Name: evaluating autophagy levels in two different pancreatic cell models using lc3 immunofluorescence
Uploaded: 2023-04-28T13:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluating Autophagy Levels in Two Different Pancreatic Cell Models Using LC3 Immunofluorescence at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מאוניברסיטת בואנוס איירס (UBACyT 2018-2020, 20020170100082BA), המועצה הלאומית למחקר מדעי וטכנולוגיה (CONICET) (PIP 2021-2023 GI− 11220200101549CO; ו- PUE 22920170100033) והסוכנות הלאומית לקידום מדעי וטכנולוגי (PICT 2019-01664).

1. הכנת תאים
<ol><li>משרים כיסויים עגולים בקוטר 12 מ"מ באתנול מוחלט, ומניחים אותם במאונך בבארות של צלחת בת 24 בארות.</li>
	<li>הסר את הכיסוי, ולחשוף את צלחת רב באר לקרינה אולטרה סגולה במשך 15 דקות.</li>
	<li>מקמו את הכיסויים בצורה אופקית, וכבסו אותם עם מדיום הנשר המותאם (DMEM) של Dulbecco.</li>
	<li>זרע מספר מע...

<ol>
	<li>Grasso, D., Renna, F. J., Vaccaro, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initial+steps+in+mammalian+autophagosome+biogenesis.">Initial steps in mammalian autophagosome biogenesis.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 146 (2018).</li><li>Galluzzi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+definitions+of+autophagy+and+related+processes.">Molecular definitions of autophagy and related processes.</a> EMBO Journal. 36 (13), 1811-1836 (2017).</li><li>Kitada, M., Koya, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+in+metabolic+disease+and+ageing.">Autophagy in metabolic disease and ageing.</a> Nature Reviews Endocrinology. 17 (11), 647-661 (2021).</li><li>Ktistakis, N. T., Tooze, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digesting+the+expanding+mechanisms+of+autophagy.">Digesting the expanding mechanisms of autophagy.</a> Trends in Cell Biology. 26 (8), 624-635 (2016).</li><li>Tanida, I., Ueno, T., Kominami, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LC3+and+autophagy.">LC3 and autophagy.</a> Methods in Molecular Biology. 445, 77-88 (2008).</li><li>Kabeya, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LC3,+a+mammalian+homologue+of+yeast+Apg8p,+is+localized+in+autophagosome+membranes+after+processing.">LC3, a mammalian homologue of yeast Apg8p, is localized in autophagosome membranes after processing.</a> EMBO Journal. 19 (21), 5720-5728 (2000).</li><li>Mizushima, N., Yoshimori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+interpret+LC3+immunoblotting.">How to interpret LC3 immunoblotting.</a> Autophagy. 3 (6), 542-545 (2007).</li><li>Vanasco, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dynamics+and+VMP1-related+selective+mitophagy+in+experimental+acute+pancreatitis.">Mitochondrial dynamics and VMP1-related selective mitophagy in experimental acute pancreatitis.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 640094 (2021).</li><li>Williams, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+mechanisms+in+pancreas+and+salivary+acini.">Regulatory mechanisms in pancreas and salivary acini.</a> Annual Review of Physiology. 46, 361-375 (1984).</li><li>Mizrahi, J. D., Surana, R., Valle, J. W., Shroff, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+cancer.">Pancreatic cancer.</a> Lancet. 395 (10242), 2008-2020 (2020).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+and+function+of+autophagy+in+pancreatic+cancer.">Regulation and function of autophagy in pancreatic cancer.</a> Autophagy. 17 (11), 3275-3296 (2021).</li><li>Ropolo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+E2F1-EP300-VMP1+pathway+mediates+gemcitabine-induced+autophagy+in+pancreatic+cancer+cells+carrying+oncogenic+KRAS.">A novel E2F1-EP300-VMP1 pathway mediates gemcitabine-induced autophagy in pancreatic cancer cells carrying oncogenic KRAS.</a> Frontiers in Endocrinology. 11, 411 (2020).</li><li>Pardo, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gemcitabine+induces+the+VMP1-mediated+autophagy+pathway+to+promote+apoptotic+death+in+human+pancreatic+cancer+cells.">Gemcitabine induces the VMP1-mediated autophagy pathway to promote apoptotic death in human pancreatic cancer cells.</a> Pancreatology. 10 (1), 19-26 (2010).</li><li>Logsdon, C. D., Moessner, J., Williams, J. A., Goldfine, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucocorticoids+increase+amylase+mRNA+levels,+secretory+organelles,+and+secretion+in+pancreatic+acinar+AR42J+cells.">Glucocorticoids increase amylase mRNA levels, secretory organelles, and secretion in pancreatic acinar AR42J cells.</a> Journal of Cell Biology. 100 (4), 1200-1208 (1985).</li><li>Klionsky, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+assays+for+monitoring+autophagy+(4th+edition).">Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (4th edition).</a> Autophagy. 17 (1), 1 (2021).</li><li>Segeritz, C. -. P., Vallier, L., Jalali, M., Saldanha, F. Y. L., Jalali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+9+-+Cell+culture:+Growing+cells+as+model+systems+in+vitro.">Chapter 9 - Cell culture: Growing cells as model systems in vitro.</a> Basic Science Methods for Clinical Researchers. , 151-172 (2017).</li><li>Elliott, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+microscopy:+Principles+and+modern+practices.">Confocal microscopy: Principles and modern practices.</a> Current Protocols in Cytometry. 92 (1), 68 (2020).</li><li>Grasso, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+novel+selective+autophagy+pathway+mediated+by+VMP1-USP9x-p62,+prevents+pancreatic+cell+death.">a novel selective autophagy pathway mediated by VMP1-USP9x-p62, prevents pancreatic cell death.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (10), 8308-8324 (2011).</li><li>Ropolo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pancreatitis-induced+vacuole+membrane+protein+1+triggers+autophagy+in+mammalian+cells.">The pancreatitis-induced vacuole membrane protein 1 triggers autophagy in mammalian cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 282 (51), 37124-37133 (2007).</li><li>Karanasios, E., Stapleton, E., Walker, S. A., Manifava, M., Ktistakis, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+imaging+of+early+autophagy+events:+Omegasomes+and+beyond.">Live cell imaging of early autophagy events: Omegasomes and beyond.</a> Journal of Visualized Experiments. (77), e50484 (2013).</li><li>Kuma, A., Matsui, M., Mizushima, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LC3,+an+autophagosome+marker,+can+be+incorporated+into+protein+aggregates+independent+of+autophagy:+caution+in+the+interpretation+of+LC3+localization.">LC3, an autophagosome marker, can be incorporated into protein aggregates independent of autophagy: caution in the interpretation of LC3 localization.</a> Autophagy. 3 (4), 323-328 (2007).</li><li>Zhang, Z., Singh, R., Aschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+the+detection+of+autophagy+in+mammalian+cells.">Methods for the detection of autophagy in mammalian cells.</a> Current Protocols in Toxicology. 69, 1-26 (2016).</li><li>Yoshii, S. R., Mizushima, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+and+measuring+autophagy.">Monitoring and measuring autophagy.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (9), 1865 (2017).</li><li>Betriu, N., Andreeva, A., Semino, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erlotinib+promotes+ligand-induced+EGFR+degradation+in+3D+but+not+2D+cultures+of+pancreatic+ductal+adenocarcinoma+cells.">Erlotinib promotes ligand-induced EGFR degradation in 3D but not 2D cultures of pancreatic ductal adenocarcinoma cells.</a> Cancers. 13 (18), 4504 (2021).</li><li>Wang, W., Dong, L., Zhao, B., Lu, J., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E-cadherin+is+downregulated+by+microenvironmental+changes+in+pancreatic+cancer+and+induces+EMT.">E-cadherin is downregulated by microenvironmental changes in pancreatic cancer and induces EMT.</a> Oncology Reports. 40 (3), 1641-1649 (2018).</li><li>Kim, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+heterogeneity+and+plasticity+of+cancer+cell+migration+in+a+pancreatic+tumor+three-dimensional+culture+model.">Phenotypic heterogeneity and plasticity of cancer cell migration in a pancreatic tumor three-dimensional culture model.</a> Cancers. 12 (5), 1305 (2020).</li><li>Meng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+EpCAM+over-expression+is+associated+with+favorable+clinical+outcomes+in+pancreatic+cancer+patients+with+Hepatitis+B+virus+negative+infection.">Cytoplasmic EpCAM over-expression is associated with favorable clinical outcomes in pancreatic cancer patients with Hepatitis B virus negative infection.</a> International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 8 (12), 22204-22216 (2015).</li><li>Brock, R., Hamelers, I. H., Jovin, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+fixation+protocols+for+adherent+cultured+cells+applied+to+a+GFP+fusion+protein+of+the+epidermal+growth+factor+receptor.">Comparison of fixation protocols for adherent cultured cells applied to a GFP fusion protein of the epidermal growth factor receptor.</a> Cytometry. 35 (4), 353-362 (1999).</li></ol>

השיטה המתוארת בפרוטוקול זה מאפשרת להמחיש את התפלגות LC3 האנדוגנית בתא ולכמת את הרמות האוטופגיות בתנאים שונים. שיטה דומה נוספת המשמשת לניתוח התפלגות LC3 ולקביעת הפעלת אוטופגיה כוללת טרנספקציה LC3 עם תווית פלואורסצנטית (כגון RFP-LC3)19. RFP-LC3 transfection יש את היתרונות של לא צריך קיבוע (המאפש...

מקרואוטופגיה (המכונה בדרך כלל אוטופגיה) הוא תהליך קטבולי מיוחד המפרק באופן סלקטיבי רכיבים ציטופלזמיים, כולל חלבונים ואברונים פגומים 1,2. אוטופגיה מאפשרת לתאים להגיב פיזיולוגית לגירויי לחץ, ובכך לשמור על הומאוסטזיס תאי3. במהלך אוטופגיה נוצרת שלפוחית קרום כפולה: האוטופגוזום. האוטופגוזום מכיל את מולקולות המטען ומניע אותן לליזוזום לפירוק 1,4.
אוטופגוזומים מעוטרים על ידי שרשרת אור החלבון האוטופגית המשויכת למיקרוטובול 3 (LC3)5. כאשר אוטופגיה אינה מושרית, LC3 מפוזר בציטופלסמה ובגרעין בקונפורמציה LC3-I. מצד שני, כאשר אוטופגיה מושרית, LC3 מצומד עם phosphatidylethanolamine בקרום של מבנים אוטופגיים6. קונפורמציה LC3 חדשה זו ידועה בשם LC3-II1. שינוי הקונפורמציה LC3 גורם לשינויים בלוקליזציה התאית שלו ובנדידת האלקטרופורזה של ג'ל דודציל נתרן סולפט-פוליאקרילאמיד (SDS-PAGE), אשר ניתן לזהות באמצעות טכניקות כגון אימונופלואורסנציה וכתם מערבי 5,7. בדרך זו, צימוד LC3 הוא אירוע מפתח בתהליך האוטופגי שניתן להשתמש בו כדי למדוד פעילות אוטופגית.
תא acinar הלבלב הוא תא ממוין מאוד, אשר, בתנאים בריאים, יש שיעור נמוך של אוטופגיה. עם זאת, בתנאים פיזיולוגיים שונים או תחת גירוי תרופתי, הם יכולים להפעיל אוטופגיה. לכן, קביעת רמות אוטופגיות בקו תאים זה שימושית לחקר ההשפעות הישירות או העקיפות האפשריות של סוכנים פרמקולוגיים או ביולוגיים שונים על אוטופגיה 8,9.
אדנוקרצינומה של הלבלב היא אחד מסוגי הסרטן הקטלניים ביותר, בהתחשב באבחנה המאוחרת שלה ובעמידות הגבוהה שלהלכימותרפיה 10. לתאי סרטן הלבלב יש פעילות אוטופגיה גבוהה עקב הגברת השעתוק וההפעלה שלאחר התרגום של חלבונים הקשורים לאוטופגיה11. תאי סרטן הלבלב עשויים להתאים את רמות האוטופגיה שלהם בתגובה לתנאים שליליים כמו היפוקסיה, מחסור בחומרים מזינים או נזק הנגרם על ידי כימותרפיה11. לפיכך, ניתוח רמות האוטופגיה בתאי סרטן הלבלב יכול לעזור להבין כיצד הם מסתגלים לסביבות משתנות ולהעריך את היעילות של טיפולים המווסתים אוטופגיה.
מחקר זה מראה שיטה לביצוע LC3 immunofluorescence בשני מודלים שונים של תאי הלבלב. המודל הראשון, תאי PANC-1, שימש כמודל לאדנוקרצינומה של צינור הלבלב. תאים אלה טופלו בגמציטאבין, חומר כימותרפי שהוכח בעבר כגורם לאוטופגיה, במיוחד בתאי סרטן הלבלב הנושאים את הגן האונקוגני Kirsten rat sarcoma virus (KRAS)12,13. המודל השני, תאי AR42J, שימש כמודל פיזיולוגי יותר של תאי לבלב אקסוקריניים. תאים אלה התמינו עם dexamethasone כדי להיות דומים יותר לתאי לבלב acinar14. בתאים אלה, אוטופגיה הושרה פרמקולוגית באמצעות שימוש ב- PP242, שהוא מעכב mTORרב עוצמה 15. במחקר זה אנו מדגימים את תחולת הפרוטוקול המתואר בשני מודלים שונים של הלבלב ואת יכולתו להבחין בין מצבים של אוטופגיה נמוכה וגבוהה.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10x Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>46-013-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 mm round coverslips</td>
			<td>HDA</td>
			<td>CBR_OBJ_6467</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 Well- Cell Culture Plate</td>
			<td>Sorfa</td>
			<td>220300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute ethanol</td>
			<td>Biopack</td>
			<td>2207.10.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 Donkey anti-rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R37119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Laser Scanning Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM 800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>62248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D4902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEN</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>01-052-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>NATOCOR&#160;</td>
			<td>Lintc-634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gemcitabina</td>
			<td>Eli Lilly</td>
			<td>VL7502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC3B (D11) XP Rabbit mAb</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>3868S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Anedra</td>
			<td>6197</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm &#34;M&#34; (Laboratory Sealing Film)</td>
			<td>Bemis/Curwood</td>
			<td>PM-996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Strep Solution</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>03-031-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PP242</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>SC-301606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11570626</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluating autophagy levels in two different pancreatic cell models using lc3 immunofluorescence

אוטופגיה היא תהליך קטבולי מיוחד המפרק באופן סלקטיבי רכיבים ציטופלזמיים, כולל חלבונים ואברונים פגומים. אוטופגיה מאפשרת לתאים להגיב פיזיולוגית לגירויי לחץ, ובכך לשמור על הומאוסטזיס תאי. תאים סרטניים עשויים לווסת את רמות האוטופגיה שלהם כדי להסתגל לתנאים שליליים כגון היפוקסיה, מחסור בחומרים מזינים או נזק שנגרם על ידי כימותרפיה. אדנוקרצינומה של הלבלב היא אחד מסוגי הסרטן הקטלניים ביותר. לתאי סרטן הלבלב יש פעילות אוטופגיה גבוהה עקב הגברת השעתוק וההפעלה שלאחר התרגום של חלבוני אוטופגיה.
כאן, קו התאים PANC-1 שימש כמודל של תאי סרטן אנושיים בלבלב, וקו תאי הלבלב AR42J שימש כמודל פיזיולוגי של תאי יונקים ממוינים מאוד. מחקר זה השתמש באימונופלואורסנציה של שרשרת אור של חלבון הקשור למיקרוטובול 3 (LC3) כאינדיקטור למצב הפעלת אוטופגיה. LC3 הוא חלבון אוטופגיה אשר, בתנאי בסיס, מראה דפוס מפוזר של התפלגות בציטופלסמה (המכונה LC3-I במצב זה). השראת אוטופגיה מעוררת את הצמידות של LC3 לפוספטידיל-אתנולמין על פני השטח של אוטופגוזומים שזה עתה נוצרו ליצירת LC3-II, חלבון הקשור לקרום המסייע בהיווצרות ובהרחבה של אוטופגוזומים. כדי לכמת את מספר המבנים האוטופגיים המסומנים, נעשה שימוש בתוכנת הקוד הפתוח FIJI בעזרת הכלי "3D Objects Counter".
מדידת הרמות האוטופגיות הן בתנאים פיזיולוגיים והן בתאים סרטניים מאפשרת לנו לחקור את אפנון האוטופגיה בתנאים מגוונים כגון היפוקסיה, טיפול כימותרפי או הפלת חלבונים מסוימים.

פרוטוקול זה מבצע immunofluorescence של LC3 בשורות תאי הלבלב כדי לקבוע את רמות autophagy בתנאים שונים. התוצאה של ניסוי זה הייתה קבלת תמונות סלולריות מהערוצים האדומים והכחולים, המתאימים ל-LC3 ול-DAPI. תמונות LC3 מציינות את ההתפלגות התאית של חלבון זה, בעוד DAPI מראה את הלוקליזציה הגרעינית. איור 2A מר...

Watch this Scientific Journal Video about Evaluating Autophagy Levels in Two Different Pancreatic Cell Models Using LC3 Immunofluorescence at JoVE.com

Evaluating Autophagy Levels in Two Different Pancreatic Cell Models Using LC3 Immunofluorescence

מטרת פרוטוקול זה היא לקבוע רמות אוטופגיות בסרטן הלבלב ובתאי אסינר בלבלב באמצעות אימונופלואורסנציה LC3 וכימות נקודות LC3.

הערכת רמות אוטופגיה בשני מודלים שונים של תאי לבלב באמצעות LC3 immunofluorescence

Autophagy is a specialized catabolic process that selectively degrades cytoplasmic components, including proteins and damaged organelles. Autophagy allows ...

האימונופלואורסנציה LC3 מאפשרת קביעת רמות אוטופגיה בתאי הלבלב. זה מאפשר ללמוד את ההשפעות האפשריות של סוכנים שונים על אוטופגיה של תאי הלבלב. אימונופלואורסנציה היא טכניקה המשמשת לזיהוי חלבון LC3 אנדוגני, אשר מונע בעיות הנגרמות על ידי ביטוי יתר של LC3, כגון יצירת אגרגטים חלבוניים שאינם קשורים לאוטופגיה.מי שידגימו את ההליך יהיו פליפה רנה, בוגר דוקטורט, ומלנה הררה לופז, דוקטורנטית מהמעבדה של מריה אינס ואקארו. כדי להתחיל בהכנת התא, יש להשרות את החלקות הכיסוי העגולות בקוטר 12 מ"מ באתנול מוחלט. לאחר הסרת הכיסוי, מניחים את הכיסוי הספוג בצורה אנכית בצלחת בעלת 24 הבארות.חשוף את צלחת רב באר לקרינה אולטרה סגולה במשך 15 דקות. לאחר מכן מקם את הכיסוי להחליק אופקית ולשטוף אותו עם DMEM. כעת ראו את מספר המעבר הנמוך של תאי הלבלב, התלויים מחדש ב-DMEM, המכילים 10% FBS, פניצילין וסטרפטומיצין, ודגרו על התאים במשך יומיים.יומיים לאחר זריעת תאים, הכינו תמיסת גמציטאבין ב-DMEM בריכוז של מיקרוגרם אחד למיקרוליטר. לאחר מכן שואפים מחצית הנפח מכל באר בצינור נפרד, ומוסיפים כמות מתאימה של תמיסת גמציטאבין. מחזירים את חצי הנפח המתאים לכל באר בחזרה לבארות המטופלות, ודגרים על התאים למשך 24 שעות.לקיבוע וחדירה של התאים, מוסיפים מתנול קר לצלחת בת 24 בארות המכילה תאים. הכינו גם צלחת שש בארות עם PBS קר. בעזרת מחט מזרק ופינצטה, קחו כל מכסה ושטפו אותו פעמיים ב-PBS.ואז לדגור מתנול במשך שש דקות. לאחר שטיפה פעמיים עם PBS, יש לדגור על החלקות הכיסוי בתמיסת חסימה למשך שעה. הוסף אנטי LC3 בתמיסת החסימה ביחס של אחד עד 1000, ושמור על קרח.הניחו פיסת סרט איטום מעבדה מעל המכסה הרב-באר, והוסיפו 25 מיקרוליטר של תמיסת אנטי-LC3 לכל כיסוי מעל סרט האיטום. בעזרת מחט מזרק ופינצטה, הניחו כל כיסוי על טיפת הנוגדנים הראשונית, וודאו שצד התא נמצא במגע עם התמיסה. הכניסו את הצלחת מרובת הבארות לתא הלחות.מכסים אותו בנייר כסף ודוגרים לילה במקרר. למחרת, הסר את הצלחת מרובת הבארות מתא הלחות. הניחו את החלקות הכיסוי בחזרה על הצלחת מרובת הבארות ושטפו אותן עם PBS שלוש פעמים.לדלל נגד ארנב מסומן פלואורסצנטית בתמיסת חסימה ביחס של אחד עד 800, ולשמור על קרח בחושך. לאחר איטום המכסה הרב-באר, מוסיפים 25 מיקרוליטר של תמיסת אנטי-ארנב לכל כיסוי מחליק על סרט האיטום. ולטפל בתלוש הכיסוי עם נוגדן משני כפי שהודגם בעבר.לאחר מכן לדגור על הצלחת בתא הלחות במשך שעתיים בטמפרטורת החדר, מוגן מפני אור. בסוף הדגירה עם נוגדן, לשטוף את החלקות כיסוי על צלחת רב באר עם PBS שלוש פעמים. יש לדגור על כל מכסה עם תמיסת DAPI מוכנה למשך 10 דקות.לאחר השטיפה עם PBS, לשמור על צלחת רב באר בחושך. למונטאז' סלולרי, הכינו שתי כוסות עם מים ופיסת נייר. הוסף 10 מיקרוליטר של תמיסת PVA-DABCO לכל החלקת כיסוי על שקופית.לשטוף את הכיסוי להחליק במים, ולאחר מכן לייבש אותו על נייר. לבסוף, הניחו אותו מעל טיפת PVA-DABCO. ויבש לילה בחושך.למחרת, באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי הפוך, לדמיין את התאים המסומנים וללכוד את התמונות. לאחר לכידת תמונות, גרור ושחרר כל קובץ תמונה המכיל את הערוצים שצולמו במסך פיג'י. בתיבת הדו-שיח, לחץ על אישור כדי לפתוח את התמונה.לאחר מכן סגור את חלון הקונסולה שנפתח. בכרטיסיה תמונה, בחר צבע ולאחר מכן פצל ערוצים. סגור את התמונה המתאימה לערוצים שאינם תמונת LC3.לאחר מכן, בכרטיסיה תמונה, בחר התאמה, ולאחר מכן איזון צבע. הזיזו את המחוון המרבי שמאלה עד לרוויית התמונה כדי להציג באופן חזותי את קווי המתאר של התא. השתמש בכלי הבחירה החופשית כדי לצייר את קו המתאר של התא, ולחץ על איפוס כדי להתאים את הצבעים.כדי לגזור את הפריט שנבחר מהכרטיסיה עריכה, בחר גזור וסגור את התמונה מבלי לשמור אותה. ומהכרטיסייה עריכה, בחר הדבק. בתפריט 'נתח', בחרו בכלי 3D Objects Counter.הגדר את הסף ל- 2000 ואת מסנן הגודל ל- 50 עד 500. ודא שהאובייקטים ותיבות הסיכום מסומנים, ולחץ על OK.In חלון היומן, מספר הנקודות יתואר כאובייקטים שזוהו. האימונופלואורסנציה הצביעה על התפלגות התא של חלבון LC3, בעוד שה- DAPI הראה לוקליזציה גרעינית בתאי הלבלב.נקודות LC3 גדלו באופן משמעותי תחת טיפול בגמציטאבין, מה שמצביע על פעילות אוטופגית. תחת מפגש מוגזם, תאי הלבלב האקסוקריניים נוטים להיערם ולגדול זה על גבי זה. שיטת קיבוע תאי הפרפורמלדהיד לא הייתה יעילה לשימור חלבוני LC3, מכיוון שלא שיקפה פיזור מדויק.כאשר הקיבוע או הטיפול בוצעו ללא המתנה יומיים לאחר הזריעה, תאי PANC1 היו בעלי צורה עגולה. מורפולוגיה זו הפחיתה את הקשר בין הציטופלסמה לגרעין, והקשתה על הבנת ההתפלגות התוך-תאית של LC3. קיבוע מתנול לא שלם עלול להפריע לתיוג חיסוני תקין של LC3, מה שמוביל לתמונות לא ברורות ולכימות תת-אופטימלי.הדבר החשוב ביותר לזכור במהלך הליך זה הוא כי התאים חייבים להיות קבועים מתנול קר במשך שש דקות, במקום paraformaldehyde. בעקבות הליך זה, ניתן לנתח לוקליזציה בין LC3 וחלבונים אחרים, המאפשרת לימוד מסלולים מולקולריים שונים הקשורים לפונקציות LC3.

Research

JoVE Journal

Biology

Monitoring Dynamic Changes In Mitochondrial Calcium Levels During Apoptosis Using A Genetically Encoded Calcium Sensor

ניטור שינויים דינמיים רמות הסידן מיטוכונדריאלי במהלך אפופטוזיס באמצעות חיישן סידן מקודד גנטית

Dynamic changes in intracellular calcium concentration in response to various stimuli regulates many cellular processes such as proliferation, ...

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the I&middot;Cryo Kit

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the IÃƒâ€šÃ‚Â·Cryo Kit

הזרע עכבר cryopreservation ושחזור באמצעות · אני cryo Kit

Thousands of new genetically modified (GM) strains of mice have been created since the advent of transgenesis and knockout technologies.  Many of these ...

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

מדידה של רמות הרן סינתזה בתאי יונקים

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

Quantitative Immunofluorescence Assay to Measure the Variation in Protein Levels at Centrosomes

כמותי Immunofluorescence Assay למדוד הווריאציה ברמות חלבון בCentrosomes

Centrosomes are small but important organelles that serve as the poles of mitotic spindle to maintain genomic integrity or assemble primary cilia to ...

Comparison of Three Different Methods for Determining Cell Proliferation in Breast Cancer Cell Lines

השוואה של שלוש שיטות שונות לקביעת שגשוג תאים בשורות תאי סרטן השד

Measuring cell proliferation can be performed by a number of different methods, each with varying levels of sensitivity, reproducibility and compatibility ...

Activating Autophagy by Aerobic Exercise in Mice

הפעלת Autophagy ידי פעילות גופנית אירובית בעכברים

Autophagy is a lysosomal degradation pathway essential for cell homeostasis, function and differentiation. Under stress conditions, autophagy is induced ...

Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing

אנליזה microbiota באמצעות שני שלבים PCR ו-הדור הבא של 16 rRNA גן רצף

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the ...

Functional Assessment of Kinesin-7 CENP-E in Spermatocytes Using In Vivo Inhibition, Immunofluorescence and Flow Cytometry

Functional Assessment of Kinesin-7 CENP-E in Spermatocytes Using In Vivo Inhibition, Immunofluorescence and Flow Cytometry

הערכה תפקודית של קינזין-7 CENP-E בזרעונים באמצעות עיכוב Vivo , אימונופלואורסנציה וציטומטריית זרימה

In eukaryotes, meiosis is essential for genome stability and genetic diversity in sexual reproduction. Experimental analyses of spermatocytes in testes ...

Analyzing Starvation-Induced Autophagy in the Drosophila melanogaster Larval Fat Body

Analyzing Starvation-Induced Autophagy in the Drosophila melanogaster Larval Fat Body

ניתוח אוטופגיה הנגרמת על ידי רעב בגוף השומן של הזחל Drosophila melanogaster

Autophagy is a cellular self-digestion process. It delivers cargo to the lysosomes for degradation in response to various stresses, including starvation. ...

Ultrastructural Localization of Endogenous LC3 by On-Section Correlative Light-Electron Microscopy

לוקליזציה אולטרה-מבנית של LC3 אנדוגני על ידי מיקרוסקופ אור-אלקטרונים קורלטיבי בחתך

The visualization of autophagic organelles at the ultrastructural level by electron microscopy (EM) is essential to establish their identity and reveal ...