Name: scalable transfection of maize mesophyll protoplasts
Uploaded: 2023-06-23T12:10:00
Duration: 8 min 38 s
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이 연구는 국립 인간 게놈 연구소 게놈 과학 학제 간 교육 (T32 교육 보조금 번호 HG000035 to J.T.) 및 국립 보건원 (NIGMS 1R35GM139532 to C.Q.) 및 국립 과학 재단 (RESEARCH-PGR IOS-1748843 및 PlantSynBio 2240888 to CQ). 옥수수 씨앗을 선물해 주신 Rutgers University의 Andrea Gallovatti에게 감사드립니다.

1. 식물 재료의 성장
<ol><li>옥수수 알갱이를 수돗물로 두 번 헹굽니다. 커널을 실온에서 밤새 수돗물에 담그십시오.</li>
	<li>다음날, 72 셀 종자 스타터 트레이에 젖은 1 : 1 질석 : 이탄 이끼를 채 웁니다. 커널을 한 번 헹구고 셀당 하나의 커널을 끝 캡을 아래로 심습니다.</li>
	<li>25 °C의 장시간 조건(16시간 조명, 8시간 어둠)에서 3일 동안 성장시킵니다.</li>
	<li>25 °C의 일정한 어둠으로 옮기고 9-11일 동안 자랍니다.</li>
</ol>2. 플라스미드 분리
<ol><li>상업적으로 화학적으로 유능한 E. coli 를 제조업체의 지침에 따라 관심 있는 플라스미드로 변형합니다.</li>
	<li>형질전환된 대장균 을 적절한 항생제와 함께 50 mL의 액체 LB 배지에서 37°C에서 하룻밤 동안 진탕하면서 성장시킨다.</li>
	<li>상온에서 3,000 x g에서 10분 동안 원심분리하여 대장균을 펠렛화한다. 시판되는 midiprep 플라스미드 DNA 분리 키트를 사용하여 플라스미드를 추출한다.</li>
	<li>마이크로볼륨 분광광도계를 사용하여 플라스미드 DNA 농도를 추정합니다. 참고: 형질주입에 적합한 물질은 ≥800ng/μL의 농도와 A260/A280이 ≥1.8이어야 합니다.</li>
</ol>3. 원형질체 분리
<ol><li>효소 용액 20mL를 준비합니다.<ol><li>만니톨 2.18g, 셀룰라아제 R-10 0.30g, 마세로자임 R-10 0.06g을 50mL 원심분리기 튜브에 넣습니다. 분말을 혼합하기 위해 뒤집습니다. 탈이온화된H2O15 mL를 첨가한다. 200μL의 1M MES, pH 5.7을 추가합니다. 소용돌이 섞는다.</li>
		<li>용액을 55°C에서 10분 동안 가열합니다. 실온에서 10분간 식힌다.</li>
		<li>1MCaCl2 20μL, 소 혈청 알부민 0.02g, 1M β-메르캅토에탄올 100μL를 추가합니다.</li>
		<li>탈이온화된 H 2O로 20mL를 채우고호일로 감싼 250mL 비커에 붓습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>어둠 속에서 옥수수 묘목을 꺼내십시오. 새 면도날을 사용하여 토양 위로 몇 센티미터 자릅니다. 절단 끝을 물에 넣으십시오. 사용하지 않을 때는 실온의 어두운 곳에 보관하십시오.</li>
	<li>각 묘목의 두 번째 및 세 번째 잎을 선택하고 갈색 또는 손상된 부분이있는 잎을 제외하도록주의하십시오. 12-16 잎을 선택하십시오. 각 잎의 끝에서 ~ 1cm를 잘라내어 버립니다. 그런 다음 각 잎에서 10cm 부분을 자릅니다. 알림: 더 많은 조직이 필요한 경우 추가 20mL 비커에 250mL 용량의 효소 용액을 추가로 사용하십시오. 주어진 양의 효소 용액에 잎 물질이 너무 많으면 생존력이 떨어질 수 있습니다.</li>
	<li>기초 끝을 함께 사용하여 잎 부분을 서로 겹쳐 쌓습니다. Clamp 바인더 클립을 사용하여 베이스 끝에서 번들을 함께 고정합니다. 흰 종이 위에 나뭇잎 묶음을 놓습니다.</li>
	<li>말단부에서 ~1cm 떨어진 곳에 나뭇잎을 잡습니다. 새 면도날을 사용하여 정맥에 수직 인 말단부에서 잎을 얇은 (0.5-1mm) 조각으로 자릅니다. 똑바로 자르지 말고 조직을 통해 짧고 앞으로 슬라이스하십시오.<ol><li>눈에 보이는 잔여물이 종이에 쌓이기 시작할 때마다 면도날을 교체하십시오. 눈에 보이는 잔류 물은 무딘 칼날이나 열악한 기술로 인해 조직이 으깬 것을 나타냅니다.</li>
	</ol></li>
	<li>잎 다발 길이의 ~2cm를 자른 후 즉시 슬라이스를 효소 용액 비커로 옮깁니다. 재료가 마르지 않도록하면 얻은 원형질체의 수가 줄어들 수 있습니다. 효소 용액을 부드럽게 소용돌이 치면서 재료를 적십니다.<ol><li>빛을 차단하기 위해 비커 위에 호일 뚜껑을 놓습니다. 전체 번들이 바인더 클립 가까이에서 절단될 때까지 슬라이스 및 이송 과정을 반복합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>효소 용액 비커를 벨 항아리에 옮깁니다. 실온에서 3분 동안 주변 압력에 대해 -50.8kPa에서 -67.7kPa 사이의 진공 침투.</li>
	<li>비커토를 탁상용 셰이커로 옮깁니다. 실온에서 40RPM으로 2.5시간 동안 흔들어 줍니다. 손으로 비커를 부드럽게 휘젓습니다. 완전히 소화되면 효소 용액이 약간 유백색으로 보입니다. 용액이 여전히 맑으면 40RPM에서 최대 1시간 동안 계속 흔들어줍니다. 3.5 시간을 초과하지 마십시오.</li>
	<li>소화하는 동안 만니톨 + MES + MgCl2 (MMG) 용액, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 용액 및 배양 용액을 만듭니다.<ol><li>MMG: 5.47 mL의 만니톨, 200 μL의 1 M MES, pH 5.7 및 750 μL의 1 MMgCl2 를 50 mL 원심분리 튜브에 넣는다. 증류된H2O로 50 mL를 채우고 Vortex를 용해시킨다. 얼음 위에 놓습니다.</li>
		<li>배양 용액: 5.47 mL 원심분리기 튜브에 만니톨 5.47 g, pH 5.7에서 1 M MES 200 μL, 1 M KCl 200 μL를 추가합니다. 증류된H2O로 50 mL를 채우고 Vortex를 용해시킨다. 얼음 위에 놓습니다.</li>
		<li>PEG 용액: 0.44g의 만니톨, 1.0g의 PEG 및 400μL의 1MCaCl2 를 15mL 원심분리기 튜브에 추가합니다. 증류된H2O로 4 mL를 채우고 Vortex를 혼합합니다. 완전히 용해될 때까지 30분 동안 진탕하면서 37°C에서 배양합니다. 실온에서 보관하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>효소 용액을 실온에서 80RPM으로 10분 동안 흔든다.</li>
	<li>효소 용액이 담긴 비커를 얼음 위에 놓습니다. 호일 덮개를 제거하지 마십시오. 효소 용액에 얼음처럼 차가운 MMG 20mL를 넣습니다. 40μm 셀 스트레이너를 통해 50mL 원심분리기 튜브로 여과합니다. 알림: PEG가 추가될 때까지 다음 단계를 위해 모든 용액을 얼음 위에 보관하십시오. 빛 노출을 최소화하기 위해 원형질체를 호일로 덮으십시오.</li>
	<li>여과액을 각각 10mL의 동일한 부피로 나눕니다. 각 부피를 둥근 바닥 유리 원심분리기 튜브에 붓고 실온에서 100 x g 에서 4분 동안 회전시킵니다.</li>
	<li>상층액을 버리고 각 튜브에 얼음처럼 차가운 MMG 1mL를 추가합니다. 튜브를 부드럽게 휘젓고 두드려 펠릿을 다시 매달아 놓습니다. 샘플을 하나의 둥근 바닥 유리 원심분리기 튜브에 결합합니다. MMG를 총 부피 5mL에 추가합니다. 실온에서 100 x g 에서 3분 동안 회전합니다.</li>
	<li>5mL의 MMG로 세척하고 실온에서 100 x g 에서 3분 동안 회전시킵니다.</li>
	<li>5mL의 MMG로 세척을 반복하고 실온에서 100 x g 에서 3분 동안 회전시킵니다. 두 번째 세척을 한 후 상층액이 깨끗한지 관찰합니다. 계속 흐리면 세 번째 세탁을 수행하십시오.</li>
	<li>원형질체를 MMG 1mL에 재현탁합니다. 호일로 느슨하게 덮고 얼음 위에 보관하십시오.</li>
	<li>원형질체 수율을 결정하고 생존력을 확인하십시오.<ol><li>1.5mL 미세원심분리기 튜브에 4μL의 원형질체와 72μL의 MMG를 함께 추가합니다.</li>
		<li>1.5mL 미세원심분리기 튜브에서 0.5% 플루오레세인 디아세테이트(FDA) 원액 1μL를 MMG 49μL에 넣어 20배 작업 용액을 만듭니다. 희석된 원형질체가 있는 튜브에 4μL의 FDA 작업 용액을 추가합니다. 실온의 어두운 곳에서 5분 동안 배양합니다.</li>
		<li>원형질체 혼합물 11μL를 혈구계에 로드합니다. 명시야 현미경 아래에 놓습니다. 세포에 세포벽이 없는지 육안으로 확인하십시오. 그런 다음 원형질체의 수를 세십시오. 이 개수를 사용하여 얻은 원형질체의 총 수를 추정합니다. 그런 다음 FDA로 염색할 때 자외선 아래에서 녹색으로 형광을 발하는 원형질체의 수를 계산합니다. 성공적인 원형질체 분리는 70%-90%의 생존율을 산출합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>4. PEG 매개 형질감염
<ol><li>3.17단계에서 추정된 원형질체 농도부터 시작하여 ~10,000 원형질체/μL로 조정합니다. 농도가 낮으면 100 x g에서 3분 동안 원심분리하고 MMG에서 ~10,000 protoplasts/μL의 농도로 재현탁합니다.</li>
	<li>1,000,000 mL 미세 원심 분리기 튜브에서 ~ 15 μg의 DNA와 1.5 개의 원형질체를 혼합합니다. 혼합물을 MMG로 114.4μL로 채우고 얼음에서 30분 동안 배양합니다.</li>
	<li>튜브의 측면을 두드려 원형질체를 다시 일시 중단합니다. 105.6 μL의 25 % PEG 용액을 원형질체에 첨가하여 12 % PEG의 최종 중량 / 부피에 도달합니다. 5-10회 뒤집어서 부드럽게 섞습니다. PEG 용액의 원형질체는 깨지기 쉽습니다. 튜브를 흔들지 마십시오. 실온의 어두운 곳에서 10분 동안 배양합니다. 참고: transfection은 4.2단계와 4.3단계에서 제공된 볼륨의 배수로 확장할 수 있습니다. 예를 들어, 1,000만 개의 원형질체와 150μg의 DNA를 1,444μL의 MMG에 현탁하고 50mL 원심분리기 튜브에서 1,056μL PEG 용액으로 처리할 수 있습니다.</li>
	<li>5 부피의 배양 용액으로 희석하십시오. 반전으로 부드럽게 혼합하십시오. 실온에서 100 x g에서 4분 동안 회전합니다. 알림: 스케일 업하는 경우 원형질체를 각각 10mL 이하가 포함된 여러 개의 둥근 바닥 유리관으로 분할하여 완전한 펠릿화를 보장합니다. 세척에 사용되는 배양 용액 부피를 비례적으로 늘립니다.</li>
	<li>피펫팅으로 상청액을 제거합니다. 1-5 mL의 배양 용액으로 세척하고 실온에서 100 x g 에서 3 분 동안 회전시킨다.</li>
	<li>배양 용액에서 원형질체를 500-1,000 cells/μL의 농도로 재현탁합니다.</li>
	<li>원형질체를 실온에서 하룻밤(~16시간) 어둠 속에서 배양합니다.</li>
</ol>5. 원형질체 회수 및 발현 확인
<ol><li>실온에서 100 x g에서 4분 동안 원형질체를 회전시킵니다. 알림: 스케일 업하는 경우 원형질체를 각각 10mL 이하가 들어 있는 여러 개의 둥근 바닥 유리관으로 나눕니다.</li>
	<li>1-5 mL의 배양 용액으로 세척하고 실온에서 100 x g 에서 3 분 동안 회전시킨다.</li>
	<li>재현탁하고 1-5mL의 배양 용액에 결합합니다.</li>
	<li>원형질체가 형광 리포터 유전자(예: GFP)로 형질감염되는 경우, 형질주입 효율을 확인하기 위해 분취량을 취합니다. 혈구계를 사용하여 먼저 명시야 광 현미경을 사용하여 원형질체의 총 수를 계산합니다. 그런 다음 자외선 하에서 형광 원형질체의 비율을 계산합니다.</li>
	<li>원형질체를 실온에서 100 x g 에서 3분 동안 원심분리합니다. 참고: 원형질체는 이제 페놀 및 구아니딘 이소티오시아네이트를 사용한 RNA 추출과 같은 다운스트림 응용 분야에 사용할 준비가 되었습니다.</li>
</ol>

<ol>
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저자는 경쟁 이익을 선언하지 않습니다.

이전에 보고된 바와 같이, 원형질체에 사용되는 식물 재료의 품질은 고품질 원형질체(16,17,18)를 얻기 위해 필수적이다. 흠집이 없는 건강한 잎을 선택하는 것이 중요합니다. 이 작품은 인기있는 연구 옥수수 품종 B73을 사용했습니다. 우리는 다른 품종을 테스트하지 않았습니다. 이 프로토콜에 사용된 옥수수 묘목은 에티올레이트된 잎이 녹색 잎의 원형질체에 비해 형질감염 후 16시간 후에 더 큰 생존력을 가진 원형질체를 생성하기 때문에 어둠 속에서 재배되었습니다. 하룻밤 배양이 필요하지 않은 응용 분야의 경우 녹색 또는 녹화 잎 재료를 사용할 수 있습니다.
중요한 단계는 효소 소화 전에 잎 재료를 얇은 조각으로 적절하게 자르는 것입니다. 이 과정은 중엽 세포가 효소 용액에 노출되는 표면적을 증가시켜 회수된 원형질체의 수를 증가시킵니다. 말단 잎 끝은 버리고 얇은(≤1mm) 조각을 새 면도날로 자르고 무뎌지기 시작하면 즉시 교체합니다. 주어진 양의 조직에 대해 더 얇은 조각은 잎의 분쇄를 최소화하기 위해 올바른 기술을 사용하는 경우 더 많은 원형질체를 생성합니다.
원형질체는 세포벽 제거 후 매우 섬세하기 때문에 올바르게 세척하는 것도 중요합니다. 소화 후, 모든 용액은 얼음 위에 보관되고, 어둠 속에서 자란 원형질체는 빛으로부터 보호됩니다. 삼투압 및 pH는 MMG 용액에서 세척을 수행하여 완충된다. 덜 조밀 한 세포 파편으로부터 원형질체를 분리하기 위해, 원심 분리는 100 x g에서 일어난다. 200 x g 에서 원심분리된 원형질체는 분리 후 유사한 생존력을 나타내지만 다음 날 생존율이 낮아지며 약 절반도 변형됩니다. 분리 직후 FDA(fluorescein diacetate)로 염색하여 원형질체의 생존력을 확인하는 것이 좋습니다. 정상적인 생존율 범위는 70%-90%입니다. 분리 후 생존율이 40% 미만인 원형질체는 형질전환체를 거의 생성하지 않습니다.

펠렛화 및 세척은 형질감염 후 명확하게 보이는 펠릿을 얻을 수 있기 때문에 많은 원형질체로 작업할 때 더 쉽습니다. 이러한 이유로 형질주입은 100만 개 이상의 원형질체로 수행됩니다. 프로토콜을 확장할 때 배양 단계(1.5mL, 15mL 또는 50mL 원심분리기 튜브)에 적합한 크기의 용기를 선택하고 세척 단계에 사용되는 용액의 부피를 그에 따라 조정해야 합니다. 어쨌든, 원형질체가 상청액에 남아 있지 않도록 하기 위해 ≤10mL 분취량으로 원심분리하는 것이 유리합니다. 이 프로토콜의 한 가지 혁신은 다른 프로토콜14,19에 나열된 W5 용액에서 1시간 배양 및 세척 단계를 제거하는 것인데, 이는 우리 손에 불필요한 것으로 판명되었습니다.
다른 연구에서 볼 수 있듯이, DNA의 양과 질은 모두 성공적인 형질감염에 매우 중요하다19. 4-6kb 범위의 플라스미드의 경우 원형질체 100만 개당 15μg의 DNA가 사용됩니다. 품질이 좋지 않은 DNA 제제는 형질감염 후 생존력이 감소할 수 있으므로 박테리아에서 플라스미드를 분리할 때 상용 DNA 추출 키트를 사용하는 것이 좋습니다. 원형질체를 하룻밤 동안 배양하는 것은 스트레스를 최소화하면서 플라스미드 또는 플라스미드 라이브러리의 전사를 허용하기 위해 어두운 곳에서 실온에서 수행됩니다. 하룻밤 배양 후, 원래 형질감염된 원형질체의 수의 약 절반이 회수됩니다. 원형질체는 하룻밤 배양을 위해 500-1,000 cells/μL의 농도로 희석됩니다. 1,000 cells/μL 이상의 농도로 밤새 배양하도록 방치된 원형질체는 회수율이 낮고 생존력이 낮습니다. 더 높은 농도에서, 손상되고 죽은 원형질체로부터의 파편은 인접한 원형질체의 죽음에 기여할 수 있다. 하룻밤 배양 후 원형질체를 세척하는 것은 이러한 찌꺼기를 제거하고 과량의 플라스미드를 제거하는 역할을 한다.
이와 같은 프로토콜은 모든 식물 종 또는 조직 유형이 원형질에 복종할 수 있는 것은 아니라는 한계를 가지고 있습니다. 또한, 유전자 발현 차이는 원형질체 과정에 의해 유도될 수 있다.
요약하면, 우리는 주요 농작물 Z. mays에서 수백만 개의 생존 가능한 원형질체를 분리하고 형질주입하기 위한 간단하고 확장 가능한 프로토콜을 자세히 설명했습니다. 이 방법은 PEG를 사용하여 더 많은 원형질체를 형질주입할 수 있으며, 형질전환 효율은 전기천공 기반 방법(electroporation based method)과 거의 비슷하다(15). 형질전환체의 순 수가 많을수록 대규모 병렬 리포터 분석(12,13)과 같은 대규모 실험에서 수백 또는 수천 개의 구축물을 테스트할 수 있습니다. 옥수수에 대한 미래의 게놈 규모 실험을 통해 과학자들은 옥수수 유전자 발현과 유전자 조절을 더 잘 이해할 수 있습니다.

일시적인 유전자 발현은 식물 생물학에서 강력한 도구입니다. 그러나 식물 세포는 세포벽으로 둘러싸여 있기 때문에 형질 주입이 어렵습니다. DNA 진입에 대한 이러한 장벽은 포유류 또는 곤충 세포와 같이 일반적으로 연구되는 다른 세포 유형에는 존재하지 않습니다. 과거 연구에서는 세포벽이 소화되고 제거된 식물 세포인 원형질체를 사용하여 이 문제를 해결했습니다. 처리되지 않은 잎 조직과 달리, 식물 원형질체는 현탁액에서 작업하기 쉽고 전기천공 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)에 의해 매개되는 형질주입 기술에 적합합니다1. 식물 세포는 세포벽 제거 후에도 많은 기능을 유지합니다. 따라서, 원형질체는 유전자 및 단백질 기능을 연구하기 위해 다양한 식물에서 사용된다2,3, 신호 전달4을 이해하고, 식물 육종5을 위한 가능한 표적을 식별하기 위해. 원형질체는 또한 밀과 감자를 포함한 다양한 작물 종에서 게놈 편집 구조를 스크리닝하기 위한 편리한 수단입니다 6,7. 요컨대, 원형질체의 일시적인 분석은 농업 생명 공학에 없어서는 안될 필수 요소입니다.
옥수수 (Zea mays L.)는 톤수 기준으로 세계 최고의 곡물 작물입니다. 따라서 기초 및 응용 식물 과학 연구8의 주요 초점입니다. 그러나 니코티아나 타바쿰9와 같은 모델 식물과 달리 온전한 옥수수 잎에서 일시적인 이식유전자 발현은 일상적으로 수행되지 않습니다. 원형질성형체는 옥수수 잎 엽엽 세포10,11을 획득하고 형질감염시키는데 사용되었다. 이전의 방법은 전기천공법을 사용하여 최대 75%의 형질주입 효율을 달성했으며 수만 개의 규모로 형질주입된 원형질체를 생성했습니다10,15.
이 프로토콜은 수백만 개의 옥수수 중엽 세포를 원형질화하고 이전 방법과 비교할 수 있는 효율성으로 형질감염시키는 방법을 자세히 설명합니다. 주요 단계는 침식된 옥수수 묘목을 재배하고, 잎 조직을 수확하고, 식물 세포벽을 소화하고, PEG를 사용하여 플라스미드 DNA를 세포에 전달하는 것입니다. 이 프로토콜의 주요 기여는 기능적 분석에 필요한 세포 생존율을 유지하면서 원형질체 형질주입을 확장할 수 있다는 것입니다. 이를 통해 옥수수 게놈 전체에서 수십만 개 영역의 기능을 테스트할 수 있는 대규모 병렬 리포터 분석과 같은 게놈 규모 실험을 사용할 수 있습니다. 이 방법은 최근 인핸서 및 프로모터를 포함한 시스-조절 DNA 요소의 대규모 라이브러리를 조사하는 데 사용되었습니다12,13,14.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL graduated microcentrifuge tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>490004-444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Falcon conical centrifuge tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>05-527-90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 mL Pyrex glass beaker</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>50-121-5005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 um nylon mesh cell strainer</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22363547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>72 cell propagation tray</td>
			<td>T.O. Plastics</td>
			<td>725607C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum foil</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89107-732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bell jar</td>
			<td>Bel-Art</td>
			<td>F42022-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6250-250ML</td>
			<td>Dissolve in ultrapure H2O to make a 1M stock solution. Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate (CaCl2*2H2O)</td>
			<td>PhytoTech Labs</td>
			<td>C135</td>
			<td>Dissolve in ultrapure H2O to make a 1M stock solution. Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulase Onozuka R-10</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>C8001.0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Mannitol</td>
			<td>PhytoTech Labs</td>
			<td>M562</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scope</td>
			<td>Reichert</td>
			<td>Microstar IV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein Diacetate (FDA)</td>
			<td>Thermofischer Scientific</td>
			<td>F1303</td>
			<td>Dissolve in acetone at 0.5% weight/volume to make a 1000X stock solution. Protect from light and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Illumination Systems</td>
			<td>Prior</td>
			<td>Lumen200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MDG36</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-capacity centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macerozyme</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>M8002.0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride (MgCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M292-1KG</td>
			<td>Dissolve in ultrapure H2O to make a 1M stock solution. Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maize seeds</td>
			<td>B73</td>
			<td>USDA-ARS</td>
			<td>https://npgsweb.ars-grin.gov/gringlobal/accessiondetail?accid=PI+550473</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium binder clip</td>
			<td>Uline</td>
			<td>S-24649</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M5287-250G</td>
			<td>Dissolve in ultrapure H2O to make a 1M stock solution. Adjust pH to 5.7 using KOH. Protect from light and store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette 20-200 uL</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F123601G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop microvolume spectrophotometer</td>
			<td>Thermofischer Scientific</td>
			<td>ND-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB 5-alpha competent E. coli</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>C2987H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer hemocytometer</td>
			<td>Daigger Scientific</td>
			<td>EF16034F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>No. 9 Single-edge razor blade</td>
			<td>Excel</td>
			<td>20009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89032-104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(ethylene) glycol 4,000</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>81240-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541-1KG</td>
			<td>Dissolve in ultrapure H2O to make a 1M stock solution. Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Professional Grade Vermiculite</td>
			<td>NK Lawn &#38; Garden</td>
			<td>G208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round-bottom glass centrifuge tube 30 mL</td>
			<td>Kimble Chase</td>
			<td>45500-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber adapter for Corex centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS8445AO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sphagnum peat moss</td>
			<td>Premier Horticulture</td>
			<td>0128P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>Thermofischer Scientific</td>
			<td>15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon vacuum tubing</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76336-844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum gauge</td>
			<td>Wika</td>
			<td>4269978</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

scalable transfection of maize mesophyll protoplasts

옥수수 중엽엽 세포의 형질감염은 종종 식물 세포벽을 소화하여 원형질체를 생성한 다음 전기천공 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 통해 DNA를 삽입하는 것을 포함합니다. 이전의 방법은 수만 개의 형질주입된 원형질체를 한 번에 생산하기 위해 개발되었습니다. 여기에서 우리는 옥수수에서 수백만 개의 잎 엽엽 원형질체를 분리하고 형질감염시키는 간단한 방법을 설명합니다(Zea mays L.). 이 간소화된 프로세스는 W5 세척과 같은 특정 일반적인 원형 성형 단계를 제거합니다. 또한 원심분리, PEG 매개 형질감염 및 배양과 같은 단계가 더 많은 수의 원형질체와 함께 작동하도록 수정되었습니다. 플라스미드 구조의 대규모 라이브러리를 발현하는 능력은 옥수수의 대규모 병렬 리포터 분석과 같은 게놈 규모의 실험을 가능하게 합니다.

원형질체 분리에 가장 적합한 조직은 10-11일 된 묘목의 두 번째 및 세 번째 잎입니다(그림 1). 이 연구에서 우리는 각각 길이가 10cm 인 16 개의 잎 섹션에서 약 1,000 만 개의 원형질체를 얻었습니다. 분리된 원형질체의 수는 잎 물질의 질량과 효소 용액에서 소화되는 잎 조각의 너비에 따라 달라집니다.
명시야 현미경에서 손상되지 않은 원형질체는 대략 구형으로 보이며 색소체가 표면에 얼룩이 있습니다(그림 2A). 형질감염을 진행하기 전에, 원형질체의 작은 분취량을 플루오레세인 디아세테이트(FDA)로 염색하여 생존력을 확인할 수 있습니다. 자외선 하에서 형광을 발하는 FDA 염색 원형질체는 실행 가능한 것으로 간주됩니다(그림 2B, C). 손상되지 않은 것으로 보이는 모든 원형질체가 여전히 생존 가능한 것은 아니며 일부 생존 가능한 원형질체는 대피에 의해 죽어가는 과정에 있을 수 있습니다(그림 2C). 이 세포에서 액포는 부풀어 오르고 결국 세포막에서 배출됩니다.
그림 3은 CD3-911(ABRC)15에서 유래한 4.3kb 옥수수 발현 플라스미드인 pJT01로 형질전환된 원형질체를 보여줍니다. 형질감염은 c-Myc의 C-말단 핵 국소화 신호로 태그된 sGFP의 발현을 초래합니다(그림 3A). sGFP 발현 원형질체의 비율은 혈구계를 사용하여 여러 실험에 걸쳐 측정되었습니다. 이 방법에 의해 달성된 중간 형질주입 효율은 하룻밤 배양 후 40%였으며(n=9, 그림 4, 표 1), 이는 이전에 공개된 방법15와 유사합니다. 실험 용도에 따라 플라스미드 또는 플라스미드 라이브러리에 형광 리포터가 없는 경우 형질감염을 확인하기 위해 양성 대조군을 포함하는 것이 좋습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64991/64991fig01.jpg"> 그림 1: 발아 후 10일 동안 어둠 속에서 자란 대표적인 에티올레이트 옥수수 묘목. 화살표는 protoplasting에 가장 적합한 두 번째 및 세 번째 잎을 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64991/64991fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64991/64991fig02.jpg"> 그림 2: 분리 후 원형질체 생존율의 형광 현미경. (A) 분리 직후 원형질체의 명시야 이미지. (B) FDA 염색 원형질체의 형광 신호. (C) 생존 가능한 원형질체를 보여주는 명시야와 형광의 겹침. 화살표는 대피하는 원형질체를 보여줍니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64991/64991fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64991/64991fig03.jpg"> 그림 3: sGFP로 형질감염된 원형질체의 형광 현미경. (A) 형질감염 후 원형질체의 명시야 이미지. (B) GFP 채널에서 형질주입된 원형질체의 형광 신호. (C) 형질전환된 원형질체를 보여주는 명시야와 형광의 중첩. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64991/64991fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64991/64991fig04.jpg"> 그림 4: 배양 16시간 후 GFP 형광을 나타내는 원형질체의 백분율. 형질주입 효율은 독립적인 시험에 따라 다양했으며, 가장 낮은 효율은 약 20%, 가장 높은 효율은 50%에 가까웠다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64991/64991fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>재판</td>
			<td>계수된 GFP 세포</td>
			<td>계산된 총 셀 수</td>
			<td>GFP 백분율</td>
		</tr><tr><td>1</td>
			<td>104</td>
			<td>261</td>
			<td>39.8</td>
		</tr><tr><td>2</td>
			<td>148</td>
			<td>298</td>
			<td>49.5</td>
		</tr><tr><td>3</td>
			<td>84</td>
			<td>258</td>
			<td>32.6</td>
		</tr><tr><td>4</td>
			<td>137</td>
			<td>271</td>
			<td>50.6</td>
		</tr><tr><td>5</td>
			<td>127</td>
			<td>299</td>
			<td>42.5</td>
		</tr><tr><td>6</td>
			<td>107</td>
			<td>235</td>
			<td>45.5</td>
		</tr><tr><td>7</td>
			<td>83</td>
			<td>360</td>
			<td>23.1</td>
		</tr><tr><td>8</td>
			<td>134</td>
			<td>549</td>
			<td>24.4</td>
		</tr><tr><td>9</td>
			<td>61</td>
			<td>201</td>
			<td>30.3</td>
		</tr><tr><td>의미하다</td>
			<td>109</td>
			<td>304</td>
			<td>36</td>
		</tr><tr><td>표준 편차</td>
			<td>29</td>
			<td>102</td>
			<td>10</td>
		</tr></tbody></table>표 1: 대표적인 원형질체 형질주입 효율. 저자의 실험실에서 최근 9 건의 프로토 플라스트라스트 시험 데이터.
보충 파일 1: pJT01 시퀀스가 있는 GenBank 형식의 텍스트 파일. 4.3kb sGFP 발현 플라스미드는 형질감염된 옥수수 원형질체에서 양성 대조군 역할을 합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64991/pJT01_gfp_cmyc.gb.zip" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Scalable Transfection of Maize Mesophyll Protoplasts at JoVE.com

Scalable Transfection of Maize Mesophyll Protoplasts

여기에서 우리는 옥수수 중엽 세포에서 플라스미드의 대규모 라이브러리를 테스트하기 위해 수백만 개의 옥수수 원형질체를 일시적으로 형질감염시키는 고처리량 프로토콜을 제시합니다.

옥수수 중엽 원형질체의 확장 가능한 형질감염

The transfection of maize mesophyll cells often involves digesting the plant cell walls to create protoplasts and then inserting DNA via electroporation ...

Hello.Today 우리는 수백만 개의 옥수수 중엽 세포를 원형질화하고 고효율로 변형시키는 프로토콜을 보여줄 것입니다. 프로토콜의 주요 단계는 먼저 식물 세포벽을 소화 및 제거하고 원형질체를 방출한 다음 PEG를 사용하여 원형질체를 형질전환시키는 것입니다. 이 프로토콜과 다른 프로토콜의 가장 큰 차이점은 변환의 규모입니다.대부분의 프로토콜은 1, 000에서 10, 000 사이의 형질전환된 원형질체로 끝납니다. 그러나 우리의 프로토콜은 수백만 개의 변형 된 옥수수 원형질체를 제공합니다. 여기에 발아 후 9-11 일 동안 어둠 속에서 자란 옥수수 묘목이 있습니다.묘목을 토양 수준 바로 위에 자르고 물에 넣으십시오. 사용하지 않을 때는 식물을 어둠 속에 보관하십시오. 각 묘목의 두 번째 및 세 번째 잎을 선택하고 갈색 또는 손상된 부분이있는 잎을 제외하도록주의하십시오.12-16 개의 잎을 선택하고 끝에서 센티미터를 잘라냅니다. 그런 다음 각 잎에서 10 센티미터 부분을 자릅니다. 기초 끝을 함께 사용하여 잎 부분을 서로 겹쳐 쌓습니다.Clamp 바인더 클립을 사용하여 베이스 끝에서 번들을 함께 고정합니다. 흰 종이 위에 나뭇잎 묶음을 놓습니다. 너비가 0.5-1 밀리미터 인 잎 조각을 자릅니다.얇고 일관된 슬라이스를 자르는 것이 중요합니다. 잎 다발의 일부를 자른 후 슬라이스를 효소 용액으로 옮깁니다. 재료가 마르지 않도록 하십시오.효소 용액을 부드럽게 소용돌이 치면서 재료를 적십니다. 빛을 차단하기 위해 비커 위에 호일을 놓습니다. 전체 번들이 바인더 클립 가까이에서 절단될 때까지 이 과정을 반복합니다.절단 후 솔루션은 다음과 같아야합니다. 효소 용액 비커를 벨 항아리에 옮깁니다. 실온에서 3 분 동안 진공 침투합니다.실온에서 40RPM의 탁상용 셰이커에서 2시간 30분 동안 배양합니다. 배양 후, 용액을 소용돌이 치십시오. 유백색으로 보이며 성공적인 소화를 나타냅니다.실온에서 80RPM으로 탁상용 셰이커에서 10분 더 배양합니다. 효소 용액이 담긴 비커를 얼음 위에 놓습니다. 얼음처럼 차가운 MMG 1 부피를 첨가하여 소화를 중지하십시오.40 미크론 셀 스트레이너를 통해 50 밀리리터 원심 분리기 튜브로 여과합니다. 용액을 각각 10 밀리리터 이하의 부분 표본으로 나눕니다. 차가운 둥근 바닥 유리관에 붓습니다.튜브를 100G에서 4분 동안 원심분리합니다. 펠릿을 방해하지 않도록 상층액을 제거하십시오. 다시 일시 중단한 다음 후속 세척을 위해 샘플을 풀링합니다.5 밀리리터의 MMG로 원형질체를 두 번 씻으십시오. 매번 100G에서 3분 동안 회전합니다. 펠렛은 아름답고 밝은 노란색 녹색이어야합니다.튜브를 부드럽게 소용돌이치게 하여 펠릿을 다시 매달아 놓을 수 있습니다. MMG 1 밀리리터에 재현 탁하고 계산을 위해 작은 부분 표본 10-20 배를 희석하십시오. 원형질체가 빨리 가라앉기 때문에 알리쿠팅 전에 잘 재현하는 것이 중요합니다.희석된 원형질체를 혈구계에 넣습니다. 광학 현미경으로 원형질체를 계산합니다. 좋은 준비는 세탁 후 떠다니는 과도한 파편이 많지 않습니다.좋은 원형질체는 눈에 보이는 색소체가 있는 원형입니다. 셀 개수를 사용하여 총 수를 계산합니다. 이 준비는 1,000만 개가 조금 넘는 원형질체를 생성했습니다.플루오레세인 디아세테이트 염료를 사용하여 생존력을 확인하는 것이 좋습니다. 성공적인 원형질체 분리는 70%에서 90% 사이의 생존율을 산출합니다원형질체를 관심 있는 플라스미드와 혼합하십시오. 이 예에서는 100만 개의 원형질체와 15마이크로그램의 DNA를 사용합니다.얼음에서 30 분 동안 배양하십시오. 튜브의 측면을 두드려 다시 매달아 놓습니다. 12%PEG의 최종 농도에 도달하기 위해 PEG 용액을 추가합니다.여러 번 뒤집어서 부드럽게 섞습니다. 원형질체와 PEG 용액은 깨지기 쉽기 때문에 튜브를 흔들지 마십시오. 실온의 어두운 곳에서 10 분 동안 배양하십시오.5 부피의 배양 용액으로 희석하고 반전으로 부드럽게 혼합하십시오. 튜브를 100G에서 4분 동안 원심분리합니다. 1 밀리리터 배양액으로 한 번 씻으십시오.펠릿을 방해하지 않도록 주의하십시오. 100G에서 3분간 회전시킵니다. 배양 완충액에서 마이크로리터당 500 내지 1000 세포의 농도로 재현탁한다.실온에서 밤새 어둠 속에서 배양하십시오. 다음날 100G에서 4분 동안 회전합니다. 식힌 배양 용액으로 두 번 씻으십시오.실온에서 100G에서 3분 동안 매번 회전시킵니다. 다시 일시 중단한 다음 최종 확인을 위해 혈구계에 작은 분취량을 로드합니다. 먼저, 명시야 하에서 원형질체의 총 수를 세십시오.이제 자외선 하에서 형광을 발하는 원형질체의 비율을 관찰하여 형질감염을 확인합니다. 원형질체는 GFP 리포터를 표현하고 있습니다. 이제 transfection 효율성에 대한 몇 가지 메트릭을 살펴보겠습니다.이 준비에서 우리는 총 1,000만 개의 원형질체를 얻었고 그 중 100만 개를 형질감염시켰습니다. 다음날, 우리는 335, 000을 회수했습니다. 그 중 우리는 30.3 %의 형질 전환율을 보였으며 GFP를 발현하는 총 100, 000 개의 원형질체가 남았습니다.형질주입 효율은 다양할 수 있다. 차트에서 볼 수 있듯이 반복적 인 준비 중에서 20 %에서 50 % 사이의 효율성을 일상적으로 볼 수 있습니다. 이 프로토콜은 수백만 개의 옥수수 중엽 원형질체의 수집 및 형질전환을 허용합니다.프로토콜의 가장 좋은 부분 중 하나는 확장 기능입니다. 형질전환에 사용되는 원형질체의 수뿐만 아니라 부피의 양을 조정함으로써 형질전환을 오늘 보여준 것보다 훨씬 더 증가시킬 수 있습니다. 현재까지 우리의 가장 큰 단일 튜브 실험은 2천만 개의 원형질체와 200마이크로그램의 DNA로 시작하여 다음날 310만 개의 형질전환된 원형질체로 끝났습니다.이 고처리량 프로토콜은 다양한 플라스미드 구조를 테스트해야 할 때 특히 유용하지만 공동 연구자는 합성 유전자 회로 및 옥수수 설계와 같이 확장 기능이 필요하지 않은 목적으로 이 프로토콜을 사용했습니다. 저희 영상을 시청해 주셔서 감사합니다. 도움이 되었기를 바랍니다.

Research

JoVE Journal

Biology

Gene-gun Transfection of Hippocampal Neurons

Hippocampal 뉴런의 유전자 총을 Transfection

연구

생물학

Isolation of Protoplasts from Tissues of 14-day-old Seedlings of Arabidopsis thaliana

Isolation of Protoplasts from Tissues of 14-day-old Seedlings of Arabidopsis thaliana

14 일 된 모종의 조직에서 Protoplasts의 분리 Arabidopsis thaliana</em

Protoplasts are plant cells that have had their cell walls enzymatically removed. Isolation of protoplasts  from different plant tissues was first ...

Fluorescence Activated Cell Sorting of Plant Protoplasts

식물 Protoplasts의 형광 활성 세포 정렬

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental ...

Single Cell Transfection in Chick Embryos

칙 태아의 단일 세포 Transfection

A central theme in developmental biology is the diversification of lineages and the elucidation of underlying molecular mechanisms. This entails a ...

Protein Transfection of Mouse Lung

마우스 폐의 단백질 형질

Increasing protein expression enables researchers to  better understand the functional role of that protein in regulating key  biological processes1. In ...

Lateral Root Inducible System in Arabidopsis and Maize

Lateral Root Inducible System in Arabidopsis and Maize

의 측면 루트 유도 성 시스템<em&gt; 애기 장대</em&gt;과 옥수수

Lateral root development contributes significantly to the root system, and hence is crucial for plant growth. The study of lateral root initiation is ...

Rapid Analysis of Circadian Phenotypes in Arabidopsis Protoplasts Transfected with a Luminescent Clock Reporter

발광 시계 기자와 애기 장대 원형질체 트랜의 일주기 표현형의 신속한 분석

The plant circadian clock allows the anticipation of daily changes to the environment. This anticipation aids the responses to temporally predictable ...

Measuring Endoreduplication by Flow Cytometry of Isolated Tuber Protoplasts

격리 된 괴 경 Protoplasts의 Cytometry에 의해 측정 Endoreduplication

Endoreduplication, the replication of a cell's nuclear genome without subsequent cytokinesis, yields cells with increased DNA content and is associated ...

A Highly Scalable Approach to Perform Ecological Surveys of Selfing Caenorhabditis Nematodes

A Highly Scalable Approach to Perform Ecological Surveys of Selfing Caenorhabditis Nematodes

Selfing caenorhabditis 선충류의 생태 조사를 수행하기위한 고도로 확장 가능한 접근법

Caenorhabditis elegans is one of the major model organisms in biology, but only recently have researchers focused on its natural ecology. The relative ...

Scalable, Flexible, and Cost-Effective Seedling Grafting

확장 가능하고 유연하며 비용 효율적인 묘목 접목

Early-stage seedling grafting has become a popular tool in molecular genetics to study root-shoot relationships within plants. Grafting early-stage ...