneo cortando uma extremidade horizontalmente e a outra afunilando ou oblíqua. Colocar a amostra no fixador durante uma hora à temperatura ambiente e, em seguida, armazenar a amostra em paraformaldeído a 1% a 4 graus Celsius até a enviar para gelo húmido para análise por microscopia electrónica.Os dados foram plotados como uma curva de sobrevida de Kaplan-Meier, um gráfico de pontos com barras mostrando o fluxo sanguíneo terminal no momento da cessação do fluxo sanguíneo ou do término de um experimento, ou como um gráfico de linhas. O fluxo sanguíneo aumentou subitamente em alguns casos após uma diminuição gradual por alguns minutos, indicando excreção parcial do trombo em crescimento, e foi considerado um evento de embolização. A morfologia do trombo oclusivo também foi estudada por este método.A pronta coleta da amostra durante o processo de trombose é o passo mais importante, uma vez que a demora nesse processo pode levar a interpretações errôneas de nossa análise estrutural.

Research

JoVE Journal

Medicine

Quantitative Analysis and Characterization of Atherosclerotic Lesions in the Murine Aortic Sinus

Atherosclerosis is a disease of the large arteries and a major underlying cause of myocardial infarction and stroke. Several different mouse models have ...

Medicina

Orthotopic Injection of Breast Cancer Cells into the Mammary Fat Pad of Mice to Study Tumor Growth.

Injeção Orthotopic de células cancerosas da mama na mamária Fat Pad de Ratos para o Estudo de crescimento tumoral.

Breast cancer growth can be studied in mice using a plethora of models. Genetic manipulation of breast cancer cells may provide insights into the ...

Ferric Chloride-induced Thrombosis Mouse Model on Carotid Artery and Mesentery Vessel

Férrico Thrombosis Modelo rato na artéria carótida e Mesentery Vessel induzida por Chloride

Severe thrombosis and its ischemic consequences such as myocardial infarction, pulmonary embolism and stroke are major worldwide health issues. The ferric ...

Ferric Chloride-induced Murine Thrombosis Models

Férricos induzida pelo cloreto modelos murinos Trombose

Arterial thrombosis (blood clot) is a common complication of many systemic diseases associated with chronic inflammation, including atherosclerosis, ...

3D Whole-heart Myocardial Tissue Analysis

Análise Tecidos do Miocárdio Whole-coração 3D

Cardiac regenerative therapies aim to protect and repair the injured heart in patients with ischemic heart disease. By injecting stem cells or other ...

Quantitative Visualization of Leukocyte Infiltrate in a Murine Model of Fulminant Myocarditis by Light Sheet Microscopy

Visualização Quantitativa de Infiltrado de Leucócitos em um Modelo Murino de Miocardite Fulminante por Microscopia de Folha de Luz

Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), in combination with chemical clearing protocols, has become the gold standard for analyzing fluorescently ...

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

preparação e<em&gt; In Vitro</em&gt; Caracterização de magnetizado miR-modificado Células Endoteliais

To date, the available surgical and pharmacological treatments for cardiovascular diseases (CVD) are limited and often palliative. At the same time, gene ...

Intravital Microscopy of Monocyte Homing and Tumor-Related Angiogenesis in a Murine Model of Peripheral Arterial Disease

Microscopia intravital de monócitos Homing e angiogênese relacionados ao Tumor em um modelo murino de Doença Arterial periférica

The therapeutic goal for peripheral arterial disease and ischemic heart disease is to increase blood flow to ischemic areas caused by hemodynamic ...

Ferric Chloride-induced Canine Carotid Artery Thrombosis: A Large Animal Model of Vascular Injury

Trombose da artéria carótida canino induzida por cloreto férrico: Um modelo Animal grande de lesão Vascular

Occlusive arterial thrombosis leading to cerebral ischemic stroke and myocardial infarction contributes to ~13 million deaths every year globally. Here, ...

Immunofluorescence Labelling of Human and Murine Neutrophil Extracellular Traps in Paraffin-Embedded Tissue

Rotulagem de imunofluorescência de armadilhas extracelulares de neutrófilos humanos e murinos em tecido embebido em parafina

Neutrophil granulocytes, also called polymorphonuclear leukocytes (PMN) due to their lobulated nucleus, are the most abundant type of leukocytes. They ...