Name: evaluating autophagy levels in two different pancreatic cell models using lc3 immunofluorescence
Uploaded: 2023-04-28T13:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluating Autophagy Levels in Two Different Pancreatic Cell Models Using LC3 Immunofluorescence at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af tilskud fra universitetet i Buenos Aires (UBACyT 2018-2020 20020170100082BA), National Council for Scientific Research and Technology (CONICET) (PIP 2021-2023 GI− 11220200101549CO; og PUE 22920170100033) og National Agency for Scientific and Technological Promotion (PICT 2019-01664).

1. Celle forberedelse
<ol><li>Blødgør 12 mm runde dæksler i absolut ethanol, og læg dem lodret i brøndene på en plade med 24 brønde.</li>
	<li>Fjern dækslet, og udsæt multibrøndpladen for ultraviolet stråling i 15 minutter.</li>
	<li>Placer dækslerne vandret, og vask dem med Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM).</li>
	<li>Frø et lavt antal bugspytkirtelceller. Beløbet skal justeres for at opnå 50% -75% sammenløb på fikseringsdagen16. BEMÆRK: Det anbefales ...

<ol>
	<li>Grasso, D., Renna, F. J., Vaccaro, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initial+steps+in+mammalian+autophagosome+biogenesis.">Initial steps in mammalian autophagosome biogenesis.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 146 (2018).</li><li>Galluzzi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+definitions+of+autophagy+and+related+processes.">Molecular definitions of autophagy and related processes.</a> EMBO Journal. 36 (13), 1811-1836 (2017).</li><li>Kitada, M., Koya, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+in+metabolic+disease+and+ageing.">Autophagy in metabolic disease and ageing.</a> Nature Reviews Endocrinology. 17 (11), 647-661 (2021).</li><li>Ktistakis, N. T., Tooze, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digesting+the+expanding+mechanisms+of+autophagy.">Digesting the expanding mechanisms of autophagy.</a> Trends in Cell Biology. 26 (8), 624-635 (2016).</li><li>Tanida, I., Ueno, T., Kominami, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LC3+and+autophagy.">LC3 and autophagy.</a> Methods in Molecular Biology. 445, 77-88 (2008).</li><li>Kabeya, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LC3,+a+mammalian+homologue+of+yeast+Apg8p,+is+localized+in+autophagosome+membranes+after+processing.">LC3, a mammalian homologue of yeast Apg8p, is localized in autophagosome membranes after processing.</a> EMBO Journal. 19 (21), 5720-5728 (2000).</li><li>Mizushima, N., Yoshimori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+interpret+LC3+immunoblotting.">How to interpret LC3 immunoblotting.</a> Autophagy. 3 (6), 542-545 (2007).</li><li>Vanasco, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dynamics+and+VMP1-related+selective+mitophagy+in+experimental+acute+pancreatitis.">Mitochondrial dynamics and VMP1-related selective mitophagy in experimental acute pancreatitis.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 640094 (2021).</li><li>Williams, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+mechanisms+in+pancreas+and+salivary+acini.">Regulatory mechanisms in pancreas and salivary acini.</a> Annual Review of Physiology. 46, 361-375 (1984).</li><li>Mizrahi, J. D., Surana, R., Valle, J. W., Shroff, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+cancer.">Pancreatic cancer.</a> Lancet. 395 (10242), 2008-2020 (2020).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+and+function+of+autophagy+in+pancreatic+cancer.">Regulation and function of autophagy in pancreatic cancer.</a> Autophagy. 17 (11), 3275-3296 (2021).</li><li>Ropolo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+E2F1-EP300-VMP1+pathway+mediates+gemcitabine-induced+autophagy+in+pancreatic+cancer+cells+carrying+oncogenic+KRAS.">A novel E2F1-EP300-VMP1 pathway mediates gemcitabine-induced autophagy in pancreatic cancer cells carrying oncogenic KRAS.</a> Frontiers in Endocrinology. 11, 411 (2020).</li><li>Pardo, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gemcitabine+induces+the+VMP1-mediated+autophagy+pathway+to+promote+apoptotic+death+in+human+pancreatic+cancer+cells.">Gemcitabine induces the VMP1-mediated autophagy pathway to promote apoptotic death in human pancreatic cancer cells.</a> Pancreatology. 10 (1), 19-26 (2010).</li><li>Logsdon, C. D., Moessner, J., Williams, J. A., Goldfine, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucocorticoids+increase+amylase+mRNA+levels,+secretory+organelles,+and+secretion+in+pancreatic+acinar+AR42J+cells.">Glucocorticoids increase amylase mRNA levels, secretory organelles, and secretion in pancreatic acinar AR42J cells.</a> Journal of Cell Biology. 100 (4), 1200-1208 (1985).</li><li>Klionsky, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+assays+for+monitoring+autophagy+(4th+edition).">Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (4th edition).</a> Autophagy. 17 (1), 1 (2021).</li><li>Segeritz, C. -. P., Vallier, L., Jalali, M., Saldanha, F. Y. L., Jalali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+9+-+Cell+culture:+Growing+cells+as+model+systems+in+vitro.">Chapter 9 - Cell culture: Growing cells as model systems in vitro.</a> Basic Science Methods for Clinical Researchers. , 151-172 (2017).</li><li>Elliott, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+microscopy:+Principles+and+modern+practices.">Confocal microscopy: Principles and modern practices.</a> Current Protocols in Cytometry. 92 (1), 68 (2020).</li><li>Grasso, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+novel+selective+autophagy+pathway+mediated+by+VMP1-USP9x-p62,+prevents+pancreatic+cell+death.">a novel selective autophagy pathway mediated by VMP1-USP9x-p62, prevents pancreatic cell death.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (10), 8308-8324 (2011).</li><li>Ropolo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pancreatitis-induced+vacuole+membrane+protein+1+triggers+autophagy+in+mammalian+cells.">The pancreatitis-induced vacuole membrane protein 1 triggers autophagy in mammalian cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 282 (51), 37124-37133 (2007).</li><li>Karanasios, E., Stapleton, E., Walker, S. A., Manifava, M., Ktistakis, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+imaging+of+early+autophagy+events:+Omegasomes+and+beyond.">Live cell imaging of early autophagy events: Omegasomes and beyond.</a> Journal of Visualized Experiments. (77), e50484 (2013).</li><li>Kuma, A., Matsui, M., Mizushima, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LC3,+an+autophagosome+marker,+can+be+incorporated+into+protein+aggregates+independent+of+autophagy:+caution+in+the+interpretation+of+LC3+localization.">LC3, an autophagosome marker, can be incorporated into protein aggregates independent of autophagy: caution in the interpretation of LC3 localization.</a> Autophagy. 3 (4), 323-328 (2007).</li><li>Zhang, Z., Singh, R., Aschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+the+detection+of+autophagy+in+mammalian+cells.">Methods for the detection of autophagy in mammalian cells.</a> Current Protocols in Toxicology. 69, 1-26 (2016).</li><li>Yoshii, S. R., Mizushima, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+and+measuring+autophagy.">Monitoring and measuring autophagy.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (9), 1865 (2017).</li><li>Betriu, N., Andreeva, A., Semino, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erlotinib+promotes+ligand-induced+EGFR+degradation+in+3D+but+not+2D+cultures+of+pancreatic+ductal+adenocarcinoma+cells.">Erlotinib promotes ligand-induced EGFR degradation in 3D but not 2D cultures of pancreatic ductal adenocarcinoma cells.</a> Cancers. 13 (18), 4504 (2021).</li><li>Wang, W., Dong, L., Zhao, B., Lu, J., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E-cadherin+is+downregulated+by+microenvironmental+changes+in+pancreatic+cancer+and+induces+EMT.">E-cadherin is downregulated by microenvironmental changes in pancreatic cancer and induces EMT.</a> Oncology Reports. 40 (3), 1641-1649 (2018).</li><li>Kim, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+heterogeneity+and+plasticity+of+cancer+cell+migration+in+a+pancreatic+tumor+three-dimensional+culture+model.">Phenotypic heterogeneity and plasticity of cancer cell migration in a pancreatic tumor three-dimensional culture model.</a> Cancers. 12 (5), 1305 (2020).</li><li>Meng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+EpCAM+over-expression+is+associated+with+favorable+clinical+outcomes+in+pancreatic+cancer+patients+with+Hepatitis+B+virus+negative+infection.">Cytoplasmic EpCAM over-expression is associated with favorable clinical outcomes in pancreatic cancer patients with Hepatitis B virus negative infection.</a> International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 8 (12), 22204-22216 (2015).</li><li>Brock, R., Hamelers, I. H., Jovin, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+fixation+protocols+for+adherent+cultured+cells+applied+to+a+GFP+fusion+protein+of+the+epidermal+growth+factor+receptor.">Comparison of fixation protocols for adherent cultured cells applied to a GFP fusion protein of the epidermal growth factor receptor.</a> Cytometry. 35 (4), 353-362 (1999).</li></ol>

Metoden beskrevet i denne protokol gør det muligt at visualisere den endogene LC3-fordeling i cellen og kvantificere de autofagiske niveauer under forskellige forhold. En anden lignende metode, der anvendes til at analysere LC3-fordelingen og bestemme autofagiaktivering, involverer fluorescensmærket LC3-transfektion (såsom RFP-LC3)19. RFP-LC3-transfektion har fordelene ved ikke at have brug for fiksering (hvilket gør det muligt at anvende denne metode i levende cellebilleddannelse<sup class="x...

Makroautofagi (almindeligvis benævnt autofagi) er en specialiseret katabolisk proces, der selektivt nedbryder cytoplasmatiske komponenter, herunder proteiner og beskadigede organeller 1,2. Autofagi gør det muligt for celler fysiologisk at reagere på stressstimuli og dermed opretholde cellulær homeostase3. Under autofagi dannes en dobbelt membranvesikel: autofagosomet. Autofagosomet indeholder lastmolekylerne og driver dem til lysosomet for nedbrydning 1,4.
Autofagosomer er dekoreret af det autofagiske protein mikrotubulus-associerede protein lyskæde 3 (LC3)5. Når autofagi ikke induceres, diffunderes LC3 i cytoplasmaet og kernen i LC3-I-konformationen. På den anden side, når autofagi induceres, konjugeres LC3 med et phosphatidylethanolamin i membranen i de autofagiske strukturer6. Denne nye LC3-konformation er kendt som LC3-II1. LC3-konformationsskiftet forårsager ændringer i dets cellulære lokalisering og dets dodecylnatriumsulfat-polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) migration, som kan detekteres ved teknikker som immunofluorescens og western blot 5,7. På denne måde er LC3-konjugering en nøglebegivenhed i den autofagiske proces, der kan bruges til at måle autofagisk aktivitet.
Acinarcellen i bugspytkirtlen er en stærkt differentieret celle, der under sunde forhold har en lav autofagi. Under forskellige fysiologiske forhold eller under farmakologisk stimulering kan de imidlertid aktivere autofagi. Derfor er bestemmelsen af autofagiske niveauer i denne cellelinje nyttig til undersøgelse af de potentielle direkte eller indirekte virkninger af forskellige farmakologiske eller biologiske agenser på autofagi 8,9.
Duktalt pancreas adenocarcinom er en af de dødeligste kræftformer i betragtning af dens sene diagnose og dens høje kemoterapiresistens10. Kræftceller i bugspytkirtlen har høj autofagiaktivitet på grund af transkriptionel opregulering og posttranslationel aktivering af autofagirelaterede proteiner11. Kræftceller i bugspytkirtlen kan justere deres autofaginiveauer som reaktion på ugunstige tilstande som hypoxi, næringsstofmangel eller kemoterapi-induceret skade11. Derfor kan analyse af autofaginiveauerne i kræftceller i bugspytkirtlen hjælpe med at forstå, hvordan de tilpasser sig forskellige miljøer og evaluere effektiviteten af autofagimodulerende behandlinger.
Denne undersøgelse viser en metode til at udføre LC3-immunfluorescens i to forskellige cellulære modeller i bugspytkirtlen. Den første model, PANC-1-celler, tjente som model for pancreas ductal adenocarcinom. Disse celler blev behandlet med gemcitabin, et kemoterapimiddel, der tidligere har vist sig at inducere autofagi, specifikt i kræftceller i bugspytkirtlen, der bærer det onkogene Kirsten rottesarkomvirusgen (KRAS)12,13. Den anden model, AR42J-celler, fungerede som en mere fysiologisk model af eksokrine bugspytkirtelceller. Disse celler blev differentieret med dexamethason for at blive mere lig acinar bugspytkirtelceller14. I disse celler blev autofagi farmakologisk induceret ved anvendelse af PP242, som er en potent mTOR-hæmmer15. I denne undersøgelse demonstrerer vi anvendeligheden af den beskrevne protokol med to forskellige bugspytkirtelmodeller og dens evne til at skelne mellem tilstande med lav og høj autofagi.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10x Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>46-013-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 mm round coverslips</td>
			<td>HDA</td>
			<td>CBR_OBJ_6467</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 Well- Cell Culture Plate</td>
			<td>Sorfa</td>
			<td>220300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute ethanol</td>
			<td>Biopack</td>
			<td>2207.10.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 Donkey anti-rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R37119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Laser Scanning Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM 800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>62248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D4902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEN</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>01-052-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>NATOCOR&#160;</td>
			<td>Lintc-634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gemcitabina</td>
			<td>Eli Lilly</td>
			<td>VL7502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC3B (D11) XP Rabbit mAb</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>3868S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Anedra</td>
			<td>6197</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm &#34;M&#34; (Laboratory Sealing Film)</td>
			<td>Bemis/Curwood</td>
			<td>PM-996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Strep Solution</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>03-031-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PP242</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>SC-301606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11570626</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluating autophagy levels in two different pancreatic cell models using lc3 immunofluorescence

Autofagi er en specialiseret katabolisk proces, der selektivt nedbryder cytoplasmatiske komponenter, herunder proteiner og beskadigede organeller. Autofagi gør det muligt for celler fysiologisk at reagere på stressstimuli og dermed opretholde cellulær homeostase. Kræftceller kan modulere deres autofaginiveauer for at tilpasse sig ugunstige tilstande som hypoxi, næringsstofmangel eller skader forårsaget af kemoterapi. Ductal pancreas adenocarcinom er en af de dødeligste former for kræft. Kræftceller i bugspytkirtlen har høj autofagiaktivitet på grund af transkriptionel opregulering og posttranslationel aktivering af autofagiproteiner.
Her blev PANC-1-cellelinjen brugt som model af humane kræftceller i bugspytkirtlen, og AR42J-pancreas acinarcellelinjen blev brugt som en fysiologisk model af højt differentierede pattedyrceller. Denne undersøgelse anvendte immunofluorescensen af mikrotubulusassocieret protein lyskæde 3 (LC3) som en indikator for status for autofagiaktivering. LC3 er et autofagiprotein, der under basale forhold viser et diffust fordelingsmønster i cytoplasmaet (kendt som LC3-I i denne tilstand). Autofagi induktion udløser konjugering af LC3 til phosphatidylethanolamin på overfladen af nydannede autofagosomer til dannelse af LC3-II, et membranbundet protein, der hjælper med dannelsen og udvidelsen af autofagosomer. For at kvantificere antallet af mærkede autofagiske strukturer blev open source-softwaren FIJI brugt ved hjælp af værktøjet "3D Objects Counter".
Målingen af de autofagiske niveauer både under fysiologiske forhold og i kræftceller giver os mulighed for at studere moduleringen af autofagi under forskellige forhold som hypoxi, kemoterapibehandling eller knockdown af visse proteiner.

Denne protokol udfører immunofluorescens af LC3 i bugspytkirtelcellelinjer for at bestemme autofaginiveauerne under forskellige forhold. Resultatet af dette eksperiment var opnåelsen af cellulære billeder fra de røde og blå kanaler, svarende til LC3 og DAPI. LC3-billederne angiver den cellulære fordeling af dette protein, mens DAPI viser den nukleare lokalisering. Figur 2A viser et repræsentativt billede af immunfluorescensen af LC3 og dets fusion med DAPI-farvning i PANC-1-celler und...

Watch this Scientific Journal Video about Evaluating Autophagy Levels in Two Different Pancreatic Cell Models Using LC3 Immunofluorescence at JoVE.com

Evaluating Autophagy Levels in Two Different Pancreatic Cell Models Using LC3 Immunofluorescence

Målet med denne protokol er at bestemme autofagiske niveauer i kræft i bugspytkirtlen og pancreas acinarceller gennem LC3 immunofluorescens og LC3 dot kvantificering.

Evaluering af autofaginiveauer i to forskellige bugspytkirtelcellemodeller ved hjælp af LC3-immunofluorescens

Autophagy is a specialized catabolic process that selectively degrades cytoplasmic components, including proteins and damaged organelles. Autophagy allows ...

LC3-immunofluorescensen muliggør bestemmelse af autofaginiveauer i bugspytkirtelceller. Det gør det muligt at undersøge de potentielle virkninger af forskellige midler på bugspytkirtelcelleautofagi. Immunofluorescens er en teknik, der anvendes til at detektere endogent LC3-protein, som undgår problemer forårsaget af overekspression af LC3, såsom dannelse af proteinaggregater, der ikke er relateret til autofagi.Felipe Renna, ph.d.-kandidat, og Malena Herrera Lopez, ph.d.-studerende fra Maria Ines Vaccaros laboratorium, vil demonstrere proceduren. For at begynde celleforberedelse blødlægges 12 millimeter runde dæksler i absolut ethanol. Når du har fjernet dækslet, skal du placere det gennemblødte dæksel lodret i pladen med 24 brønde.Udsæt multibrøndpladen for ultraviolet stråling i 15 minutter. Placer derefter dækslet vandret og vask det med DMEM. Se nu det lave antal bugspytkirtelceller, resuspenderet i DMEM, indeholdende 10% FBS, penicillin og streptomycin, og inkuber cellerne i to dage.To dage efter cellesåning fremstilles gemcitabinopløsning i DMEM ved et mikrogram pr. mikroliter koncentration. Derefter suges halvdelen af volumenet fra hvert hul i et separat rør, og der tilsættes en passende mængde gemcitabinopløsning. Returner det halve volumen svarende til hver brønd tilbage i de behandlede huller, og inkuber cellerne i 24 timer.Til fastgørelse og permeabilisering af cellerne tilsættes kold methanol i en 24-brøndplade, der indeholder celler. Forbered også en seks-brøndplade med kold PBS. Brug en kanyle og pincet til at tage hver dæksel og vaske den to gange i PBS.Inkuber derefter i methanol i seks minutter. Efter vask to gange med PBS inkuberes dækslerne i en blokerende opløsning i en time. Der tilsættes en anti LC3 i blokeringsopløsningen i forholdet en til 1000, og den holdes på is.Anbring et stykke laboratorieforseglingsfilm over multibrøndlåget, og tilsæt 25 mikroliter anti-LC3-opløsning pr. Dæksel glide over tætningsfilmen. Brug en sprøjtenål og pincet til at placere hvert dæksel over det primære antistoffald, og sørg for, at cellesiden er i kontakt med opløsningen. Placer multibrøndpladen i fugtighedskammeret.Dæk det med folie og inkuber natten over i køleskabet. Den næste dag fjernes multibrøndpladen fra fugtighedskammeret. Placer dækslet glide tilbage på multibrøndpladen og vask dem med PBS tre gange.Fortynd fluorescerende mærket antikanin i blokerende opløsning i et forhold på en til 800, og hold på is i mørket. Efter forsegling af multibrøndlåget tilsættes 25 mikroliter anti-kaninopløsning pr. Dæksel, der glider over tætningsfilmen. Og behandl dækselen med et sekundært antistof som tidligere påvist.Derefter inkuberes pladen i fugtighedskammeret i to timer ved stuetemperatur, beskyttet mod lys. Ved afslutningen af inkubation med antistof vaskes dækslet på multibrøndpladen med PBS tre gange. Hvert dæksel inkuberes med den tilberedte DAPI-opløsning i 10 minutter.Når den er vasket med PBS, skal du holde multibrøndpladen i mørke. Til cellemontage skal du forberede to bægerglas med vand og et stykke papir. Tilsæt 10 mikroliter PVA-DABCO-opløsning pr. dæksel på et dias.Vask dækslet i vand, og tør det derefter på papir. Til sidst skal du placere den over PVA-DABCO-dråben. Og tør natten over i mørket.Den næste dag, ved hjælp af et omvendt konfokalmikroskop, visualisere de mærkede celler og fange billederne. Når du har taget billeder, skal du trække og slippe hver billedfil, der indeholder de optagne kanaler på Fiji-skærmen. Klik på OK i dialogboksen for at åbne billedet.Luk derefter det åbnede konsolvindue. Fra fanen Billede skal du vælge Farve og derefter Opdel kanaler. Luk det billede, der svarer til andre kanaler end LC3-billedet.Vælg derefter Juster på fanen Billede efterfulgt af Farvebalance. Flyt den maksimale skyder til venstre, indtil billedet mættes for at visualisere cellekonturerne. Brug frihåndsmarkeringsværktøjet til at tegne cellekonturen, og klik på nulstil for at justere farverne.Hvis du vil klippe det markerede element fra fanen Rediger, skal du vælge Klip og lukke billedet uden at gemme det. Og fra fanen Rediger skal du vælge indsæt. I menuen Analysér skal du vælge værktøjet 3D-objekttæller.Indstil tærsklen til 2000 og størrelsesfilteret til 50 til 500. Sørg for, at objekterne og oversigtsfelterne er markeret, og klik på OK.In logvinduet, antallet af prikker beskrives som registrerede objekter. Immunofluorescensen indikerede den cellulære fordeling af LC3-protein, mens DAPI viste nuklear lokalisering i bugspytkirtelceller.LC3-prikkerne steg signifikant under gemcitabinbehandling, hvilket indikerer autofagisk aktivitet. Under en overdreven sammenflugt har de eksokrine bugspytkirtelceller tendens til at hobe sig op og vokse oven på hinanden. Paraformaldehydcellefikseringsmetoden var ineffektiv til konservering af LC3-proteiner, da den ikke afspejlede nøjagtig fordeling.Når fiksering eller behandling blev udført uden at vente to dage efter såning, havde PANC1-cellerne en rund form. Denne morfologi reducerede forholdet mellem cytoplasma og kerne, hvilket gjorde det vanskeligt at forstå den intracellulære fordeling af LC3. Ufuldstændig methanolfiksering kan forstyrre korrekt LC3-immunmærkning, hvilket fører til uklare billeder og suboptimal kvantificering.Det vigtigste at huske under denne procedure er, at cellerne skal fastgøres i kold methanol i seks minutter i stedet for paraformaldehyd. Efter denne procedure kan colokalisering mellem LC3 og andre proteiner analyseres, hvilket muliggør undersøgelse af forskellige molekylære veje relateret til LC3-funktioner.

Research

JoVE Journal

Biology

Monitoring Dynamic Changes In Mitochondrial Calcium Levels During Apoptosis Using A Genetically Encoded Calcium Sensor

Dynamic changes in intracellular calcium concentration in response to various stimuli regulates many cellular processes such as proliferation, ...

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the I&middot;Cryo Kit

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the IÃƒâ€šÃ‚Â·Cryo Kit

Mus Sperm Kryopræservering og Recovery bruger I · Cryo Kit

Thousands of new genetically modified (GM) strains of mice have been created since the advent of transgenesis and knockout technologies.  Many of these ...

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Måling af hæmoglobinsyntese Niveauer i pattedyrceller

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

Quantitative Immunofluorescence Assay to Measure the Variation in Protein Levels at Centrosomes

Kvantitativ immunofluorescensassay at måle variationen i proteinniveauer på centrosomer

Centrosomes are small but important organelles that serve as the poles of mitotic spindle to maintain genomic integrity or assemble primary cilia to ...

Comparison of Three Different Methods for Determining Cell Proliferation in Breast Cancer Cell Lines

Sammenligning af tre forskellige metoder til bestemmelse celleproliferation i brystcancercellelinier

Measuring cell proliferation can be performed by a number of different methods, each with varying levels of sensitivity, reproducibility and compatibility ...

Activating Autophagy by Aerobic Exercise in Mice

Aktivering Autophagy ved aerob træning i mus

Autophagy is a lysosomal degradation pathway essential for cell homeostasis, function and differentiation. Under stress conditions, autophagy is induced ...

Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing

Mikrobiota-analyse ved hjælp af to-trins PCR og næste generations 16S rRNA-Gensekvensering

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the ...

Functional Assessment of Kinesin-7 CENP-E in Spermatocytes Using In Vivo Inhibition, Immunofluorescence and Flow Cytometry

Functional Assessment of Kinesin-7 CENP-E in Spermatocytes Using In Vivo Inhibition, Immunofluorescence and Flow Cytometry

Funktionel vurdering af kinesin-7 CENP-E i spermatocytter ved anvendelse af in vivo-hæmning , immunofluorescens og flowcytometri

In eukaryotes, meiosis is essential for genome stability and genetic diversity in sexual reproduction. Experimental analyses of spermatocytes in testes ...

Analyzing Starvation-Induced Autophagy in the Drosophila melanogaster Larval Fat Body

Analyzing Starvation-Induced Autophagy in the Drosophila melanogaster Larval Fat Body

Analyse af sult-induceret autofagi i Drosophila melanogaster Larve Fat Body

Autophagy is a cellular self-digestion process. It delivers cargo to the lysosomes for degradation in response to various stresses, including starvation. ...

Ultrastructural Localization of Endogenous LC3 by On-Section Correlative Light-Electron Microscopy

Ultrastrukturel lokalisering af endogen LC3 ved korrelativ lyselektronmikroskopi på sektionen

The visualization of autophagic organelles at the ultrastructural level by electron microscopy (EM) is essential to establish their identity and reveal ...