Name: evaluating autophagy levels in two different pancreatic cell models using lc3 immunofluorescence
Uploaded: 2023-04-28T13:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluating Autophagy Levels in Two Different Pancreatic Cell Models Using LC3 Immunofluorescence at JoVE.com

تم دعم هذا العمل بمنح من جامعة بوينس آيرس (UBACyT 2018-2020 20020170100082BA) ، والمجلس الوطني للبحث العلمي والتكنولوجيا (CONICET) (PIP 2021-2023 GI− 11220200101549CO ؛ و PUE 22920170100033) والوكالة الوطنية للترويج العلمي والتكنولوجي (PICT 2019-01664).

1. إعداد الخلية
<ol><li>انقع أغطية مستديرة مقاس 12 مم في الإيثانول المطلق ، وضعها عموديا في آبار صفيحة 24 بئرا.</li>
	<li>قم بإزالة الغطاء ، وتعريض اللوحة متعددة الآبار للأشعة فوق البنفسجية لمدة 15 دقيقة.</li>
	<li>ضع أغطية الغطاء أفقيا ، واغسلها باستخدام وسيط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM).</li>
	<li>بذر ع...

<ol>
	<li>Grasso, D., Renna, F. J., Vaccaro, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initial+steps+in+mammalian+autophagosome+biogenesis.">Initial steps in mammalian autophagosome biogenesis.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 146 (2018).</li><li>Galluzzi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+definitions+of+autophagy+and+related+processes.">Molecular definitions of autophagy and related processes.</a> EMBO Journal. 36 (13), 1811-1836 (2017).</li><li>Kitada, M., Koya, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+in+metabolic+disease+and+ageing.">Autophagy in metabolic disease and ageing.</a> Nature Reviews Endocrinology. 17 (11), 647-661 (2021).</li><li>Ktistakis, N. T., Tooze, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digesting+the+expanding+mechanisms+of+autophagy.">Digesting the expanding mechanisms of autophagy.</a> Trends in Cell Biology. 26 (8), 624-635 (2016).</li><li>Tanida, I., Ueno, T., Kominami, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LC3+and+autophagy.">LC3 and autophagy.</a> Methods in Molecular Biology. 445, 77-88 (2008).</li><li>Kabeya, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LC3,+a+mammalian+homologue+of+yeast+Apg8p,+is+localized+in+autophagosome+membranes+after+processing.">LC3, a mammalian homologue of yeast Apg8p, is localized in autophagosome membranes after processing.</a> EMBO Journal. 19 (21), 5720-5728 (2000).</li><li>Mizushima, N., Yoshimori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+interpret+LC3+immunoblotting.">How to interpret LC3 immunoblotting.</a> Autophagy. 3 (6), 542-545 (2007).</li><li>Vanasco, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dynamics+and+VMP1-related+selective+mitophagy+in+experimental+acute+pancreatitis.">Mitochondrial dynamics and VMP1-related selective mitophagy in experimental acute pancreatitis.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 640094 (2021).</li><li>Williams, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+mechanisms+in+pancreas+and+salivary+acini.">Regulatory mechanisms in pancreas and salivary acini.</a> Annual Review of Physiology. 46, 361-375 (1984).</li><li>Mizrahi, J. D., Surana, R., Valle, J. W., Shroff, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+cancer.">Pancreatic cancer.</a> Lancet. 395 (10242), 2008-2020 (2020).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+and+function+of+autophagy+in+pancreatic+cancer.">Regulation and function of autophagy in pancreatic cancer.</a> Autophagy. 17 (11), 3275-3296 (2021).</li><li>Ropolo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+E2F1-EP300-VMP1+pathway+mediates+gemcitabine-induced+autophagy+in+pancreatic+cancer+cells+carrying+oncogenic+KRAS.">A novel E2F1-EP300-VMP1 pathway mediates gemcitabine-induced autophagy in pancreatic cancer cells carrying oncogenic KRAS.</a> Frontiers in Endocrinology. 11, 411 (2020).</li><li>Pardo, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gemcitabine+induces+the+VMP1-mediated+autophagy+pathway+to+promote+apoptotic+death+in+human+pancreatic+cancer+cells.">Gemcitabine induces the VMP1-mediated autophagy pathway to promote apoptotic death in human pancreatic cancer cells.</a> Pancreatology. 10 (1), 19-26 (2010).</li><li>Logsdon, C. D., Moessner, J., Williams, J. A., Goldfine, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucocorticoids+increase+amylase+mRNA+levels,+secretory+organelles,+and+secretion+in+pancreatic+acinar+AR42J+cells.">Glucocorticoids increase amylase mRNA levels, secretory organelles, and secretion in pancreatic acinar AR42J cells.</a> Journal of Cell Biology. 100 (4), 1200-1208 (1985).</li><li>Klionsky, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+assays+for+monitoring+autophagy+(4th+edition).">Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (4th edition).</a> Autophagy. 17 (1), 1 (2021).</li><li>Segeritz, C. -. P., Vallier, L., Jalali, M., Saldanha, F. Y. L., Jalali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+9+-+Cell+culture:+Growing+cells+as+model+systems+in+vitro.">Chapter 9 - Cell culture: Growing cells as model systems in vitro.</a> Basic Science Methods for Clinical Researchers. , 151-172 (2017).</li><li>Elliott, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+microscopy:+Principles+and+modern+practices.">Confocal microscopy: Principles and modern practices.</a> Current Protocols in Cytometry. 92 (1), 68 (2020).</li><li>Grasso, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+novel+selective+autophagy+pathway+mediated+by+VMP1-USP9x-p62,+prevents+pancreatic+cell+death.">a novel selective autophagy pathway mediated by VMP1-USP9x-p62, prevents pancreatic cell death.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (10), 8308-8324 (2011).</li><li>Ropolo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pancreatitis-induced+vacuole+membrane+protein+1+triggers+autophagy+in+mammalian+cells.">The pancreatitis-induced vacuole membrane protein 1 triggers autophagy in mammalian cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 282 (51), 37124-37133 (2007).</li><li>Karanasios, E., Stapleton, E., Walker, S. A., Manifava, M., Ktistakis, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+imaging+of+early+autophagy+events:+Omegasomes+and+beyond.">Live cell imaging of early autophagy events: Omegasomes and beyond.</a> Journal of Visualized Experiments. (77), e50484 (2013).</li><li>Kuma, A., Matsui, M., Mizushima, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LC3,+an+autophagosome+marker,+can+be+incorporated+into+protein+aggregates+independent+of+autophagy:+caution+in+the+interpretation+of+LC3+localization.">LC3, an autophagosome marker, can be incorporated into protein aggregates independent of autophagy: caution in the interpretation of LC3 localization.</a> Autophagy. 3 (4), 323-328 (2007).</li><li>Zhang, Z., Singh, R., Aschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+the+detection+of+autophagy+in+mammalian+cells.">Methods for the detection of autophagy in mammalian cells.</a> Current Protocols in Toxicology. 69, 1-26 (2016).</li><li>Yoshii, S. R., Mizushima, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+and+measuring+autophagy.">Monitoring and measuring autophagy.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (9), 1865 (2017).</li><li>Betriu, N., Andreeva, A., Semino, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erlotinib+promotes+ligand-induced+EGFR+degradation+in+3D+but+not+2D+cultures+of+pancreatic+ductal+adenocarcinoma+cells.">Erlotinib promotes ligand-induced EGFR degradation in 3D but not 2D cultures of pancreatic ductal adenocarcinoma cells.</a> Cancers. 13 (18), 4504 (2021).</li><li>Wang, W., Dong, L., Zhao, B., Lu, J., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E-cadherin+is+downregulated+by+microenvironmental+changes+in+pancreatic+cancer+and+induces+EMT.">E-cadherin is downregulated by microenvironmental changes in pancreatic cancer and induces EMT.</a> Oncology Reports. 40 (3), 1641-1649 (2018).</li><li>Kim, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+heterogeneity+and+plasticity+of+cancer+cell+migration+in+a+pancreatic+tumor+three-dimensional+culture+model.">Phenotypic heterogeneity and plasticity of cancer cell migration in a pancreatic tumor three-dimensional culture model.</a> Cancers. 12 (5), 1305 (2020).</li><li>Meng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+EpCAM+over-expression+is+associated+with+favorable+clinical+outcomes+in+pancreatic+cancer+patients+with+Hepatitis+B+virus+negative+infection.">Cytoplasmic EpCAM over-expression is associated with favorable clinical outcomes in pancreatic cancer patients with Hepatitis B virus negative infection.</a> International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 8 (12), 22204-22216 (2015).</li><li>Brock, R., Hamelers, I. H., Jovin, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+fixation+protocols+for+adherent+cultured+cells+applied+to+a+GFP+fusion+protein+of+the+epidermal+growth+factor+receptor.">Comparison of fixation protocols for adherent cultured cells applied to a GFP fusion protein of the epidermal growth factor receptor.</a> Cytometry. 35 (4), 353-362 (1999).</li></ol>

تسمح الطريقة الموضحة في هذا البروتوكول بتصور توزيع LC3 الداخلي في الخلية وتحديد مستويات الالتهام الذاتي في ظل ظروف مختلفة. طريقة أخرى مماثلة تستخدم لتحليل توزيع LC3 وتحديد تنشيط الالتهام الذاتي تتضمن نقل LC3 المسمى بالتألق (مثل RFP-LC3) 19. يتميز نقل RFP-LC3 بمزايا عدم الحاجة إلى التثبيت ...

الالتهام الذاتي الكبير (يشار إليه عادة باسم الالتهام الذاتي) هو عملية تقويضية متخصصة تؤدي إلى تحلل المكونات السيتوبلازمية بشكل انتقائي ، بما في ذلك البروتينات والعضيات التالفة 1,2. يسمح الالتهام الذاتي للخلايا بالاستجابة الفسيولوجية لمحفزات الإجهاد ، وبالتالي الحفاظ على التوازن الخلوي3. أثناء الالتهام الذاتي ، يتم تشكيل حويصلة غشاء مزدوج: البلعمة الذاتية. يحتوي البلعمة الذاتية على جزيئات الشحن ويدفعها إلى الليزوزوم للتحلل 1,4.
تم تزيين البلعمة الذاتية بواسطة سلسلة ضوء البروتين المرتبطة بالبروتين الذاتي 3 (LC3) 5. عندما لا يتم تحفيز الالتهام الذاتي ، ينتشر LC3 في السيتوبلازم والنواة في شكل LC3-I. من ناحية أخرى ، عندما يتم تحفيز الالتهام الذاتي ، يتم اقتران LC3 مع فوسفاتيديل إيثانولامين في غشاء هياكل الالتهام الذاتي6. يعرف هذا التشكيل الجديد LC3 باسم LC3-II1. يتسبب تحول التشكل LC3 في حدوث تغييرات في توطينه الخلوي وهجرة دوديسيل كبريتات الصوديوم بولي أكريلاميد جل الكهربائي (SDS-PAGE) ، والتي يمكن اكتشافها بواسطة تقنيات مثل التألق المناعي واللطخة الغربية 5,7. بهذه الطريقة ، يعد اقتران LC3 حدثا رئيسيا في عملية الالتهام الذاتي التي يمكن استخدامها لقياس نشاط الالتهام الذاتي.
الخلية العنيبية البنكرياسية هي خلية شديدة التمايز ، في ظل ظروف صحية ، لديها معدل منخفض من الالتهام الذاتي. ومع ذلك ، في ظروف فسيولوجية مختلفة أو تحت التحفيز الدوائي ، يمكنهم تنشيط الالتهام الذاتي. لذلك ، فإن تحديد مستويات الالتهام الذاتي في خط الخلية هذا مفيد لدراسة الآثار المباشرة أو غير المباشرة المحتملة للعوامل الدوائية أو البيولوجية المختلفة على الالتهام الذاتي 8,9.
يعد سرطان البنكرياس الغدي القنوي أحد أكثر أنواع السرطان فتكا ، نظرا لتشخيصه المتأخر ومقاومته العالية للعلاج الكيميائي10. تتمتع خلايا سرطان البنكرياس بنشاط الالتهام الذاتي العالي بسبب التنظيم النسخي والتنشيط اللاحق للبروتينات المرتبطة بالالتهام الذاتي11. قد تقوم خلايا سرطان البنكرياس بتعديل مستويات الالتهام الذاتي استجابة للظروف غير المواتية مثل نقص الأكسجة أو الحرمان من المغذيات أو التلف الناجم عن العلاج الكيميائي11. وبالتالي ، فإن تحليل مستويات الالتهام الذاتي في خلايا سرطان البنكرياس يمكن أن يساعد في فهم كيفية تكيفها مع البيئات المختلفة وتقييم فعالية علاجات تعديل الالتهام الذاتي.
تظهر هذه الدراسة طريقة لأداء التألق المناعي LC3 في نموذجين خلويين متميزين للبنكرياس. النموذج الأول ، خلايا PANC-1 ، بمثابة نموذج لسرطان الغدة القنوية البنكرياس. تم علاج هذه الخلايا باستخدام gemcitabine ، وهو عامل علاج كيميائي ثبت سابقا أنه يحفز الالتهام الذاتي ، وتحديدا في خلايا سرطان البنكرياس التي تحمل جين فيروس ساركوما الفئران كيرستن (KRAS) 12,13. النموذج الثاني ، خلايا AR42J ، كان بمثابة نموذج فسيولوجي أكثر لخلايا البنكرياس الخارجية الإفراز. تم تمييز هذه الخلايا مع ديكساميثازون لتصبح أكثر تشابها مع خلايا البنكرياس الأسينار14. في هذه الخلايا ، تم تحفيز الالتهام الذاتي دوائيا من خلال استخدام PP242 ، وهو مثبط قوي ل mTOR15. في هذه الدراسة ، نوضح قابلية تطبيق البروتوكول الموصوف بنموذجين مختلفين للبنكرياس وقدرته على التمييز بين حالات الالتهام الذاتي المنخفض والعالي.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10x Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>46-013-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 mm round coverslips</td>
			<td>HDA</td>
			<td>CBR_OBJ_6467</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 Well- Cell Culture Plate</td>
			<td>Sorfa</td>
			<td>220300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute ethanol</td>
			<td>Biopack</td>
			<td>2207.10.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 Donkey anti-rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R37119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Laser Scanning Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM 800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>62248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D4902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEN</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>01-052-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>NATOCOR&#160;</td>
			<td>Lintc-634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gemcitabina</td>
			<td>Eli Lilly</td>
			<td>VL7502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC3B (D11) XP Rabbit mAb</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>3868S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Anedra</td>
			<td>6197</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm &#34;M&#34; (Laboratory Sealing Film)</td>
			<td>Bemis/Curwood</td>
			<td>PM-996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Strep Solution</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>03-031-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PP242</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>SC-301606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11570626</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluating autophagy levels in two different pancreatic cell models using lc3 immunofluorescence

الالتهام الذاتي هو عملية تقويضية متخصصة تؤدي إلى تحلل المكونات السيتوبلازمية بشكل انتقائي ، بما في ذلك البروتينات والعضيات التالفة. يسمح الالتهام الذاتي للخلايا بالاستجابة الفسيولوجية لمحفزات الإجهاد ، وبالتالي الحفاظ على التوازن الخلوي. قد تعدل الخلايا السرطانية مستويات الالتهام الذاتي للتكيف مع الظروف المعاكسة مثل نقص الأكسجة أو نقص المغذيات أو التلف الناجم عن العلاج الكيميائي. يعد سرطان البنكرياس الغدي القنوي أحد أكثر أنواع السرطان فتكا. تتمتع خلايا سرطان البنكرياس بنشاط التهام الذاتي العالي بسبب التنظيم النسخي والتنشيط بعد الترجمة لبروتينات الالتهام الذاتي.
هنا ، تم استخدام خط خلايا PANC-1 كنموذج لخلايا سرطان البنكرياس البشرية ، وتم استخدام خط خلايا البنكرياس acinar AR42J كنموذج فسيولوجي لخلايا الثدييات شديدة التمايز. استخدمت هذه الدراسة التألق المناعي لسلسلة ضوء البروتين المرتبطة بالأنابيب الدقيقة 3 (LC3) كمؤشر لحالة تنشيط الالتهام الذاتي. LC3 هو بروتين الالتهام الذاتي الذي يظهر ، في الظروف القاعدية ، نمطا منتشرا للتوزيع في السيتوبلازم (المعروف باسم LC3-I في هذه الحالة). يؤدي تحريض الالتهام الذاتي إلى اقتران LC3 بالفوسفاتيديل إيثانولامين على سطح البلعمة الذاتية المشكلة حديثا لتشكيل LC3-II ، وهو بروتين مرتبط بالغشاء يساعد في تكوين وتوسيع البلعمة الذاتية. لتحديد عدد هياكل الالتهام الذاتي الموسومة ، تم استخدام برنامج FIJI مفتوح المصدر بمساعدة أداة "3D Objects Counter".
يسمح لنا قياس مستويات الالتهام الذاتي في كل من الظروف الفسيولوجية والخلايا السرطانية بدراسة تعديل الالتهام الذاتي في ظل ظروف متنوعة مثل نقص الأكسجة أو العلاج الكيميائي أو ضربة قاضية لبعض البروتينات.

يقوم هذا البروتوكول بإجراء التألق المناعي ل LC3 في خطوط خلايا البنكرياس لتحديد مستويات الالتهام الذاتي في ظروف مختلفة. كانت نتيجة هذه التجربة هي مراقبة الصور الخلوية من القنوات الحمراء والزرقاء ، المقابلة ل LC3 و DAPI. تشير صور LC3 إلى التوزيع الخلوي لهذا البروتين ، بينما يوضح DAPI التوطين النووي....

Watch this Scientific Journal Video about Evaluating Autophagy Levels in Two Different Pancreatic Cell Models Using LC3 Immunofluorescence at JoVE.com

Evaluating Autophagy Levels in Two Different Pancreatic Cell Models Using LC3 Immunofluorescence

الهدف من هذا البروتوكول هو تحديد مستويات الالتهام الذاتي في سرطان البنكرياس وخلايا أسينار البنكرياس من خلال التألق المناعي LC3 والقياس الكمي لنقطة LC3.

تقييم مستويات الالتهام الذاتي في نموذجين مختلفين لخلايا البنكرياس باستخدام التألق المناعي LC3

Autophagy is a specialized catabolic process that selectively degrades cytoplasmic components, including proteins and damaged organelles. Autophagy allows ...

يتيح التألق المناعي LC3 تحديد مستويات الالتهام الذاتي في خلايا البنكرياس. يسمح بدراسة الآثار المحتملة للعوامل المختلفة على الالتهام الذاتي لخلايا البنكرياس. التألق المناعي هو تقنية تستخدم للكشف عن بروتين LC3 الداخلي ، والذي يتجنب المشاكل الناجمة عن الإفراط في التعبير عن LC3 ، مثل تكوين مجاميع البروتين غير المرتبطة بالالتهام الذاتي.وسيظهر الإجراء فيليبي رينا، خريج الدكتوراه، ومالينا هيريرا لوبيز، طالبة دكتوراه من مختبر ماريا إينيس فاكارو. لبدء تحضير الخلية ، انقع غطاء دائري 12 ملم في الإيثانول المطلق. بعد إزالة الغطاء ، ضع الغطاء المنقوع عموديا في اللوحة المكونة من 24 بئرا.قم بتعريض اللوحة متعددة الآبار للأشعة فوق البنفسجية لمدة 15 دقيقة. ثم ضع الغطاء أفقيا واغسله باستخدام DMEM. انظر الآن إلى انخفاض عدد خلايا البنكرياس ، التي أعيد تعليقها في DMEM ، والتي تحتوي على 10٪ FBS والبنسلين والستربتومايسين ، واحتضان الخلايا لمدة يومين.بعد يومين من بذر الخلايا ، قم بإعداد محلول gemcitabine في DMEM بتركيز ميكروغرام واحد لكل ميكرولتر. ثم نضح نصف الحجم من كل بئر في أنبوب منفصل ، وأضف كمية مناسبة من محلول gemcitabine. أعد نصف الحجم المقابل لكل بئر مرة أخرى إلى الآبار المعالجة ، واحتضان الخلايا لمدة 24 ساعة.لتثبيت الخلايا ونفاذها ، أضف الميثانول البارد إلى صفيحة تحتوي على خلايا مكونة من 24 بئرا. أيضا إعداد لوحة ستة بئر مع برنامج تلفزيوني بارد. باستخدام إبرة حقنة وملاقط ، خذ كل زلة غطاء واغسلها مرتين في برنامج تلفزيوني.ثم احتضان في الميثانول لمدة ست دقائق. بعد الغسيل مرتين باستخدام PBS ، احتضان انزلاق الغطاء في محلول مانع لمدة ساعة واحدة. أضف مضاد LC3 في محلول الحجب بنسبة واحد إلى 1000 ، واحتفظ به على الجليد.ضع قطعة من فيلم الختم المختبري فوق الغطاء متعدد الآبار ، وأضف 25 ميكرولترا من محلول مضاد LC3 لكل انزلاق غطاء فوق فيلم الختم. باستخدام إبرة حقنة وملاقط ، ضع كل غطاء ينزلق فوق قطرة الجسم المضاد الأولية ، مع التأكد من أن جانب الخلية ملامس للمحلول. ضع اللوحة متعددة الآبار في غرفة الرطوبة.غطيها بورق احباط واحتضانها طوال الليل في الثلاجة. في اليوم التالي ، قم بإزالة اللوحة متعددة الآبار من غرفة الرطوبة. ضع الغطاء ينزلق مرة أخرى على اللوحة متعددة الآبار واغسلها باستخدام برنامج تلفزيوني ثلاث مرات.تمييع مكافحة الأرانب المسمى الفلورسنت في محلول مانع بنسبة واحد إلى 800 ، والحفاظ على الجليد في الظلام. بعد إغلاق الغطاء متعدد الآبار ، أضف 25 ميكرولترا من المحلول المضاد للأرانب لكل انزلاق غطاء فوق فيلم الختم. وعالج انزلاق الغطاء بجسم مضاد ثانوي كما هو موضح سابقا.ثم احتضان اللوحة في غرفة الرطوبة لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة ، محمية من الضوء. في نهاية الحضانة بالأجسام المضادة ، اغسل انزلاق الغطاء على اللوحة متعددة الآبار باستخدام PBS ثلاث مرات. احتضن كل زلة غطاء بمحلول DAPI المحضر لمدة 10 دقائق.بمجرد غسلها باستخدام برنامج تلفزيوني ، حافظ على اللوحة متعددة الآبار في الظلام. لمونتاج الخلية ، قم بإعداد كأسين بالماء وقطعة من الورق. أضف 10 ميكرولتر من محلول PVA-DABCO لكل غطاء منزلق على شريحة.اغسل الغطاء في الماء ، ثم جففه على الورق. أخيرا ، ضعه فوق قطرة PVA-DABCO. وتجف بين عشية وضحاها في الظلام.في اليوم التالي ، باستخدام مجهر متحد البؤر مقلوب ، تصور الخلايا المسماة والتقاط الصور. بعد التقاط الصور ، اسحب وأفلت كل ملف صورة يحتوي على القنوات الملتقطة في شاشة فيجي. في مربع الحوار، انقر فوق موافق لفتح الصورة.ثم أغلق نافذة وحدة التحكم المفتوحة. من علامة التبويب صورة، حدد اللون، ثم تقسيم القنوات. أغلق الصورة المقابلة للقنوات الأخرى غير صورة LC3.ثم في علامة التبويب صورة ، حدد ضبط ، متبوعا بتوازن اللون. حرك شريط التمرير الأقصى إلى اليسار حتى تتشبع الصورة لتصور ملامح الخلية. استخدم أداة التحديد اليدوي لرسم حدود الخلية، وانقر إعادة تعيين لضبط الألوان.لقص العنصر المحدد من علامة التبويب تحرير، حدد قص، وأغلق الصورة بدون حفظها. ومن علامة التبويب تحرير ، حدد لصق. في القائمة تحليل ، اختر الأداة 3D Objects Counter.اضبط الحد الأدنى على 2000 ، ومرشح الحجم على 50 إلى 500. تأكد من وضع علامة على الكائنات ومربعات الملخص ، وانقر فوق OK.In نافذة السجل ، وسيتم وصف عدد النقاط على أنها كائنات تم اكتشافها. أشار التألق المناعي إلى التوزيع الخلوي لبروتين LC3 ، بينما أظهر DAPI توطينا نوويا في خلايا البنكرياس.زادت نقاط LC3 بشكل ملحوظ تحت علاج gemcitabine ، مما يشير إلى نشاط الالتهام الذاتي. في ظل الالتقاء المفرط ، تميل خلايا البنكرياس الخارجية الإفراز إلى التراكم والنمو فوق بعضها البعض. كانت طريقة تثبيت خلايا بارافورمالدهايد غير فعالة للحفاظ على بروتينات LC3 ، لأنها لا تعكس التوزيع الدقيق.عندما تم إجراء التثبيت أو العلاج دون الانتظار يومين بعد البذر ، كان لخلايا PANC1 شكل دائري. قلل هذا التشكل من العلاقة بين السيتوبلازم والنواة ، مما يجعل من الصعب فهم التوزيع داخل الخلايا ل LC3. يمكن أن يتداخل التثبيت غير المكتمل للميثانول مع وضع العلامات المناعية المناسبة ل LC3 ، مما يؤدي إلى صور غير واضحة وتقدير كمي دون المستوى الأمثل.أهم شيء يجب تذكره خلال هذا الإجراء هو أنه يجب تثبيت الخلايا في الميثانول البارد لمدة ست دقائق ، بدلا من بارافورمالدهيد. باتباع هذا الإجراء ، يمكن تحليل التمركز المشترك بين LC3 والبروتينات الأخرى ، مما يسمح بدراسة المسارات الجزيئية المختلفة المتعلقة بوظائف LC3.

Research

JoVE Journal

Biology

Monitoring Dynamic Changes In Mitochondrial Calcium Levels During Apoptosis Using A Genetically Encoded Calcium Sensor

رصد التغيرات الدينامية في مستويات الكالسيوم الميتوكوندريا خلال موت الخلايا المبرمج باستخدام جهاز استشعار الكالسيوم مشفرة وراثيا

Dynamic changes in intracellular calcium concentration in response to various stimuli regulates many cellular processes such as proliferation, ...

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the I&middot;Cryo Kit

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the IÃƒâ€šÃ‚Â·Cryo Kit

الماوس حفظ بالبرودة والانتعاش الحيوانات المنوية باستخدام · لقد كرو كيت

Thousands of new genetically modified (GM) strains of mice have been created since the advent of transgenesis and knockout technologies.  Many of these ...

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

قياس مستويات هيم في تخليق خلايا الثدييات

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

Quantitative Immunofluorescence Assay to Measure the Variation in Protein Levels at Centrosomes

الكمية المناعي الفحص لقياس التفاوت في مستويات البروتين في Centrosomes

Centrosomes are small but important organelles that serve as the poles of mitotic spindle to maintain genomic integrity or assemble primary cilia to ...

Comparison of Three Different Methods for Determining Cell Proliferation in Breast Cancer Cell Lines

مقارنة بين ثلاث طرق مختلفة لتحديد انتشار الخلايا في خطوط خلايا سرطان الثدي

Measuring cell proliferation can be performed by a number of different methods, each with varying levels of sensitivity, reproducibility and compatibility ...

Activating Autophagy by Aerobic Exercise in Mice

تفعيل الالتهام الذاتي من قبل بممارسة الهوائية في الفئران

Autophagy is a lysosomal degradation pathway essential for cell homeostasis, function and differentiation. Under stress conditions, autophagy is induced ...

Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing

تحليل الكائنات المجهرية باستخدام ثنائي الخطوة PCR والجيل التالي من 16S rRNA التسلسل الجيني

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the ...

Functional Assessment of Kinesin-7 CENP-E in Spermatocytes Using In Vivo Inhibition, Immunofluorescence and Flow Cytometry

Functional Assessment of Kinesin-7 CENP-E in Spermatocytes Using In Vivo Inhibition, Immunofluorescence and Flow Cytometry

التقييم الوظيفي ل Kinesin-7 CENP-E في الخلايا المنوية باستخدام تثبيط الجسم الحي والتألق المناعي وقياس التدفق الخلوي

In eukaryotes, meiosis is essential for genome stability and genetic diversity in sexual reproduction. Experimental analyses of spermatocytes in testes ...

Analyzing Starvation-Induced Autophagy in the Drosophila melanogaster Larval Fat Body

Analyzing Starvation-Induced Autophagy in the Drosophila melanogaster Larval Fat Body

تحليل الالتهام الذاتي الناجم عن الجوع في الجسم الدهني ليرقات ذبابة الفاكهة

Autophagy is a cellular self-digestion process. It delivers cargo to the lysosomes for degradation in response to various stresses, including starvation. ...

Ultrastructural Localization of Endogenous LC3 by On-Section Correlative Light-Electron Microscopy

توطين البنية التحتية ل LC3 الداخلي بواسطة المجهر الإلكتروني الضوئي المترابط في المقطع

The visualization of autophagic organelles at the ultrastructural level by electron microscopy (EM) is essential to establish their identity and reveal ...