Name: evaluating autophagy levels in two different pancreatic cell models using lc3 immunofluorescence
Uploaded: 2023-04-28T13:40:00
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इस काम को ब्यूनस आयर्स विश्वविद्यालय (यूबीएसीवाईटी 2018-2020 20020170100082बीए), राष्ट्रीय वैज्ञानिक अनुसंधान और प्रौद्योगिकी परिषद (सीओएनआईसीईटी) (पीआईपी 2021-2023 जीआई − 11220200101549सीओ; और पीयूई 22920170100033) और राष्ट्रीय वैज्ञानिक और तकनीकी संवर्धन एजेंसी (पीआईसीटी 2019-0166) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।

1. सेल की तैयारी
<ol><li>पूर्ण इथेनॉल में 12 मिमी गोल कवरलिप्स भिगोएं, और उन्हें 24-वेल प्लेट के कुओं में लंबवत रखें।</li>
	<li>कवर को हटा दें, और मल्टी-वेल प्लेट को 15 मिनट के लिए पराबैंगनी विकिरण के संपर्क में ला?...

<ol>
	<li>Grasso, D., Renna, F. J., Vaccaro, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initial+steps+in+mammalian+autophagosome+biogenesis.">Initial steps in mammalian autophagosome biogenesis.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 146 (2018).</li><li>Galluzzi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+definitions+of+autophagy+and+related+processes.">Molecular definitions of autophagy and related processes.</a> EMBO Journal. 36 (13), 1811-1836 (2017).</li><li>Kitada, M., Koya, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+in+metabolic+disease+and+ageing.">Autophagy in metabolic disease and ageing.</a> Nature Reviews Endocrinology. 17 (11), 647-661 (2021).</li><li>Ktistakis, N. T., Tooze, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digesting+the+expanding+mechanisms+of+autophagy.">Digesting the expanding mechanisms of autophagy.</a> Trends in Cell Biology. 26 (8), 624-635 (2016).</li><li>Tanida, I., Ueno, T., Kominami, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LC3+and+autophagy.">LC3 and autophagy.</a> Methods in Molecular Biology. 445, 77-88 (2008).</li><li>Kabeya, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LC3,+a+mammalian+homologue+of+yeast+Apg8p,+is+localized+in+autophagosome+membranes+after+processing.">LC3, a mammalian homologue of yeast Apg8p, is localized in autophagosome membranes after processing.</a> EMBO Journal. 19 (21), 5720-5728 (2000).</li><li>Mizushima, N., Yoshimori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+interpret+LC3+immunoblotting.">How to interpret LC3 immunoblotting.</a> Autophagy. 3 (6), 542-545 (2007).</li><li>Vanasco, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dynamics+and+VMP1-related+selective+mitophagy+in+experimental+acute+pancreatitis.">Mitochondrial dynamics and VMP1-related selective mitophagy in experimental acute pancreatitis.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 640094 (2021).</li><li>Williams, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+mechanisms+in+pancreas+and+salivary+acini.">Regulatory mechanisms in pancreas and salivary acini.</a> Annual Review of Physiology. 46, 361-375 (1984).</li><li>Mizrahi, J. D., Surana, R., Valle, J. W., Shroff, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+cancer.">Pancreatic cancer.</a> Lancet. 395 (10242), 2008-2020 (2020).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+and+function+of+autophagy+in+pancreatic+cancer.">Regulation and function of autophagy in pancreatic cancer.</a> Autophagy. 17 (11), 3275-3296 (2021).</li><li>Ropolo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+E2F1-EP300-VMP1+pathway+mediates+gemcitabine-induced+autophagy+in+pancreatic+cancer+cells+carrying+oncogenic+KRAS.">A novel E2F1-EP300-VMP1 pathway mediates gemcitabine-induced autophagy in pancreatic cancer cells carrying oncogenic KRAS.</a> Frontiers in Endocrinology. 11, 411 (2020).</li><li>Pardo, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gemcitabine+induces+the+VMP1-mediated+autophagy+pathway+to+promote+apoptotic+death+in+human+pancreatic+cancer+cells.">Gemcitabine induces the VMP1-mediated autophagy pathway to promote apoptotic death in human pancreatic cancer cells.</a> Pancreatology. 10 (1), 19-26 (2010).</li><li>Logsdon, C. D., Moessner, J., Williams, J. A., Goldfine, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucocorticoids+increase+amylase+mRNA+levels,+secretory+organelles,+and+secretion+in+pancreatic+acinar+AR42J+cells.">Glucocorticoids increase amylase mRNA levels, secretory organelles, and secretion in pancreatic acinar AR42J cells.</a> Journal of Cell Biology. 100 (4), 1200-1208 (1985).</li><li>Klionsky, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+assays+for+monitoring+autophagy+(4th+edition).">Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (4th edition).</a> Autophagy. 17 (1), 1 (2021).</li><li>Segeritz, C. -. P., Vallier, L., Jalali, M., Saldanha, F. Y. L., Jalali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+9+-+Cell+culture:+Growing+cells+as+model+systems+in+vitro.">Chapter 9 - Cell culture: Growing cells as model systems in vitro.</a> Basic Science Methods for Clinical Researchers. , 151-172 (2017).</li><li>Elliott, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+microscopy:+Principles+and+modern+practices.">Confocal microscopy: Principles and modern practices.</a> Current Protocols in Cytometry. 92 (1), 68 (2020).</li><li>Grasso, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+novel+selective+autophagy+pathway+mediated+by+VMP1-USP9x-p62,+prevents+pancreatic+cell+death.">a novel selective autophagy pathway mediated by VMP1-USP9x-p62, prevents pancreatic cell death.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (10), 8308-8324 (2011).</li><li>Ropolo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pancreatitis-induced+vacuole+membrane+protein+1+triggers+autophagy+in+mammalian+cells.">The pancreatitis-induced vacuole membrane protein 1 triggers autophagy in mammalian cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 282 (51), 37124-37133 (2007).</li><li>Karanasios, E., Stapleton, E., Walker, S. A., Manifava, M., Ktistakis, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+imaging+of+early+autophagy+events:+Omegasomes+and+beyond.">Live cell imaging of early autophagy events: Omegasomes and beyond.</a> Journal of Visualized Experiments. (77), e50484 (2013).</li><li>Kuma, A., Matsui, M., Mizushima, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LC3,+an+autophagosome+marker,+can+be+incorporated+into+protein+aggregates+independent+of+autophagy:+caution+in+the+interpretation+of+LC3+localization.">LC3, an autophagosome marker, can be incorporated into protein aggregates independent of autophagy: caution in the interpretation of LC3 localization.</a> Autophagy. 3 (4), 323-328 (2007).</li><li>Zhang, Z., Singh, R., Aschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+the+detection+of+autophagy+in+mammalian+cells.">Methods for the detection of autophagy in mammalian cells.</a> Current Protocols in Toxicology. 69, 1-26 (2016).</li><li>Yoshii, S. R., Mizushima, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+and+measuring+autophagy.">Monitoring and measuring autophagy.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (9), 1865 (2017).</li><li>Betriu, N., Andreeva, A., Semino, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erlotinib+promotes+ligand-induced+EGFR+degradation+in+3D+but+not+2D+cultures+of+pancreatic+ductal+adenocarcinoma+cells.">Erlotinib promotes ligand-induced EGFR degradation in 3D but not 2D cultures of pancreatic ductal adenocarcinoma cells.</a> Cancers. 13 (18), 4504 (2021).</li><li>Wang, W., Dong, L., Zhao, B., Lu, J., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E-cadherin+is+downregulated+by+microenvironmental+changes+in+pancreatic+cancer+and+induces+EMT.">E-cadherin is downregulated by microenvironmental changes in pancreatic cancer and induces EMT.</a> Oncology Reports. 40 (3), 1641-1649 (2018).</li><li>Kim, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+heterogeneity+and+plasticity+of+cancer+cell+migration+in+a+pancreatic+tumor+three-dimensional+culture+model.">Phenotypic heterogeneity and plasticity of cancer cell migration in a pancreatic tumor three-dimensional culture model.</a> Cancers. 12 (5), 1305 (2020).</li><li>Meng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+EpCAM+over-expression+is+associated+with+favorable+clinical+outcomes+in+pancreatic+cancer+patients+with+Hepatitis+B+virus+negative+infection.">Cytoplasmic EpCAM over-expression is associated with favorable clinical outcomes in pancreatic cancer patients with Hepatitis B virus negative infection.</a> International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 8 (12), 22204-22216 (2015).</li><li>Brock, R., Hamelers, I. H., Jovin, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+fixation+protocols+for+adherent+cultured+cells+applied+to+a+GFP+fusion+protein+of+the+epidermal+growth+factor+receptor.">Comparison of fixation protocols for adherent cultured cells applied to a GFP fusion protein of the epidermal growth factor receptor.</a> Cytometry. 35 (4), 353-362 (1999).</li></ol>

इस प्रोटोकॉल में वर्णित विधि सेल में अंतर्जात एलसी 3 वितरण की कल्पना करने और विभिन्न परिस्थितियों में ऑटोफैजिक स्तरों को निर्धारित करने की अनुमति देती है। एलसी 3 वितरण का विश्लेषण करने और ऑटोफैगी सक्र...

मैक्रोऑटोफैगी (आमतौर पर ऑटोफैगी के रूप में संदर्भित) एक विशेष अपचय प्रक्रिया है जो प्रोटीन और क्षतिग्रस्त ऑर्गेनेल 1,2 सहित साइटोप्लाज्मिक घटकों को चुनिंदा रूप से नीचा दिखाती है। ऑटोफैगी कोशिकाओं को शारीरिक रूप से तनाव उत्तेजनाओं का जवाब देने की अनुमति देता है और इस प्रकार, सेलुलर होमियोस्टैसिस3 को बनाए रखता है। ऑटोफैगी के दौरान, एक डबल झिल्ली पुटिका बनती है: ऑटोफैगोसोम। ऑटोफैगोसोम में कार्गो अणु होते हैं और उन्हें गिरावट के लिए लाइसोसोम में ले जाता है 1,4.
ऑटोफैगोसोम को ऑटोफैजिक प्रोटीन सूक्ष्मनलिका से जुड़े प्रोटीन लाइट चेन 3 (एलसी 3)5 द्वारा सजाया जाता है। जब ऑटोफैगी प्रेरित नहीं होती है, तो एलसी 3 को एलसी 3-आई रचना में साइटोप्लाज्म और नाभिक में फैलाया जाता है। दूसरी ओर, जब ऑटोफैगी को प्रेरित किया जाता है, तो एलसी 3 को ऑटोफैजिक संरचनाओंकी झिल्ली में फॉस्फेटिडिलएथेनॉलमाइन के साथ संयुग्मित किया जाता है। इस नए एलसी 3 रचना को एलसी 3-II1 के रूप में जाना जाता है। एलसी 3 अनुरूपण बदलाव इसके सेलुलर स्थानीयकरण और इसके डोडेसिल सोडियम सल्फेट-पॉलीक्रिलामाइड जेल वैद्युतकणसंचलन (एसडीएस-पेज) माइग्रेशन में परिवर्तन का कारण बनता है, जिसे इम्यूनोफ्लोरेसेंस और वेस्टर्न ब्लॉट 5,7 जैसी तकनीकों द्वारा पता लगाया जा सकता है। इस तरह, एलसी 3 संयुग्मन ऑटोफैजिक प्रक्रिया में एक महत्वपूर्ण घटना है जिसका उपयोग ऑटोफैजिक गतिविधि को मापने के लिए किया जा सकता है।
अग्नाशयी एसिनार सेल एक अत्यधिक विभेदित कोशिका है, जो स्वस्थ परिस्थितियों में, ऑटोफैगी की कम दर है। हालांकि, विभिन्न शारीरिक स्थितियों में या औषधीय उत्तेजना के तहत, वे ऑटोफैगी को सक्रिय कर सकते हैं। इसलिए, इस सेल लाइन में ऑटोफैजिक स्तरों का निर्धारण ऑटोफैगी 8,9 पर विभिन्न औषधीय या जैविक एजेंटों के संभावित प्रत्यक्ष या अप्रत्यक्ष प्रभावों का अध्ययन करने के लिए उपयोगी है।
डक्टल अग्नाशयी एडेनोकार्सिनोमा कैंसर के सबसे घातक प्रकारों में से एक है, इसके देर से निदान और इसके उच्च कीमोथेरेपी प्रतिरोध10 को देखते हुए। ट्रांसक्रिप्शनल अपरेग्यूलेशन और ऑटोफैगी सेसंबंधित प्रोटीन के पोस्ट-ट्रांसलेशनल सक्रियण के कारण अग्नाशय ी कैंसर कोशिकाओं में उच्च ऑटोफैगी गतिविधि होती है। अग्नाशय ी कैंसर कोशिकाएं हाइपोक्सिया, पोषक तत्वों की कमी, या कीमोथेरेपी-प्रेरितक्षति जैसी प्रतिकूल परिस्थितियों के जवाब में अपने ऑटोफैगी के स्तर को समायोजित कर सकती हैं। इसलिए, अग्नाशय ी कैंसर कोशिकाओं में ऑटोफैगी के स्तर का विश्लेषण करने से यह समझने में मदद मिल सकती है कि वे अलग-अलग वातावरण के अनुकूल कैसे होते हैं और ऑटोफैगी-मॉड्यूलेटिंग उपचार की प्रभावशीलता का मूल्यांकन करते हैं।
यह अध्ययन दो अलग-अलग अग्नाशय ी सेलुलर मॉडल में एलसी 3 इम्यूनोफ्लोरेसेंस करने की एक विधि दिखाता है। पहला मॉडल, पैनसी -1 कोशिकाएं, अग्नाशयी डक्टल एडेनोकार्सिनोमा के लिए एक मॉडल के रूप में कार्य करती हैं। इन कोशिकाओं का इलाज जेमसिटाबाइन के साथ किया गया था, एक कीमोथेरेपी एजेंट जिसे पहले ऑटोफैगी को प्रेरित करने के लिए दिखाया गया था, विशेष रूप से अग्नाशय ी कैंसर कोशिकाओं में ऑन्कोजेनिक कर्स्टन रैट सारकोमा वायरस जीन (केआरएएस) 12,13। दूसरा मॉडल, एआर 42 जे कोशिकाएं, एक्सोक्राइन अग्नाशय ी कोशिकाओं के अधिक शारीरिक मॉडल के रूप में कार्य करती हैं। इन कोशिकाओं को डेक्सामेथासोन के साथ विभेदित किया गया था ताकि वे एसिनार अग्नाशयी कोशिकाओं 14 के समान हो सकें। इन कोशिकाओं में, ऑटोफैगी को पीपी 242 के उपयोग के माध्यम से औषधीय रूप से प्रेरित किया गया था, जो एक शक्तिशाली एमटीओआर अवरोधक15 है। इस अध्ययन में, हम दो अलग-अलग अग्नाशय ी मॉडल के साथ वर्णित प्रोटोकॉल की प्रयोज्यता और कम और उच्च ऑटोफैगी के राज्यों के बीच भेदभाव करने की इसकी क्षमता का प्रदर्शन करते हैं।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10x Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>46-013-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 mm round coverslips</td>
			<td>HDA</td>
			<td>CBR_OBJ_6467</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 Well- Cell Culture Plate</td>
			<td>Sorfa</td>
			<td>220300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute ethanol</td>
			<td>Biopack</td>
			<td>2207.10.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 Donkey anti-rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R37119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Laser Scanning Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM 800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>62248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D4902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEN</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>01-052-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>NATOCOR&#160;</td>
			<td>Lintc-634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gemcitabina</td>
			<td>Eli Lilly</td>
			<td>VL7502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC3B (D11) XP Rabbit mAb</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>3868S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Anedra</td>
			<td>6197</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm &#34;M&#34; (Laboratory Sealing Film)</td>
			<td>Bemis/Curwood</td>
			<td>PM-996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Strep Solution</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>03-031-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PP242</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>SC-301606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11570626</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluating autophagy levels in two different pancreatic cell models using lc3 immunofluorescence

ऑटोफैगी एक विशेष अपचय प्रक्रिया है जो प्रोटीन और क्षतिग्रस्त ऑर्गेनेल सहित साइटोप्लाज्मिक घटकों को चुनिंदा रूप से नीचा दिखाती है। ऑटोफैगी कोशिकाओं को शारीरिक रूप से तनाव उत्तेजनाओं का जवाब देने की अनुमति देता है और इस प्रकार, सेलुलर होमियोस्टैसिस को बनाए रखता है। कैंसर कोशिकाएं हाइपोक्सिया, पोषक तत्वों की कमी या कीमोथेरेपी के कारण होने वाली क्षति जैसी प्रतिकूल परिस्थितियों के अनुकूल होने के लिए अपने ऑटोफैगी के स्तर को संशोधित कर सकती हैं। डक्टल अग्नाशयी एडेनोकार्सिनोमा कैंसर के सबसे घातक प्रकारों में से एक है। ट्रांसक्रिप्शनल अपरेग्यूलेशन और ऑटोफैगी प्रोटीन के पोस्ट-ट्रांसलेशनल सक्रियण के कारण अग्नाशय ी कैंसर कोशिकाओं में उच्च ऑटोफैगी गतिविधि होती है।
यहां, पैनसी -1 सेल लाइन का उपयोग अग्नाशय ी मानव कैंसर कोशिकाओं के मॉडल के रूप में किया गया था, और एआर 42 जे अग्नाशयी एसीनार सेल लाइन का उपयोग अत्यधिक विभेदित स्तनधारी कोशिकाओं के शारीरिक मॉडल के रूप में किया गया था। इस अध्ययन ने ऑटोफैगी सक्रियण की स्थिति के संकेतक के रूप में सूक्ष्मनलिका से जुड़े प्रोटीन लाइट चेन 3 (एलसी 3) के इम्यूनोफ्लोरेसेंस का उपयोग किया। एलसी 3 एक ऑटोफैगी प्रोटीन है, जो बेसल स्थितियों में, साइटोप्लाज्म में वितरण का एक फैलाव पैटर्न दिखाता है (इस स्थिति में एलसी 3-आई के रूप में जाना जाता है)। ऑटोफैगी प्रेरण एलसी 3-2 बनाने के लिए नवगठित ऑटोफैगोसोम की सतह पर एलसी 3 से फॉस्फेटिडिलएथेनॉलमाइन के संयुग्मन को ट्रिगर करता है, एक झिल्ली-बाध्य प्रोटीन जो ऑटोफैगोसोम के गठन और विस्तार में सहायता करता है। लेबल ऑटोफैजिक संरचनाओं की संख्या निर्धारित करने के लिए, ओपन-सोर्स सॉफ्टवेयर फिजी का उपयोग "3 डी ऑब्जेक्ट्स काउंटर" टूल की सहायता से किया गया था।
शारीरिक स्थितियों और कैंसर कोशिकाओं दोनों में ऑटोफैजिक स्तरों का माप हमें हाइपोक्सिया, कीमोथेरेपी उपचार, या कुछ प्रोटीनों के वध जैसी विविध स्थितियों के तहत ऑटोफैगी के मॉड्यूलेशन का अध्ययन करने की अनुमति देता है।

यह प्रोटोकॉल विभिन्न स्थितियों में ऑटोफैगी के स्तर को निर्धारित करने के लिए अग्नाशयी सेल लाइनों में एलसी 3 के इम्यूनोफ्लोरेसेंस करता है। इस प्रयोग का परिणाम एलसी 3 और डीएपीआई के अनुरूप लाल और नीले चैन?...

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Evaluating Autophagy Levels in Two Different Pancreatic Cell Models Using LC3 Immunofluorescence

इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य एलसी 3 इम्यूनोफ्लोरेसेंस और एलसी 3 डॉट परिमाणीकरण के माध्यम से अग्नाशय ी कैंसर और अग्नाशयी एसिनार कोशिकाओं में ऑटोफैजिक स्तर निर्धारित करना है।

एलसी 3 इम्यूनोफ्लोरेसेंस का उपयोग करके दो अलग-अलग अग्नाशयी सेल मॉडल में ऑटोफैगी के स्तर का मूल्यांकन करना

Autophagy is a specialized catabolic process that selectively degrades cytoplasmic components, including proteins and damaged organelles. Autophagy allows ...

एलसी 3 इम्यूनोफ्लोरेसेंस अग्नाशय ी कोशिकाओं में ऑटोफैगी के स्तर के निर्धारण को सक्षम बनाता है। यह अग्नाशय ी कोशिका ऑटोफैगी पर विभिन्न एजेंटों के संभावित प्रभावों के अध्ययन की अनुमति देता है। इम्यूनोफ्लोरेसेंस एक ऐसी तकनीक है जिसका उपयोग अंतर्जात एलसी 3 प्रोटीन का पता लगाने के लिए किया जाता है, जो एलसी 3 को अधिक व्यक्त करने के कारण होने वाली समस्याओं से बचता है, जैसे कि ऑटोफैगी से असंबंधित प्रोटीन समुच्चय बनाना।प्रक्रिया का प्रदर्शन पीएचडी स्नातक फेलिप रेना और मारिया इनेस वैकारो की प्रयोगशाला से पीएचडी छात्र मालेना हेरेरा लोपेज़ करेंगे। सेल की तैयारी शुरू करने के लिए, पूर्ण इथेनॉल में 12-मिलीमीटर गोल कवर स्लिप भिगोएं। कवर हटाने के बाद, भिगोए हुए कवर स्लिप को 24-वेल प्लेट में लंबवत रखें।मल्टी-वेल प्लेट को 15 मिनट के लिए पराबैंगनी विकिरण के संपर्क में लाएं। फिर कवर स्लिप को क्षैतिज रूप से रखें और इसे डीएमईएम से धो लें। अब डीएमईएम में फिर से निलंबित अग्नाशयी कोशिकाओं की कम मार्ग संख्या देखें, जिसमें 10% एफबीएस, पेनिसिलिन और स्ट्रेप्टोमाइसिन होते हैं, और दो दिनों के लिए कोशिकाओं को इनक्यूबेट करते हैं।सेल सीडिंग के दो दिन बाद, डीएमईएम में एक माइक्रोग्राम प्रति माइक्रोलीटर सांद्रता पर जेमसिटाबाईन घोल तैयार करें। फिर एक अलग ट्यूब में प्रत्येक कुएं से आधी मात्रा को एस्पिरेट करें, और उचित मात्रा में जेमसिटाबाईन घोल जोड़ें। प्रत्येक कुएं के अनुरूप आधी मात्रा को उपचारित कुओं में वापस करें, और 24 घंटे के लिए कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।कोशिकाओं को ठीक करने और स्थिर करने के लिए, कोशिकाओं वाले 24-वेल प्लेट में ठंडा मेथनॉल जोड़ें। इसके अलावा ठंडे पीबीएस के साथ एक छह-अच्छी प्लेट तैयार करें। एक सिरिंज सुई और चिमटी का उपयोग करके, प्रत्येक कवर पर्ची लें और इसे पीबीएस में दो बार धोएं।फिर छह मिनट के लिए मेथनॉल में इनक्यूबेट करें। पीबीएस के साथ दो बार धोने के बाद, कवर स्लिप को एक घंटे के लिए ब्लॉकिंग समाधान में इनक्यूबेट करें। एक से 1000 के अनुपात में ब्लॉकिंग समाधान में एक एंटी एलसी 3 जोड़ें, और बर्फ पर बनाए रखें।मल्टी-वेल ढक्कन पर प्रयोगशाला सीलिंग फिल्म का एक टुकड़ा रखें, और सीलिंग फिल्म के ऊपर प्रति कवर स्लिप में 25 माइक्रोलीटर एंटी-एलसी 3 समाधान जोड़ें। एक सिरिंज सुई और चिमटी का उपयोग करके, प्रत्येक कवर स्लिप को प्राथमिक एंटीबॉडी ड्रॉप पर रखें, यह सुनिश्चित करते हुए कि सेल साइड समाधान के संपर्क में है। मल्टी-वेल प्लेट को आर्द्रता कक्ष में रखें।इसे पन्नी के साथ कवर करें और फ्रिज में रात भर इनक्यूबेट करें। अगले दिन, आर्द्रता कक्ष से मल्टी-वेल प्लेट को हटा दें। कवर स्लिप को मल्टी-वेल प्लेट पर वापस रखें और उन्हें पीबीएस से तीन बार धो लें।फ्लोरोसेंटली-लेबल एंटी-खरगोश को एक से 800 के अनुपात में ब्लॉकिंग समाधान में पतला करें, और अंधेरे में बर्फ पर रखें। मल्टी-वेल ढक्कन को सील करने के बाद, सीलिंग फिल्म के ऊपर प्रति कवर स्लिप में 25 माइक्रोलीटर एंटी-खरगोश समाधान जोड़ें। और कवर स्लिप को एक द्वितीयक एंटीबॉडी के साथ इलाज करें जैसा कि पहले दिखाया गया था।फिर प्रकाश से संरक्षित कमरे के तापमान पर दो घंटे के लिए आर्द्रता कक्ष में प्लेट को इनक्यूबेट करें। एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेशन के अंत में, पीबीएस के साथ मल्टी-वेल प्लेट पर कवर स्लिप को तीन बार धोएं। प्रत्येक कवर पर्ची को तैयार DAPI घोल के साथ 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।एक बार पीबीएस के साथ धोने के बाद, अंधेरे में मल्टी-वेल प्लेट को बनाए रखें। सेल मोंटाज के लिए, पानी और कागज के एक टुकड़े के साथ दो बीकर तैयार करें। स्लाइड पर प्रति कवर पर्ची में पीवीए-डीएबीसीओ समाधान के 10 माइक्रोलीटर जोड़ें।कवर स्लिप को पानी में धो लें, और फिर इसे कागज पर सुखाएं। अंत में, इसे पीवीए-डीएबीसीओ ड्रॉप पर रखें। और अंधेरे में रात भर सूखते हैं।अगले दिन, एक उल्टे कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके, लेबल की गई कोशिकाओं की कल्पना करें और छवियों को कैप्चर करें। छवियों को कैप्चर करने के बाद, फिजी स्क्रीन में कैप्चर किए गए चैनलों वाली प्रत्येक छवि फ़ाइल को खींचें और छोड़ दें। संवाद बॉक्स में, छवि खोलने के लिए ठीक क्लिक करें.फिर खुली कंसोल विंडो को बंद करें। छवि टैब से, रंग का चयन करें, और उसके बाद चैनल विभाजित करें। LC3 छवि के अलावा अन्य चैनलों के अनुरूप छवि को बंद करें।फिर छवि टैब में, समायोजित करें का चयन करें, इसके बाद रंग संतुलन है। अधिकतम स्लाइडर को बाईं ओर ले जाएं जब तक कि छवि सेल आकृति की कल्पना करने के लिए संतृप्त न हो जाए। कक्ष की रूपरेखा खींचने के लिए फ्रीहैंड चयन उपकरण का उपयोग करें, और रंगों को समायोजित करने के लिए रीसेट करें क्लिक करें.चयनित आइटम को संपादन टैब से काटने के लिए, कटौती का चयन करें, और छवि को सहेजे बिना बंद करें. और संपादन टैब से, पेस्ट का चयन करें। विश्लेषण मेनू में, उपकरण 3 डी ऑब्जेक्ट्स काउंटर चुनें।सीमा को 2000 पर सेट करें, और आकार फ़िल्टर 50 से 500 पर। सुनिश्चित करें कि ऑब्जेक्ट्स और सारांश बक्से चिह्नित हैं, और लॉग विंडो OK.In पर क्लिक करें, डॉट्स की संख्या का पता लगाए गए ऑब्जेक्ट्स के रूप में वर्णित किया जाएगा। इम्यूनोफ्लोरेसेंस ने एलसी 3 प्रोटीन के सेलुलर वितरण का संकेत दिया, जबकि डीएपीआई ने अग्नाशय ी कोशिकाओं में परमाणु स्थानीयकरण दिखाया।जेमसिटाबाइन उपचार के तहत एलसी 3 डॉट्स में काफी वृद्धि हुई, जो ऑटोफैजिक गतिविधि का संकेत देती है। एक अत्यधिक संगम के तहत, एक्सोक्राइन अग्न्याशय कोशिकाएं एक-दूसरे के ऊपर ढेर हो जाती हैं और बढ़ती हैं। पैराफॉर्मलडिहाइड सेल निर्धारण विधि एलसी 3 प्रोटीन को संरक्षित करने के लिए अप्रभावी थी, क्योंकि यह सटीक वितरण को प्रतिबिंबित नहीं करती थी।जब बीज बोने के दो दिन बाद इंतजार किए बिना निर्धारण या उपचार किया गया, तो पैनसी 1 कोशिकाओं का आकार गोल था। इस आकृति विज्ञान ने साइटोप्लाज्म और नाभिक के बीच संबंध को कम कर दिया, जिससे एलसी 3 के इंट्रासेल्युलर वितरण को समझना मुश्किल हो गया। अपूर्ण मेथनॉल निर्धारण उचित एलसी 3 इम्यूनो लेबलिंग में हस्तक्षेप कर सकता है, जिससे अस्पष्ट छवियां और उप-मानक मात्रा हो सकती है।इस प्रक्रिया के दौरान याद रखने वाली सबसे महत्वपूर्ण बात यह है कि कोशिकाओं को पैराफॉर्मलडिहाइड के बजाय छह मिनट के लिए ठंडे मेथनॉल में तय किया जाना चाहिए। इस प्रक्रिया के बाद, एलसी 3 और अन्य प्रोटीनों के बीच सह-स्थानीयकरण का विश्लेषण किया जा सकता है, जिससे एलसी 3 कार्यों से संबंधित विभिन्न आणविक मार्गों का अध्ययन किया जा सकता है।

Research

JoVE Journal

Biology

Monitoring Dynamic Changes In Mitochondrial Calcium Levels During Apoptosis Using A Genetically Encoded Calcium Sensor

निगरानी Apoptosis के दौरान Mitochondrial कैल्शियम स्तर में गतिशील परिवर्तन एक आनुवंशिक एन्कोडेड कैल्शियम सेंसर का उपयोग

Dynamic changes in intracellular calcium concentration in response to various stimuli regulates many cellular processes such as proliferation, ...

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the I&middot;Cryo Kit

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माउस शुक्राणु cryopreservation और रिकवरी मैं · क्रायो किट का उपयोग

Thousands of new genetically modified (GM) strains of mice have been created since the advent of transgenesis and knockout technologies.  Many of these ...

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

स्तनधारी कोशिकाओं में हीम संश्लेषण स्तर की माप

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Quantitative Immunofluorescence Assay to Measure the Variation in Protein Levels at Centrosomes

मात्रात्मक इम्यूनोफ्लोरेसेंस परख Centrosomes में प्रोटीन का स्तर में रूपांतर उपाय

Centrosomes are small but important organelles that serve as the poles of mitotic spindle to maintain genomic integrity or assemble primary cilia to ...

Comparison of Three Different Methods for Determining Cell Proliferation in Breast Cancer Cell Lines

स्तन कैंसर कोशिका लाइनों में सेल प्रसार निर्धारण के लिए तीन अलग अलग तरीकों की तुलना

Measuring cell proliferation can be performed by a number of different methods, each with varying levels of sensitivity, reproducibility and compatibility ...

Activating Autophagy by Aerobic Exercise in Mice

चूहे में एरोबिक व्यायाम से भोजी को सक्रिय

Autophagy is a lysosomal degradation pathway essential for cell homeostasis, function and differentiation. Under stress conditions, autophagy is induced ...

Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing

Microbiota विश्लेषण दो कदम पीसीआर और अगली पीढ़ी के 16S rRNA जीन अनुक्रमण का उपयोग

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the ...

Functional Assessment of Kinesin-7 CENP-E in Spermatocytes Using In Vivo Inhibition, Immunofluorescence and Flow Cytometry

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विवो निषेध, इम्यूनोफ्लोरेसेंस और फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग करके शुक्राणुकोशिकाओं में काइन्सिन -7 सीईएनपी-ई का कार्यात्मक मूल्यांकन

In eukaryotes, meiosis is essential for genome stability and genetic diversity in sexual reproduction. Experimental analyses of spermatocytes in testes ...

Analyzing Starvation-Induced Autophagy in the Drosophila melanogaster Larval Fat Body

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ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर लार्वा फैट बॉडी में भुखमरी-प्रेरित ऑटोफैगी का विश्लेषण

Autophagy is a cellular self-digestion process. It delivers cargo to the lysosomes for degradation in response to various stresses, including starvation. ...

Ultrastructural Localization of Endogenous LC3 by On-Section Correlative Light-Electron Microscopy

ऑन-सेक्शन कोररिलेटिव लाइट-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा अंतर्जात एलसी 3 का अल्ट्रास्ट्रक्चरल स्थानीयकरण

The visualization of autophagic organelles at the ultrastructural level by electron microscopy (EM) is essential to establish their identity and reveal ...