Name: evaluating autophagy levels in two different pancreatic cell models using lc3 immunofluorescence
Uploaded: 2023-04-28T13:40:00
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Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der Universität Buenos Aires (UBACyT 2018-2020 20020170100082BA), des Nationalen Rates für wissenschaftliche Forschung und Technologie (CONICET) (PIP 2021-2023 GI− 11220200101549CO; und PUE 22920170100033) und der Nationalen Agentur für wissenschaftliche und technologische Förderung (PICT 2019-01664) unterstützt.

1. Zellvorbereitung
<ol><li>Tränken Sie 12 mm runde Deckgläser in absolutem Ethanol und legen Sie sie senkrecht in die Vertiefungen einer 24-Well-Platte.</li>
	<li>Entfernen Sie die Abdeckung und setzen Sie die Multi-Well-Platte 15 Minuten lang ultravioletter Strahlung aus.</li>
	<li>Positionieren Sie die Deckgläser horizontal und waschen Sie sie mit Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM).</li>
	<li>Säen Sie eine geringe Anzahl von Pankreaszellen. Die Menge sollte so angepasst werden, dass am Tag d...

<ol>
	<li>Grasso, D., Renna, F. J., Vaccaro, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initial+steps+in+mammalian+autophagosome+biogenesis.">Initial steps in mammalian autophagosome biogenesis.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 146 (2018).</li><li>Galluzzi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+definitions+of+autophagy+and+related+processes.">Molecular definitions of autophagy and related processes.</a> EMBO Journal. 36 (13), 1811-1836 (2017).</li><li>Kitada, M., Koya, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+in+metabolic+disease+and+ageing.">Autophagy in metabolic disease and ageing.</a> Nature Reviews Endocrinology. 17 (11), 647-661 (2021).</li><li>Ktistakis, N. T., Tooze, S. 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D., Moessner, J., Williams, J. A., Goldfine, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucocorticoids+increase+amylase+mRNA+levels,+secretory+organelles,+and+secretion+in+pancreatic+acinar+AR42J+cells.">Glucocorticoids increase amylase mRNA levels, secretory organelles, and secretion in pancreatic acinar AR42J cells.</a> Journal of Cell Biology. 100 (4), 1200-1208 (1985).</li><li>Klionsky, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+assays+for+monitoring+autophagy+(4th+edition).">Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (4th edition).</a> Autophagy. 17 (1), 1 (2021).</li><li>Segeritz, C. -. P., Vallier, L., Jalali, M., Saldanha, F. Y. 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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+microscopy:+Principles+and+modern+practices.">Confocal microscopy: Principles and modern practices.</a> Current Protocols in Cytometry. 92 (1), 68 (2020).</li><li>Grasso, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+novel+selective+autophagy+pathway+mediated+by+VMP1-USP9x-p62,+prevents+pancreatic+cell+death.">a novel selective autophagy pathway mediated by VMP1-USP9x-p62, prevents pancreatic cell death.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (10), 8308-8324 (2011).</li><li>Ropolo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pancreatitis-induced+vacuole+membrane+protein+1+triggers+autophagy+in+mammalian+cells.">The pancreatitis-induced vacuole membrane protein 1 triggers autophagy in mammalian cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 282 (51), 37124-37133 (2007).</li><li>Karanasios, E., Stapleton, E., Walker, S. 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R., Mizushima, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+and+measuring+autophagy.">Monitoring and measuring autophagy.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (9), 1865 (2017).</li><li>Betriu, N., Andreeva, A., Semino, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erlotinib+promotes+ligand-induced+EGFR+degradation+in+3D+but+not+2D+cultures+of+pancreatic+ductal+adenocarcinoma+cells.">Erlotinib promotes ligand-induced EGFR degradation in 3D but not 2D cultures of pancreatic ductal adenocarcinoma cells.</a> Cancers. 13 (18), 4504 (2021).</li><li>Wang, W., Dong, L., Zhao, B., Lu, J., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E-cadherin+is+downregulated+by+microenvironmental+changes+in+pancreatic+cancer+and+induces+EMT.">E-cadherin is downregulated by microenvironmental changes in pancreatic cancer and induces EMT.</a> Oncology Reports. 40 (3), 1641-1649 (2018).</li><li>Kim, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+heterogeneity+and+plasticity+of+cancer+cell+migration+in+a+pancreatic+tumor+three-dimensional+culture+model.">Phenotypic heterogeneity and plasticity of cancer cell migration in a pancreatic tumor three-dimensional culture model.</a> Cancers. 12 (5), 1305 (2020).</li><li>Meng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+EpCAM+over-expression+is+associated+with+favorable+clinical+outcomes+in+pancreatic+cancer+patients+with+Hepatitis+B+virus+negative+infection.">Cytoplasmic EpCAM over-expression is associated with favorable clinical outcomes in pancreatic cancer patients with Hepatitis B virus negative infection.</a> International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 8 (12), 22204-22216 (2015).</li><li>Brock, R., Hamelers, I. H., Jovin, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+fixation+protocols+for+adherent+cultured+cells+applied+to+a+GFP+fusion+protein+of+the+epidermal+growth+factor+receptor.">Comparison of fixation protocols for adherent cultured cells applied to a GFP fusion protein of the epidermal growth factor receptor.</a> Cytometry. 35 (4), 353-362 (1999).</li></ol>

Die in diesem Protokoll beschriebene Methode ermöglicht es, die endogene LC3-Verteilung in der Zelle zu visualisieren und die autophagischen Konzentrationen unter verschiedenen Bedingungen zu quantifizieren. Eine weitere ähnliche Methode zur Analyse der LC3-Verteilung und zur Bestimmung der Autophagieaktivierung ist die fluoreszenzmarkierte LC3-Transfektion (z. B. RFP-LC3)19. Die RFP-LC3-Transfektion hat den Vorteil, dass keine Fixierung erforderlich ist (was die Anwendung dieser Methode in der ...

Makroautophagie (allgemein als Autophagie bezeichnet) ist ein spezialisierter kataboler Prozess, bei dem zytoplasmatische Komponenten, einschließlich Proteine und beschädigte Organellen, selektiv abgebaut werden 1,2. Autophagie ermöglicht es Zellen, physiologisch auf Stressreize zu reagieren und so die zelluläre Homöostase aufrechtzuerhalten3. Bei der Autophagie entsteht ein Doppelmembranvesikel: das Autophagosom. Das Autophagosom enthält die Frachtmoleküle und treibt sie zum Abbau in das Lysosom 1,4.
Autophagosomen werden durch das autophagische Protein Mikrotubuli-assoziiertes Protein Light Chain 3 (LC3)5 dekoriert. Wenn keine Autophagie induziert wird, diffundiert LC3 im Zytoplasma und Zellkern in der LC3-I-Konformation. Wenn andererseits Autophagie induziert wird, wird LC3 mit einem Phosphatidylethanolamin in der Membran der autophagischen Strukturenkonjugiert 6. Diese neue LC3-Konformation wird als LC3-II1 bezeichnet. Die Konformationsverschiebung von LC3 führt zu Veränderungen in der zellulären Lokalisation und der Migration der Dodecylnatriumsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE), die durch Techniken wie Immunfluoreszenz und Western Blot 5,7 nachgewiesen werden können. Auf diese Weise ist die LC3-Konjugation ein Schlüsselereignis im autophagischen Prozess, das zur Messung der autophagischen Aktivität verwendet werden kann.
Die Azinuszelle der Bauchspeicheldrüse ist eine hochdifferenzierte Zelle, die unter gesunden Bedingungen eine geringe Autophagierate aufweist. Unter verschiedenen physiologischen Bedingungen oder unter pharmakologischer Stimulation können sie jedoch die Autophagie aktivieren. Daher ist die Bestimmung der autophagischen Konzentrationen in dieser Zelllinie nützlich, um die möglichen direkten oder indirekten Auswirkungen verschiedener pharmakologischer oder biologischer Wirkstoffe auf die Autophagie zu untersuchen 8,9.
Das duktale Pankreas-Adenokarzinom ist aufgrund seiner späten Diagnose und seiner hohen Chemotherapieresistenz eine der tödlichsten Krebsarten10. Pankreaskarzinomzellen weisen aufgrund der transkriptionellen Hochregulation und posttranslationalen Aktivierung von Autophagie-verwandten Proteinen eine hohe Autophagieaktivität auf11. Bauchspeicheldrüsenkrebszellen können ihre Autophagie als Reaktion auf ungünstige Bedingungen wie Hypoxie, Nährstoffmangel oder Chemotherapie-induzierte Schäden anpassen11. Daher kann die Analyse des Autophagieniveaus in Bauchspeicheldrüsenkrebszellen helfen zu verstehen, wie sie sich an unterschiedliche Umgebungen anpassen, und die Wirksamkeit von autophagiemodulierenden Behandlungen bewerten.
Diese Studie zeigt eine Methode zur Durchführung von LC3-Immunfluoreszenz in zwei verschiedenen zellulären Modellen der Bauchspeicheldrüse. Das erste Modell, PANC-1-Zellen, diente als Modell für das duktale Adenokarzinom der Bauchspeicheldrüse. Diese Zellen wurden mit Gemcitabin behandelt, einem Chemotherapeutikum, von dem bereits gezeigt wurde, dass es Autophagie induziert, insbesondere in Bauchspeicheldrüsenkrebszellen, die das onkogene Kirsten-Rattensarkomvirus-Gen (KRAS) tragen12,13. Das zweite Modell, AR42J-Zellen, diente als physiologischeres Modell exokriner Pankreaszellen. Diese Zellen wurden mit Dexamethason differenziert, um den azinären Pankreaszellen ähnlicher zu werden14. In diesen Zellen wurde die Autophagie pharmakologisch durch die Verwendung von PP242 induziert, das ein potenter mTOR-Inhibitor ist15. In dieser Studie demonstrieren wir die Anwendbarkeit des beschriebenen Protokolls mit zwei verschiedenen Pankreasmodellen und seine Fähigkeit, zwischen Zuständen niedriger und hoher Autophagie zu unterscheiden.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10x Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>46-013-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 mm round coverslips</td>
			<td>HDA</td>
			<td>CBR_OBJ_6467</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 Well- Cell Culture Plate</td>
			<td>Sorfa</td>
			<td>220300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute ethanol</td>
			<td>Biopack</td>
			<td>2207.10.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 Donkey anti-rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R37119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Laser Scanning Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM 800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>62248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D4902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEN</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>01-052-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>NATOCOR&#160;</td>
			<td>Lintc-634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gemcitabina</td>
			<td>Eli Lilly</td>
			<td>VL7502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC3B (D11) XP Rabbit mAb</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>3868S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Anedra</td>
			<td>6197</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm &#34;M&#34; (Laboratory Sealing Film)</td>
			<td>Bemis/Curwood</td>
			<td>PM-996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Strep Solution</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>03-031-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PP242</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>SC-301606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11570626</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluating autophagy levels in two different pancreatic cell models using lc3 immunofluorescence

Autophagie ist ein spezialisierter kataboler Prozess, bei dem zytoplasmatische Komponenten, einschließlich Proteine und beschädigte Organellen, selektiv abgebaut werden. Autophagie ermöglicht es Zellen, physiologisch auf Stressreize zu reagieren und so die zelluläre Homöostase aufrechtzuerhalten. Krebszellen könnten ihre Autophagie modulieren, um sich an widrige Bedingungen wie Hypoxie, Nährstoffmangel oder Schäden durch Chemotherapie anzupassen. Das duktale Pankreas-Adenokarzinom ist eine der tödlichsten Krebsarten. Pankreaskarzinomzellen weisen aufgrund der transkriptionellen Hochregulation und posttranslationalen Aktivierung von Autophagieproteinen eine hohe Autophagieaktivität auf.
Hier wurde die PANC-1-Zelllinie als Modell für menschliche Krebszellen der Bauchspeicheldrüse und die AR42J-Pankreas-Azinuszelllinie als physiologisches Modell für hochdifferenzierte Säugetierzellen verwendet. In dieser Studie wurde die Immunfluoreszenz der Mikrotubuli-assoziierten Protein-Leichtkette 3 (LC3) als Indikator für den Status der Autophagie-Aktivierung verwendet. LC3 ist ein Autophagieprotein, das unter basalen Bedingungen ein diffuses Verteilungsmuster im Zytoplasma aufweist (in diesem Zustand als LC3-I bekannt). Die Autophagie-Induktion löst die Konjugation von LC3 mit Phosphatidylethanolamin auf der Oberfläche neu gebildeter Autophagosomen aus, um LC3-II zu bilden, ein membrangebundenes Protein, das die Bildung und Expansion von Autophagosomen unterstützt. Um die Anzahl der markierten autophagischen Strukturen zu quantifizieren, wurde die Open-Source-Software FIJI mit Hilfe des Tools "3D Objects Counter" eingesetzt.
Die Messung der autophagischen Konzentrationen sowohl unter physiologischen Bedingungen als auch in Krebszellen ermöglicht es uns, die Modulation der Autophagie unter verschiedenen Bedingungen wie Hypoxie, Chemotherapie oder dem Knockdown bestimmter Proteine zu untersuchen.

Dieses Protokoll führt die Immunfluoreszenz von LC3 in Pankreaszelllinien durch, um die Autophagieniveaus unter verschiedenen Bedingungen zu bestimmen. Das Ergebnis dieses Experiments war die Gewinnung zellulärer Bilder aus dem roten und blauen Kanal, die LC3 und DAPI entsprechen. Die LC3-Bilder zeigen die zelluläre Verteilung dieses Proteins, während die DAPI die Kernlokalisation zeigt. Abbildung 2A zeigt ein repräsentatives Bild der Immunfluoreszenz von LC3 und seiner Verschmelzung mi...

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Evaluating Autophagy Levels in Two Different Pancreatic Cell Models Using LC3 Immunofluorescence

Das Ziel dieses Protokolls ist es, die autophagischen Konzentrationen bei Bauchspeicheldrüsenkrebs und Pankreasazinuszellen durch LC3-Immunfluoreszenz und LC3-Punktquantifizierung zu bestimmen.

Evaluierung der Autophagie in zwei verschiedenen Pankreaszellmodellen mittels LC3-Immunfluoreszenz

Autophagy is a specialized catabolic process that selectively degrades cytoplasmic components, including proteins and damaged organelles. Autophagy allows ...

Die LC3-Immunfluoreszenz ermöglicht die Bestimmung des Autophagieniveaus in Pankreaszellen. Es ermöglicht die Untersuchung der möglichen Auswirkungen verschiedener Wirkstoffe auf die Autophagie von Bauchspeicheldrüsenzellen. Immunfluoreszenz ist eine Technik zum Nachweis von endogenem LC3-Protein, wodurch Probleme vermieden werden, die durch eine Überexpression von LC3 verursacht werden, wie z. B. die Bildung von Proteinaggregaten, die nichts mit Autophagie zu tun haben.Felipe Renna, Doktorand, und Malena Herrera López, Doktorandin aus dem Labor von Maria Ines Vaccaro, demonstrieren das Verfahren. Um mit der Zellvorbereitung zu beginnen, tränken Sie runde 12-Millimeter-Deckgläser in absolutem Ethanol. Legen Sie nach dem Entfernen des Deckels das getränkte Deckglas senkrecht in die 24-Well-Platte.Setzen Sie die Multi-Well-Platte 15 Minuten lang ultravioletter Strahlung aus. Positionieren Sie dann das Deckglas waagerecht und waschen Sie es mit DMEM. Sehen Sie sich nun die geringe Anzahl von Pankreaszellen an, die in DMEM resuspendiert wurden und 10 % FBS, Penicillin und Streptomycin enthalten, und inkubieren Sie die Zellen zwei Tage lang.Zwei Tage nach der Zellaussaat wird eine Gemcitabinlösung in DMEM mit einer Konzentration von einem Mikrogramm pro Mikroliter hergestellt. Saugen Sie dann die Hälfte des Volumens aus jeder Vertiefung in einem separaten Röhrchen ab und fügen Sie eine angemessene Menge Gemcitabinlösung hinzu. Geben Sie das halbe Volumen, das jeder Vertiefung entspricht, zurück in die behandelten Vertiefungen und inkubieren Sie die Zellen 24 Stunden lang.Zur Fixierung und Permeabilisierung der Zellen wird kaltes Methanol in eine 24-Well-Platte mit Zellen gegeben. Bereiten Sie auch eine Sechs-Well-Platte mit kaltem PBS vor. Nehmen Sie mit einer Spritzennadel und einer Pinzette jedes Deckglas und waschen Sie es zweimal in PBS.Anschließend sechs Minuten in Methanol inkubieren. Nach zweimaligem Waschen mit PBS inkubieren Sie die Deckgläser eine Stunde lang in einer Blockierlösung. Fügen Sie der Blockierlösung im Verhältnis eins zu 1000 ein Anti-LC3 hinzu und halten Sie es auf Eis.Legen Sie ein Stück Laborversiegelungsfolie über den Multi-Well-Deckel und geben Sie 25 Mikroliter Anti-LC3-Lösung pro Deckglas über die Versiegelungsfolie. Legen Sie mit einer Spritzennadel und einer Pinzette jedes Deckglas über den primären Antikörpertropfen und stellen Sie sicher, dass die Zellseite mit der Lösung in Kontakt kommt. Legen Sie die Multi-Well-Platte in die Feuchtigkeitskammer.Mit Folie abdecken und über Nacht im Kühlschrank inkubieren. Nehmen Sie am nächsten Tag die Multi-Well-Platte aus der Feuchtigkeitskammer. Legen Sie die Deckgläser wieder auf die Multi-Well-Platte und waschen Sie sie dreimal mit PBS.Verdünnen Sie fluoreszenzmarkiertes Anti-Kaninchen in einer Blockierlösung im Verhältnis eins zu 800 und bewahren Sie es im Dunkeln auf Eis auf. Geben Sie nach dem Verschließen des Multiwell-Deckels 25 Mikroliter Anti-Kaninchen-Lösung pro Deckglas über die Siegelfolie. Und behandeln Sie das Deckglas wie zuvor gezeigt mit einem Sekundärantikörper.Anschließend inkubieren Sie die Platte zwei Stunden lang in der Feuchtigkeitskammer bei Raumtemperatur und geschützt vor Licht. Waschen Sie am Ende der Inkubation mit Antikörpern die Deckgläser auf der Multiwell-Platte dreimal mit PBS. Inkubieren Sie jedes Deckglas mit der vorbereiteten DAPI-Lösung 10 Minuten lang.Bewahren Sie die Multiwell-Platte nach dem Waschen mit PBS im Dunkeln auf. Bereiten Sie für die Zellmontage zwei Becher mit Wasser und einem Blatt Papier vor. Geben Sie 10 Mikroliter PVA-DABCO-Lösung pro Deckglas auf einen Objektträger.Waschen Sie das Deckglas in Wasser und trocknen Sie es dann auf Papier. Zum Schluss legen Sie es über den PVA-DABCO-Tropfen. Und trocknen Sie über Nacht im Dunkeln.Schließen Sie dann das geöffnete Konsolenfenster. Wählen Sie auf der Registerkarte Bild die Option Farbe und dann Kanäle teilen aus. Schließen Sie das Bild, das den anderen Kanälen als dem LC3-Bild entspricht.Wählen Sie dann auf der Registerkarte "Bild" die Option "Anpassen" und dann "Farbbalance". Verschieben Sie den Schieberegler "Maximum" nach links, bis das Bild gesättigt ist, um die Zellenkonturen zu visualisieren. Verwenden Sie das Freihandauswahlwerkzeug, um den Zellenumriss zu zeichnen, und klicken Sie auf Zurücksetzen, um die Farben anzupassen.Um das ausgewählte Element auf der Registerkarte "Bearbeiten" auszuschneiden, wählen Sie "Ausschneiden" und schließen Sie das Bild, ohne es zu speichern. Wählen Sie auf der Registerkarte Bearbeiten die Option Einfügen aus. Wählen Sie im Menü "Analysieren" das Werkzeug "Zähler für 3D-Objekte" aus.Legen Sie den Schwellenwert auf 2000 und den Größenfilter auf 50 bis 500 fest. Stellen Sie sicher, dass die Objekte und Zusammenfassungsfelder markiert sind, und klicken Sie auf OK.In Protokollfenster, die Anzahl der Punkte wird als erkannte Objekte beschrieben. Die Immunfluoreszenz zeigte die zelluläre Verteilung des LC3-Proteins, während die DAPI eine nukleäre Lokalisation in Pankreaszellen zeigte.Die LC3-Punkte stiegen unter Gemcitabin-Behandlung signifikant an, was auf eine autophagische Aktivität hinweist. Bei einem übermäßigen Zusammenfluss neigen die exokrinen Pankreaszellen dazu, sich aufzutürmen und übereinander zu wachsen. Die Paraformaldehyd-Zellfixierungsmethode erwies sich als unwirksam für die Konservierung von LC3-Proteinen, da sie keine genaue Verteilung widerspiegelte.Wenn die Fixierung oder Behandlung durchgeführt wurde, ohne zwei Tage nach der Aussaat zu warten, hatten die PANC1-Zellen eine runde Form. Diese Morphologie verringerte die Beziehung zwischen dem Zytoplasma und dem Zellkern, was es schwierig machte, die intrazelluläre Verteilung von LC3 zu verstehen. Eine unvollständige Methanolfixierung könnte die korrekte LC3-Immunmarkierung beeinträchtigen, was zu unklaren Bildern und einer suboptimalen Quantifizierung führen könnte.Das Wichtigste, was bei diesem Verfahren zu beachten ist, ist, dass die Zellen sechs Minuten lang in kaltem Methanol anstelle von Paraformaldehyd fixiert werden müssen. Nach diesem Verfahren kann die Kolokalisation zwischen LC3 und anderen Proteinen analysiert werden, was die Untersuchung verschiedener molekularer Signalwege im Zusammenhang mit LC3-Funktionen ermöglicht.

Research

JoVE Journal

Biology

Monitoring Dynamic Changes In Mitochondrial Calcium Levels During Apoptosis Using A Genetically Encoded Calcium Sensor

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Forschung

Biologie

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