Name: scalable transfection of maize mesophyll protoplasts
Uploaded: 2023-06-23T12:10:00
Duration: 8 min 38 s
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Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional de Investigación del Genoma Humano Interdisciplinary Training in Genomic Sciences (T32 training grant no. HG000035 to J.T.) y el National Institute of Health (NIGMS 1R35GM139532 to C.Q.) y por la National Science Foundation (RESEARCH-PGR IOS-1748843 y PlantSynBio 2240888 to CQ). Agradecemos a Andrea Gallovatti de la Universidad de Rutgers por el regalo de las semillas de maíz.

1. Crecimiento del material vegetal
<ol><li>Enjuague los granos de maíz dos veces con agua del grifo. Remoje los granos en agua del grifo durante la noche a temperatura ambiente.</li>
	<li>Al día siguiente, llene una bandeja de inicio de semillas de 72 células con vermiculita: musgo de turba 1: 1 humedecido. Enjuague los granos una vez y plántelos con la punta hacia abajo, un grano por celda.</li>
	<li>Cultivar en condiciones de día largo (16 h de luz, 8 h de oscuridad) a 25 °C durante 3 días.</li>
	<li>Transfiera a oscuridad constante a 25 ° C y crezca durante 9-11 días.</li>
</ol>2. Aislamiento de plásmidos
<ol><li>Transformar E. coli comercialmente competente químicamente con el(los) plásmido(s) de interés(s) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.</li>
	<li>Cultivar la E. coli transformada en 50 ml de medio LB líquido con antibióticos apropiados durante la noche a 37 °C con agitación.</li>
	<li>Granular la E. coli centrifugando durante 10 min a 3.000 x g a temperatura ambiente. Extraiga los plásmidos utilizando un kit de aislamiento de ADN de plásmido midiprep disponible comercialmente.</li>
	<li>Estimar la concentración de ADN plásmido utilizando un espectrofotómetro de microvolumen. NOTA: El material adecuado para la transfección debe tener una concentración de ≥800 ng/μL y un A260/A280 de ≥1.8.</li>
</ol>3. Aislamiento de protoplastos
<ol><li>Prepare 20 ml de solución enzimática.<ol><li>Añadir 2,18 g de manitol, 0,30 g de celulasa R-10 y 0,06 g de macerozima R-10 a un tubo de centrífuga de 50 ml. Invertir para mezclar los polvos. AñadirH2Odesionizado a 15 mL. Añadir 200 μL de 1 M MES, pH 5.7. Vórtice para mezclar.</li>
		<li>Calentar la solución a 55 °C durante 10 min. Enfriar a temperatura ambiente durante 10 min.</li>
		<li>Añadir 20 μL de CaCl2 1 M, 0,02 g de albúmina sérica bovina y 100 μL de 1 M β-mercaptoetanol.</li>
		<li>Llene hasta 20 ml con H2O. desionizado. Vierta en un vaso de precipitados de 250 ml envuelto en papel de aluminio.</li>
	</ol></li>
	<li>Saque las plántulas de maíz de la oscuridad. Córtalos unos centímetros por encima del suelo con una nueva cuchilla de afeitar. Coloque los extremos cortados en agua. Manténgalos en la oscuridad a temperatura ambiente mientras no estén en uso.</li>
	<li>Seleccione la segunda y tercera hoja de cada plántula, teniendo cuidado de excluir hojas con áreas marrones o dañadas. Seleccione 12-16 hojas. Cortar ~1 cm de la punta de cada hoja y desechar. Luego, corte una sección de 10 cm de cada hoja. NOTA: Si se necesita más tejido, use un volumen adicional de 20 ml de solución enzimática en un vaso de precipitados adicional de 250 ml. Demasiado material foliar en una cantidad dada de solución enzimática puede disminuir la viabilidad.</li>
	<li>Apile las secciones de las hojas una encima de la otra con los extremos basales juntos. Sujete el haz en el extremo basal con un clip aglutinante. Coloque el haz de hojas en un pedazo de papel blanco.</li>
	<li>Agarre las hojas ~1 cm del extremo distal. Con una nueva cuchilla de afeitar, corte las hojas del extremo distal perpendicular a las venas en rodajas delgadas (0.5-1 mm). Evite cortar hacia abajo, sino que haga rodajas cortas y hacia adelante a través del tejido.<ol><li>Cambie las hojas de afeitar cada vez que comiencen a depositarse residuos visibles en el papel. El residuo visible indica la trituración del tejido debido a una cuchilla opaca o una técnica deficiente.</li>
	</ol></li>
	<li>Después de cortar ~ 2 cm de la longitud del haz de hojas, transfiera rápidamente las rodajas al vaso de precipitados de la solución enzimática. No permita que el material se seque, ya que esto reducirá el número de protoplastos obtenidos. Agite suavemente la solución enzimática para humedecer el material.<ol><li>Coloque una tapa de aluminio sobre el vaso de precipitados para bloquear la luz. Repita el proceso de corte y transferencia hasta que todo el paquete se corte cerca del clip de carpeta.</li>
	</ol></li>
	<li>Transfiera el vaso de precipitados de la solución enzimática a un frasco de campana. Infiltrar al vacío entre -50,8 kPa y -67,7 kPa en relación con la presión ambiente durante 3 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Transfiera el vaso de precipitados a un agitador de mesa. Agitar a 40 RPM durante 2,5 h a temperatura ambiente. Agite suavemente el vaso de precipitados con la mano. Cuando se digiere completamente, la solución enzimática aparecerá ligeramente lechosa. Si la solución sigue siendo clara, continúe agitando a 40 RPM durante un máximo de una hora adicional. No superar las 3,5 h.</li>
	<li>Durante la digestión, haga una solución de manitol + MES + MgCl2 (MMG), una solución de polietilenglicol (PEG) y una solución de incubación.<ol><li>MMG: Añadir 5,47 g de manitol, 200 μL de 1 M MES, pH 5,7, y 750 μL de 1 M MgCl2 a un tubo centrífugo de 50 mL. Llenar a 50 ml con H2O. Vortex destilado para disolver. Colocar sobre hielo.</li>
		<li>Solución de incubación: Añadir 5,47 g de manitol, 200 μL de 1 M MES a pH 5,7 y 200 μL de 1 M KCl a un tubo de centrífuga de 50 ml. Llenar a 50 ml con H2O. Vortex destilado para disolver. Colocar sobre hielo.</li>
		<li>Solución de PEG: Añadir 0,44 g de manitol, 1,0 g de PEG y 400 μL de CaCl2 1 M a un tubo de centrífuga de 15 ml. Llenar a 4 mL con H2O. Vortex destilado para mezclar. Incubar a 37 °C agitando durante 30 min hasta que se disuelva completamente. Mantener a temperatura ambiente.</li>
	</ol></li>
	<li>Agitar la solución enzimática a 80 RPM durante 10 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Coloque el vaso de precipitados con la solución enzimática sobre hielo. No retire la cubierta de aluminio. Agregue 20 ml de MMG helada a la solución enzimática. Filtrar a través de un filtro celular de 40 μm en un tubo centrífugo de 50 ml. NOTA: Mantenga todas las soluciones en hielo durante los siguientes pasos hasta la adición del PEG. Mantenga los protoplastos cubiertos con papel de aluminio para minimizar la exposición a la luz.</li>
	<li>Divida el filtrado en volúmenes iguales de 10 ml cada uno. Vierta cada volumen en un tubo de centrífuga de vidrio de fondo redondo y gire hacia abajo durante 4 minutos a 100 x g a temperatura ambiente.</li>
	<li>Deseche el sobrenadante y agregue 1 ml de MMG helado a cada tubo. Vuelva a suspender los gránulos girando suavemente y golpeando los tubos. Combine las muestras en un solo tubo centrífugo de vidrio de fondo redondo. Agregue MMG a un volumen total de 5 ml. Girar durante 3 min a 100 x g a temperatura ambiente.</li>
	<li>Lavar con 5 ml de MMG y girar durante 3 min a 100 x g a temperatura ambiente.</li>
	<li>Repita el lavado con 5 ml de MMG y gire durante 3 minutos a 100 x g a temperatura ambiente. Después de girar el segundo lavado, observe si el sobrenadante está claro. Si permanece turbio, realice un tercer lavado.</li>
	<li>Resuspender los protoplastos en 1 mL de MMG. Cubra holgadamente con papel de aluminio y mantenga en hielo.</li>
	<li>Determinar el rendimiento del protoplasto y comprobar la viabilidad.<ol><li>En un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, sumar 4 μL de protoplastos y 72 μL de MMG.</li>
		<li>En un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, agregue 1 μL de solución madre de diacetato de fluoresceína al 0,5% (FDA) a 49 μL de MMG para hacer una solución de trabajo 20x. Agregue 4 μL de solución de trabajo FDA al tubo con los protoplastos diluidos. Incubar durante 5 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente.</li>
		<li>Cargue 11 μL de la mezcla de protoplastos en un hemocitómetro. Colocar bajo un microscopio de luz de campo claro. Confirme visualmente que las células carecen de paredes celulares. Luego, cuente el número de protoplastos. Utilice este recuento para estimar el número total de protoplastos obtenidos. Luego, cuente el número de protoplastos que emiten fluorescencia verde bajo luz UV cuando se tiñen con la FDA. Los aislamientos exitosos de protoplastos producen una viabilidad del 70% -90%.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Transfección mediada por PEG
<ol><li>Comenzando con la concentración estimada de protoplastos del paso 3.17, ajuste a ~10,000 protoplastos/μL. Si la concentración es baja, centrifugar durante 3 min a 100 x g, y resuspender en MMG a una concentración de ~10.000 protoplastos/μL.</li>
	<li>Mezclar ~1.000.000 de protoplastos con 15 μg de ADN en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Rellene la mezcla con MMG a 114,4 μL e incube en hielo durante 30 min.</li>
	<li>Resuspenda los protoplastos golpeando el lado del tubo. Agregue 105.6 μL de solución de PEG al 25% a los protoplastos para alcanzar un peso/volumen final de PEG al 12%. Mezclar suavemente invirtiendo 5-10 veces. Los protoplastos en solución PEG son frágiles; No agite el tubo. Incubar durante 10 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente. NOTA: La transfección se puede ampliar en múltiplos de los volúmenes indicados en los pasos 4.2 y 4.3. Por ejemplo, 10 millones de protoplastos y 150 μg de ADN pueden suspenderse en 1.444 μL de MMG y tratarse con 1.056 μL de solución de PEG en un tubo de centrífuga de 50 ml.</li>
	<li>Diluir con 5 volúmenes de solución de incubación. Mezclar suavemente por inversión. Girar durante 4 min a 100 x g a temperatura ambiente. NOTA: Si se amplía, divida los protoplastos en múltiples tubos de vidrio de fondo redondo que no contengan más de 10 ml cada uno para garantizar una peletización completa. Aumente proporcionalmente el volumen de la solución de incubación utilizada para el lavado.</li>
	<li>Retire el sobrenadante mediante pipeteo. Lavar con 1-5 ml de solución de incubación y girar durante 3 min a 100 x g a temperatura ambiente.</li>
	<li>Resuspender los protoplastos en la solución de incubación a una concentración de 500-1.000 células/μL.</li>
	<li>Incubar los protoplastos en la oscuridad durante la noche (~16 h) a temperatura ambiente.</li>
</ol>5. Recuperación de protoplastos y verificación de expresiones
<ol><li>Girar los protoplastos durante 4 min a 100 x g a temperatura ambiente. NOTA: Si se amplía, divida los protoplastos en múltiples tubos de vidrio de fondo redondo que no contengan más de 10 ml cada uno.</li>
	<li>Lavar con 1-5 ml de solución de incubación y girar durante 3 min a 100 x g a temperatura ambiente.</li>
	<li>Resuspender y combinar en 1-5 ml de solución de incubación.</li>
	<li>Si los protoplastos se transfectan con un gen reportero fluorescente (por ejemplo, GFP), tome una alícuota para verificar la eficiencia de la transfección. Usando un hemocitómetro, primero cuente el número total de protoplastos usando microscopía de luz de campo claro. Luego, cuente la fracción de protoplastos fluorescentes bajo luz UV.</li>
	<li>Centrifugar los protoplastos durante 3 min a 100 x g a temperatura ambiente. NOTA: Los protoplastos ahora están listos para aplicaciones posteriores, como la extracción de ARN con fenol e isotiocianato de guanidina.</li>
</ol>

<ol>
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Los autores declaran que no hay intereses contrapuestos.

Como se informó anteriormente, la calidad del material vegetal utilizado para el protoplasting es esencial para la obtención de protoplastos de alta calidad16,17,18. Es crucial seleccionar hojas sanas sin manchas. Este trabajo utilizó el popular cultivar de maíz de investigación B73. No hemos probado otros cultivares. Las plántulas de maíz utilizadas para este protocolo se cultivaron en la oscuridad porque las hojas etioladas producen protoplastos con mayor viabilidad 16 h después de la transfección en comparación con los protoplastos de hojas verdes. Para aplicaciones que no requieren incubación durante la noche, sería posible usar material de hoja verde o verde.
Un paso crítico es cortar adecuadamente el material de la hoja en rodajas finas antes de la digestión enzimática. Este proceso aumenta el área de superficie para que las células del mesófilo estén expuestas a la solución enzimática, lo que aumenta el número de protoplastos recuperados. Las puntas distales de las hojas se descartan y las rodajas delgadas (≤1 mm) se cortan con nuevas cuchillas de afeitar, que se cambian inmediatamente cuando comienzan a opacarse. Para una cantidad dada de tejido, las rodajas más delgadas producen más protoplastos siempre que se emplee la técnica correcta para minimizar el aplastamiento de las hojas.
El lavado correcto de los protoplastos también es importante, ya que son bastante delicados después de someterse a la eliminación de la pared celular. Después de la digestión, todas las soluciones se mantienen en hielo y los protoplastos de crecimiento oscuro se protegen de la luz. La osmolaridad y el pH se amortiguan realizando los lavados en solución MMG. Para aislar los protoplastos de los restos celulares menos densos, la centrifugación tiene lugar a 100 x g. Los protoplastos centrifugados a 200 x g muestran una viabilidad similar después del aislamiento, pero una menor viabilidad al día siguiente, y también transforman aproximadamente la mitad. Recomendamos comprobar la viabilidad de los protoplastos mediante tinción con FDA (diacetato de fluoresceína) inmediatamente después del aislamiento; La viabilidad normal oscila entre el 70% y el 90%. Los protoplastos con viabilidad inferior al 40% después del aislamiento producen pocos transformadores.

El peletizado y el lavado son más fáciles cuando se trabaja con muchos protoplastos porque se obtiene un pellet claramente visible después de la transfección. Por esta razón, la transfección se realiza con 1 millón o más de protoplastos. Al ampliar el protocolo, se debe seleccionar un recipiente del tamaño adecuado para los pasos de incubación (tubo de centrífuga de 1,5 ml, 15 ml o 50 ml), y el volumen de solución utilizado para los pasos de lavado debe escalarse en consecuencia. En cualquier caso, es beneficioso centrifugar en alícuotas de ≤10 ml para asegurar que los protoplastos no permanezcan en el sobrenadante. Una innovación de este protocolo es la eliminación de la etapa de incubación y lavado de 1 h en solución W5 que se enumera en otros protocolos14,19, que resultó innecesaria en nuestras manos.
Como se ha visto en otros estudios, la cantidad y la calidad del ADN son críticas para el éxito de la transfección19. Para plásmidos en el rango de 4-6 kb, se utilizan 15 μg de ADN por 1 millón de protoplastos. Las preparaciones de ADN de mala calidad pueden reducir la viabilidad después de la transfección, por lo que recomendamos usar un kit comercial de extracción de ADN al aislar plásmidos de bacterias. La incubación de los protoplastos durante la noche se realiza a temperatura ambiente en la oscuridad para permitir la transcripción del plásmido o la biblioteca de plásmidos y minimizar el estrés. Después de la incubación nocturna, se recupera aproximadamente la mitad del número de protoplastos originalmente transfectados. Los protoplastos se diluyen a una concentración de 500-1.000 células/μL para la incubación durante la noche. Los protoplastos que se dejan incubar durante la noche en concentraciones superiores a 1.000 células/μL tienen tasas de recuperación más bajas y menor viabilidad. En concentraciones más altas, los desechos de protoplastos dañados y muertos pueden contribuir a la muerte de protoplastos vecinos. El lavado de los protoplastos después de la incubación durante la noche sirve tanto para eliminar estos residuos como para eliminar el exceso de plásmido.
Protocolos como estos tienen la limitación de que no todas las especies de plantas o tipos de tejidos son susceptibles de protoplasto. Además, las diferencias en la expresión génica pueden ser inducidas por el proceso de protoplasting .
En resumen, hemos detallado un protocolo simple y escalable para aislar y transfectar millones de protoplastos viables del cultivo agrícola básico Z. mays. Este método puede transfectar muchos más protoplastos usando PEG, con una eficiencia de transformación casi tan alta como los métodos basados en electroporación15. El mayor número neto de transformadores permite probar cientos o miles de construcciones en experimentos a gran escala, como ensayos de reporteros masivamente paralelos12,13. Los futuros experimentos a escala genómica en maíz permitirán a los científicos comprender mejor la expresión génica y la regulación génica del maíz.

La expresión génica transitoria es una herramienta poderosa en biología vegetal. Sin embargo, las células vegetales son difíciles de transfectar porque están rodeadas por una pared celular. Esta barrera para la entrada de ADN no está presente en otros tipos de células comúnmente estudiadas, como las células de mamíferos o insectos. Investigaciones anteriores abordaron este desafío empleando protoplastos: células vegetales cuyas paredes celulares han sido digeridas y eliminadas. A diferencia del tejido foliar no procesado, los protoplastos vegetales son fáciles de trabajar en suspensión y susceptibles a técnicas de transfección mediadas por electroporación o polietilenglicol (PEG)1. Las células vegetales conservan gran parte de su funcionalidad incluso después de la eliminación de la pared celular. Así, los protoplastos se utilizan en una variedad de plantas para estudiar la función de genes y proteínas2,3, para comprender la transducción de señales4 e identificar posibles objetivos para el fitomejoramiento5. Los protoplastos también son un vehículo conveniente para examinar las construcciones de edición del genoma en diversas especies de cultivos, incluidos el trigo y la papa 6,7. En resumen, los ensayos transitorios en protoplastos son indispensables para la biotecnología agrícola.
El maíz (Zea mays L.) es el principal cultivo mundial de cereales por tonelaje; Como tal, es un foco importante de investigación básica y aplicada en ciencias de las plantas8. Sin embargo, a diferencia de plantas modelo como Nicotiana tabacum9, la expresión transitoria de transgenes en hojas de maíz intactas no se realiza de forma rutinaria. El protoplasting se ha utilizado para obtener y transfectar células mesófilas de hojas de maíz10,11. Los métodos anteriores han logrado eficiencias de transfección de hasta el 75% utilizando electroporación y han producido protoplastos transfectados a escala de decenas de miles10,15.
Este protocolo detalla cómo protoplastar millones de células de mesófilo de maíz y transfectarlas con una eficiencia comparable a los métodos anteriores. Los pasos principales son el cultivo de plántulas de maíz etioladas, la recolección del tejido de la hoja, la digestión de la pared celular de la planta y la entrega de ADN plásmido en las células mediante PEG. La contribución clave de este protocolo es la capacidad de ampliar la transfección de protoplastos mientras se mantiene la viabilidad celular requerida para los ensayos funcionales. Esto permite el uso de experimentos a escala genómica, como ensayos de reporteros masivamente paralelos, que pueden probar la función de cientos de miles de regiones a lo largo del genoma del maíz. Este método se ha utilizado recientemente para investigar grandes bibliotecas de elementos de ADN cis-reguladores, incluyendo potenciadores y promotores12,13,14.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL graduated microcentrifuge tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>490004-444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Falcon conical centrifuge tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>05-527-90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 mL Pyrex glass beaker</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>50-121-5005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 um nylon mesh cell strainer</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22363547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>72 cell propagation tray</td>
			<td>T.O. Plastics</td>
			<td>725607C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum foil</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89107-732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bell jar</td>
			<td>Bel-Art</td>
			<td>F42022-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6250-250ML</td>
			<td>Dissolve in ultrapure H2O to make a 1M stock solution. Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate (CaCl2*2H2O)</td>
			<td>PhytoTech Labs</td>
			<td>C135</td>
			<td>Dissolve in ultrapure H2O to make a 1M stock solution. Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulase Onozuka R-10</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>C8001.0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Mannitol</td>
			<td>PhytoTech Labs</td>
			<td>M562</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scope</td>
			<td>Reichert</td>
			<td>Microstar IV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein Diacetate (FDA)</td>
			<td>Thermofischer Scientific</td>
			<td>F1303</td>
			<td>Dissolve in acetone at 0.5% weight/volume to make a 1000X stock solution. Protect from light and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Illumination Systems</td>
			<td>Prior</td>
			<td>Lumen200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MDG36</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-capacity centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macerozyme</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>M8002.0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride (MgCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M292-1KG</td>
			<td>Dissolve in ultrapure H2O to make a 1M stock solution. Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maize seeds</td>
			<td>B73</td>
			<td>USDA-ARS</td>
			<td>https://npgsweb.ars-grin.gov/gringlobal/accessiondetail?accid=PI+550473</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium binder clip</td>
			<td>Uline</td>
			<td>S-24649</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M5287-250G</td>
			<td>Dissolve in ultrapure H2O to make a 1M stock solution. Adjust pH to 5.7 using KOH. Protect from light and store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette 20-200 uL</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F123601G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop microvolume spectrophotometer</td>
			<td>Thermofischer Scientific</td>
			<td>ND-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB 5-alpha competent E. coli</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>C2987H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer hemocytometer</td>
			<td>Daigger Scientific</td>
			<td>EF16034F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>No. 9 Single-edge razor blade</td>
			<td>Excel</td>
			<td>20009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89032-104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(ethylene) glycol 4,000</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>81240-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541-1KG</td>
			<td>Dissolve in ultrapure H2O to make a 1M stock solution. Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Professional Grade Vermiculite</td>
			<td>NK Lawn &#38; Garden</td>
			<td>G208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round-bottom glass centrifuge tube 30 mL</td>
			<td>Kimble Chase</td>
			<td>45500-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber adapter for Corex centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS8445AO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sphagnum peat moss</td>
			<td>Premier Horticulture</td>
			<td>0128P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>Thermofischer Scientific</td>
			<td>15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon vacuum tubing</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76336-844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum gauge</td>
			<td>Wika</td>
			<td>4269978</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

scalable transfection of maize mesophyll protoplasts

La transfección de las células del mesófilo del maíz a menudo implica digerir las paredes celulares de las plantas para crear protoplastos y luego insertar ADN a través de la electroporación o polietilenglicol (PEG). Los métodos anteriores se desarrollaron para producir decenas de miles de protoplastos transfectados a la vez. Aquí, describimos un método sencillo para aislar y transfectar millones de protoplastos de mesófilos foliares en maíz (Zea mays L.). Este proceso simplificado elimina ciertos pasos comunes de protoplasting, como el lavado en W5. Además, pasos como la centrifugación, la transfección mediada por PEG y la incubación se han modificado para trabajar con un mayor número de protoplastos. La capacidad de expresar grandes bibliotecas de construcciones de plásmidos permite experimentos a escala genómica, como ensayos de reporteros masivamente paralelos en maíz.

El tejido más adecuado para el aislamiento de protoplastos es la segunda y tercera hojas de plántulas de 10-11 días de edad (Figura 1). En este trabajo, obtuvimos aproximadamente 10 millones de protoplastos de 16 secciones de hojas, cada una de las cuales tenía 10 cm de largo. El número de protoplastos aislados depende de la masa del material foliar y del ancho de las rodajas de hoja que se digieren en la solución enzimática.
Bajo un microscopio de luz de campo claro, los protoplastos no dañados aparecen aproximadamente esféricos, con plastidios moteando la superficie (Figura 2A). Antes de proceder a la transfección, se puede comprobar la viabilidad tiñendo una pequeña alícuota de protoplastos con diacetato de fluoresceína (FDA). Los protoplastos teñidos por la FDA que emiten fluorescencia bajo luz UV se consideran viables (Figura 2B, C). No todos los protoplastos que parecen no dañados siguen siendo viables, y algunos protoplastos viables pueden estar en proceso de morir por evacuación (Figura 2C). En estas células, la vacuola se hincha y eventualmente será expulsada de la membrana celular.
La Figura 3 muestra protoplastos transformados con pJT01, un plásmido de expresión de maíz de 4,3 kb derivado de CD3-911 (ABRC)15. La transfección da como resultado la expresión de sGFP marcado con una señal de localización nuclear C-terminal de c-Myc (Figura 3A). La proporción de protoplastos que expresan sGFP se midió en múltiples experimentos utilizando un hemocitómetro. La mediana de la eficiencia de transfección alcanzada por este método fue del 40% después de la incubación nocturna (n = 9, Figura 4, Tabla 1), que es comparable a los métodos publicados anteriormente15. Dependiendo de la aplicación experimental, si la biblioteca de plásmidos o plásmidos carece de un reportero fluorescente, se recomienda incluir un control positivo para confirmar la transfección.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64991/64991fig01.jpg"> Figura 1: Plántula representativa de maíz etiolado cultivada en la oscuridad durante 10 días después de la germinación. Las flechas indican la segunda y tercera hojas, que son las más adecuadas para el protoplasto. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64991/64991fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64991/64991fig02.jpg"> Figura 2: Microscopía de fluorescencia de la viabilidad del protoplasto después del aislamiento. (A) Imagen de campo claro de protoplastos inmediatamente después del aislamiento. (B) La señal de fluorescencia de los protoplastos teñidos por la FDA. (C) Superposición de campo claro y fluorescencia que muestra los protoplastos viables. La flecha muestra un protoplasto sometido a evacuación. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64991/64991fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64991/64991fig03.jpg"> Figura 3: Microscopía de fluorescencia de protoplastos transfectados con sGFP . (A) Imagen de campo claro de protoplastos después de la transfección. (B) La señal de fluorescencia de los protoplastos transfectados en el canal GFP. (C) Superposición de campo claro y fluorescencia que muestra los protoplastos transformados. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64991/64991fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64991/64991fig04.jpg"> Figura 4: Porcentaje de protoplastos que muestran fluorescencia GFP después de 16 h de incubación. La eficiencia de la transfección varió entre los ensayos independientes, con la eficiencia más baja alrededor del 20% y la más alta cerca del 50%. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64991/64991fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Juicio</td>
			<td>Células GFP contadas</td>
			<td>Total de celdas contadas</td>
			<td>Porcentaje de GFP</td>
		</tr><tr><td>1</td>
			<td>104</td>
			<td>261</td>
			<td>39.8</td>
		</tr><tr><td>2</td>
			<td>148</td>
			<td>298</td>
			<td>49.5</td>
		</tr><tr><td>3</td>
			<td>84</td>
			<td>258</td>
			<td>32.6</td>
		</tr><tr><td>4</td>
			<td>137</td>
			<td>271</td>
			<td>50.6</td>
		</tr><tr><td>5</td>
			<td>127</td>
			<td>299</td>
			<td>42.5</td>
		</tr><tr><td>6</td>
			<td>107</td>
			<td>235</td>
			<td>45.5</td>
		</tr><tr><td>7</td>
			<td>83</td>
			<td>360</td>
			<td>23.1</td>
		</tr><tr><td>8</td>
			<td>134</td>
			<td>549</td>
			<td>24.4</td>
		</tr><tr><td>9</td>
			<td>61</td>
			<td>201</td>
			<td>30.3</td>
		</tr><tr><td>Significar</td>
			<td>109</td>
			<td>304</td>
			<td>36</td>
		</tr><tr><td>Desviación estándar</td>
			<td>29</td>
			<td>102</td>
			<td>10</td>
		</tr></tbody></table>Tabla 1: Eficiencia representativa de la transfección de protoplastos. Datos de nueve ensayos recientes de protoplasting en el laboratorio de los autores.
Archivo complementario 1: archivo de texto con formato GenBank con la secuencia de pJT01. Un plásmido de expresión de sGFP de 4,3 kb sirve como control positivo en protoplastos de maíz transfectados. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64991/pJT01_gfp_cmyc.gb.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

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Scalable Transfection of Maize Mesophyll Protoplasts

Aquí, presentamos un protocolo de alto rendimiento para transfectar transitoriamente millones de protoplastos de maíz para probar grandes bibliotecas de plásmidos en células de mesófilo de maíz.

Transfección escalable de protoplastos de mesófilo de maíz

The transfection of maize mesophyll cells often involves digesting the plant cell walls to create protoplasts and then inserting DNA via electroporation ...

Hello.Today vamos a mostrarles un protocolo que protoplasta millones de células de mesófilo de maíz y las transforma con alta eficiencia. Los pasos principales del protocolo son primero digerir y eliminar la pared celular de la planta, liberando los protoplastos, y luego transformar el protoplasto usando PEG. La gran diferencia entre este protocolo y otros es la escala de transformación.La mayoría de los protocolos terminan con entre 1.000 y 10.000 protoplastos transformados. Sin embargo, nuestro protocolo proporciona millones de protoplastos de maíz transformado. Aquí tenemos plántulas de maíz cultivadas en la oscuridad durante nueve a 11 días después de la germinación.Corte las plántulas justo por encima del nivel del suelo y colóquelas en agua. Mantenga las plantas en la oscuridad cuando no estén en uso. Seleccione la segunda y tercera hoja de cada plántula, teniendo cuidado de excluir hojas con áreas marrones o dañadas.Seleccione de 12 a 16 hojas y corte un centímetro de las puntas. Luego corte una sección de 10 centímetros de cada hoja. Apile las secciones de hojas una encima de la otra con los extremos basales juntos.Sujete el haz en el extremo basal con un clip aglutinante. Coloque el haz de hojas en un pedazo de papel blanco. Corte rodajas de hojas de 0.5 a un milímetro de ancho.Es importante cortar rodajas finas y consistentes. Después de cortar parte del haz de hojas, transfiera las rodajas a la solución enzimática. No permita que el material se seque.Agite suavemente la solución enzimática para humedecer el material. Coloque papel de aluminio sobre el vaso de precipitados para bloquear la luz. Repita este proceso hasta que todo el paquete se corte cerca del clip de carpeta.Después de cortar, la solución debería verse así. Transfiera el vaso de precipitados de la solución enzimática a un frasco de campana. Infiltrar al vacío durante tres minutos a temperatura ambiente.Incubar en una coctelera de mesa a 40 RPM a temperatura ambiente durante dos horas y media. Después de la incubación, remolino a la solución. Debe verse lechoso, lo que indica una digestión exitosa.Incubar en el agitador de mesa a 80 RPM a temperatura ambiente durante 10 minutos más. Coloque el vaso de precipitados con solución enzimática sobre hielo. Detenga la digestión agregando un volumen de MMG helado.Filtrar a través de un filtro de células de 40 micras en un tubo de centrífuga de 50 mililitros. Dividir la solución en alícuotas de no más de 10 mililitros cada una. Verter en tubos de vidrio de fondo redondo refrigerados.Centrifugar los tubos a 100 G durante cuatro minutos. Retire el sobrenadante, asegurándose de no perturbar el pellet. Vuelva a suspender, luego agrupe las muestras para lavados posteriores.Lave los protoplastos dos veces con cinco mililitros de MMG. Gira hacia abajo cada vez a 100 G durante tres minutos. El pellet debe ser de un hermoso color verde amarillo brillante.Podrás resuspender el pellet girando suavemente el tubo. Resuspender en un mililitro de MMG, y diluir una pequeña alícuota 10 a 20x para contar. Es importante resuspender bien antes de aliqouting, ya que los protoplastos se asentarán rápidamente.Cargue los protoplastos diluidos en el hemocitómetro. Cuente los protoplastos bajo un microscopio óptico. Una buena preparación no tendrá mucho exceso de residuos flotando después del lavado.Los buenos protoplastos son circulares con plastidios visibles. Utilice el recuento de celdas para calcular el número total. Esta preparación resultó en poco más de 10 millones de protoplastos.Recomendamos comprobar la viabilidad con colorante de diacetato de fluoresceína. Los aislamientos exitosos de protoplastos producen una viabilidad entre 70 y 90%Mezcle los protoplastos con su plásmido de interés. Este ejemplo utiliza 1 millón de protoplastos y 15 microgramos de ADN.Incubar en hielo durante 30 minutos. Vuelva a suspender golpeando el costado del tubo. Agregue la solución de PEG para alcanzar una concentración final de 12% PEG.Mezclar suavemente invirtiendo varias veces. Los protoplastos y la solución de PEG son frágiles, así que no agite el tubo. Incubar en la oscuridad a temperatura ambiente durante 10 minutos.Diluir con cinco volúmenes de solución de incubación y mezclar suavemente por inversión. Centrifugar los tubos a 100 G durante cuatro minutos. Lavar una vez con un tampón de incubación de un mililitro.Tenga cuidado de no molestar el pellet. Girar a 100 G durante tres minutos. Resuspender en tampón de incubación a una concentración de 500 a 1000 células por microlitro.Incubar en la oscuridad durante la noche a temperatura ambiente. Al día siguiente, gire hacia abajo a 100 G durante cuatro minutos. Lavar dos veces con solución de incubación refrigerada.Girar cada vez durante tres minutos a 100 g a temperatura ambiente. Vuelva a suspender, luego cargue una pequeña alícuota en el hemocitómetro para la verificación final. Primero, cuente el número total de protoplastos bajo campo claro.Ahora, observe la fracción de protoplastos que fluorescen bajo UV para verificar la transfección. Los protoplastos están expresando nuestro reportero de GFP. Ahora, obtengamos algunas métricas sobre la eficiencia de la transfección.En esta preparación, obtuvimos 10 millones de protoplastos totales, de los cuales transfectamos 1 millón. Al día siguiente, recuperamos 335.000. De ellos, tuvimos una tasa de transformación del 30,3%Esto nos deja con nuestro total de alrededor de 100.000 protoplastos que expresan GFP.La eficiencia de la transfección puede variar. Como puede ver en el gráfico, habitualmente vemos eficiencias entre el 20 y el 50% entre las preparaciones repetidas. Este protocolo permite la recolección y transformación de millones de protoplastos de mesófilos de maíz.Una de las mejores partes del protocolo es su capacidad para escalar. Al escalar la cantidad de volumen, así como el número de protoplastos utilizados en la transformación, puede aumentar su transformación en más del orden de magnitud de lo que hemos mostrado hoy. Hasta la fecha, nuestro experimento de tubo único más grande comenzó con 20 millones de protoplastos y 200 microgramos de ADN, y terminó con 3,1 millones de protoplastos transformados al día siguiente.Este protocolo de alto rendimiento es especialmente útil cuando se necesitan probar muchas construcciones de plásmidos diferentes, pero los colaboradores han utilizado este protocolo para fines que no requieren la capacidad de escalar, como el diseño de circuitos genéticos sintéticos y maíz. Gracias por ver nuestro video. Esperamos que haya ayudado.

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