Name: evaluating autophagy levels in two different pancreatic cell models using lc3 immunofluorescence
Uploaded: 2023-04-28T13:40:00
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Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dell'Università di Buenos Aires (UBACyT 2018-2020 20020170100082BA), del Consiglio nazionale per la ricerca scientifica e la tecnologia (CONICET) (PIP 2021-2023 GI− 11220200101549CO; e PUE 22920170100033) e dell'Agenzia nazionale per la promozione scientifica e tecnologica (PICT 2019-01664).

1. Preparazione delle cellule
<ol><li>Immergere i coperchi rotondi da 12 mm in etanolo assoluto e posizionarli verticalmente nei pozzetti di una piastra a 24 pozzetti.</li>
	<li>Rimuovere il coperchio ed esporre la piastra multipozzetto alle radiazioni ultraviolette per 15 minuti.</li>
	<li>Posizionare i coprivetrini orizzontalmente e lavarli con Modified Eagle Medium (DMEM) di Dulbecco.</li>
	<li>Semina un basso numero di cellule pancreatiche. L'importo deve essere adeguato per ottenere una confluenza...

<ol>
	<li>Grasso, D., Renna, F. J., Vaccaro, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initial+steps+in+mammalian+autophagosome+biogenesis.">Initial steps in mammalian autophagosome biogenesis.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 146 (2018).</li><li>Galluzzi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+definitions+of+autophagy+and+related+processes.">Molecular definitions of autophagy and related processes.</a> EMBO Journal. 36 (13), 1811-1836 (2017).</li><li>Kitada, M., Koya, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+in+metabolic+disease+and+ageing.">Autophagy in metabolic disease and ageing.</a> Nature Reviews Endocrinology. 17 (11), 647-661 (2021).</li><li>Ktistakis, N. T., Tooze, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digesting+the+expanding+mechanisms+of+autophagy.">Digesting the expanding mechanisms of autophagy.</a> Trends in Cell Biology. 26 (8), 624-635 (2016).</li><li>Tanida, I., Ueno, T., Kominami, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LC3+and+autophagy.">LC3 and autophagy.</a> Methods in Molecular Biology. 445, 77-88 (2008).</li><li>Kabeya, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LC3,+a+mammalian+homologue+of+yeast+Apg8p,+is+localized+in+autophagosome+membranes+after+processing.">LC3, a mammalian homologue of yeast Apg8p, is localized in autophagosome membranes after processing.</a> EMBO Journal. 19 (21), 5720-5728 (2000).</li><li>Mizushima, N., Yoshimori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+interpret+LC3+immunoblotting.">How to interpret LC3 immunoblotting.</a> Autophagy. 3 (6), 542-545 (2007).</li><li>Vanasco, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dynamics+and+VMP1-related+selective+mitophagy+in+experimental+acute+pancreatitis.">Mitochondrial dynamics and VMP1-related selective mitophagy in experimental acute pancreatitis.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 640094 (2021).</li><li>Williams, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+mechanisms+in+pancreas+and+salivary+acini.">Regulatory mechanisms in pancreas and salivary acini.</a> Annual Review of Physiology. 46, 361-375 (1984).</li><li>Mizrahi, J. D., Surana, R., Valle, J. W., Shroff, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+cancer.">Pancreatic cancer.</a> Lancet. 395 (10242), 2008-2020 (2020).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+and+function+of+autophagy+in+pancreatic+cancer.">Regulation and function of autophagy in pancreatic cancer.</a> Autophagy. 17 (11), 3275-3296 (2021).</li><li>Ropolo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+E2F1-EP300-VMP1+pathway+mediates+gemcitabine-induced+autophagy+in+pancreatic+cancer+cells+carrying+oncogenic+KRAS.">A novel E2F1-EP300-VMP1 pathway mediates gemcitabine-induced autophagy in pancreatic cancer cells carrying oncogenic KRAS.</a> Frontiers in Endocrinology. 11, 411 (2020).</li><li>Pardo, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gemcitabine+induces+the+VMP1-mediated+autophagy+pathway+to+promote+apoptotic+death+in+human+pancreatic+cancer+cells.">Gemcitabine induces the VMP1-mediated autophagy pathway to promote apoptotic death in human pancreatic cancer cells.</a> Pancreatology. 10 (1), 19-26 (2010).</li><li>Logsdon, C. D., Moessner, J., Williams, J. A., Goldfine, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucocorticoids+increase+amylase+mRNA+levels,+secretory+organelles,+and+secretion+in+pancreatic+acinar+AR42J+cells.">Glucocorticoids increase amylase mRNA levels, secretory organelles, and secretion in pancreatic acinar AR42J cells.</a> Journal of Cell Biology. 100 (4), 1200-1208 (1985).</li><li>Klionsky, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+assays+for+monitoring+autophagy+(4th+edition).">Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (4th edition).</a> Autophagy. 17 (1), 1 (2021).</li><li>Segeritz, C. -. P., Vallier, L., Jalali, M., Saldanha, F. Y. L., Jalali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+9+-+Cell+culture:+Growing+cells+as+model+systems+in+vitro.">Chapter 9 - Cell culture: Growing cells as model systems in vitro.</a> Basic Science Methods for Clinical Researchers. , 151-172 (2017).</li><li>Elliott, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+microscopy:+Principles+and+modern+practices.">Confocal microscopy: Principles and modern practices.</a> Current Protocols in Cytometry. 92 (1), 68 (2020).</li><li>Grasso, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+novel+selective+autophagy+pathway+mediated+by+VMP1-USP9x-p62,+prevents+pancreatic+cell+death.">a novel selective autophagy pathway mediated by VMP1-USP9x-p62, prevents pancreatic cell death.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (10), 8308-8324 (2011).</li><li>Ropolo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pancreatitis-induced+vacuole+membrane+protein+1+triggers+autophagy+in+mammalian+cells.">The pancreatitis-induced vacuole membrane protein 1 triggers autophagy in mammalian cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 282 (51), 37124-37133 (2007).</li><li>Karanasios, E., Stapleton, E., Walker, S. A., Manifava, M., Ktistakis, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+imaging+of+early+autophagy+events:+Omegasomes+and+beyond.">Live cell imaging of early autophagy events: Omegasomes and beyond.</a> Journal of Visualized Experiments. (77), e50484 (2013).</li><li>Kuma, A., Matsui, M., Mizushima, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LC3,+an+autophagosome+marker,+can+be+incorporated+into+protein+aggregates+independent+of+autophagy:+caution+in+the+interpretation+of+LC3+localization.">LC3, an autophagosome marker, can be incorporated into protein aggregates independent of autophagy: caution in the interpretation of LC3 localization.</a> Autophagy. 3 (4), 323-328 (2007).</li><li>Zhang, Z., Singh, R., Aschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+the+detection+of+autophagy+in+mammalian+cells.">Methods for the detection of autophagy in mammalian cells.</a> Current Protocols in Toxicology. 69, 1-26 (2016).</li><li>Yoshii, S. R., Mizushima, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+and+measuring+autophagy.">Monitoring and measuring autophagy.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (9), 1865 (2017).</li><li>Betriu, N., Andreeva, A., Semino, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erlotinib+promotes+ligand-induced+EGFR+degradation+in+3D+but+not+2D+cultures+of+pancreatic+ductal+adenocarcinoma+cells.">Erlotinib promotes ligand-induced EGFR degradation in 3D but not 2D cultures of pancreatic ductal adenocarcinoma cells.</a> Cancers. 13 (18), 4504 (2021).</li><li>Wang, W., Dong, L., Zhao, B., Lu, J., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E-cadherin+is+downregulated+by+microenvironmental+changes+in+pancreatic+cancer+and+induces+EMT.">E-cadherin is downregulated by microenvironmental changes in pancreatic cancer and induces EMT.</a> Oncology Reports. 40 (3), 1641-1649 (2018).</li><li>Kim, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+heterogeneity+and+plasticity+of+cancer+cell+migration+in+a+pancreatic+tumor+three-dimensional+culture+model.">Phenotypic heterogeneity and plasticity of cancer cell migration in a pancreatic tumor three-dimensional culture model.</a> Cancers. 12 (5), 1305 (2020).</li><li>Meng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+EpCAM+over-expression+is+associated+with+favorable+clinical+outcomes+in+pancreatic+cancer+patients+with+Hepatitis+B+virus+negative+infection.">Cytoplasmic EpCAM over-expression is associated with favorable clinical outcomes in pancreatic cancer patients with Hepatitis B virus negative infection.</a> International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 8 (12), 22204-22216 (2015).</li><li>Brock, R., Hamelers, I. H., Jovin, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+fixation+protocols+for+adherent+cultured+cells+applied+to+a+GFP+fusion+protein+of+the+epidermal+growth+factor+receptor.">Comparison of fixation protocols for adherent cultured cells applied to a GFP fusion protein of the epidermal growth factor receptor.</a> Cytometry. 35 (4), 353-362 (1999).</li></ol>

Il metodo descritto in questo protocollo consente di visualizzare la distribuzione endogena di LC3 nella cellula e quantificare i livelli autofagici in diverse condizioni. Un altro metodo simile utilizzato per analizzare la distribuzione di LC3 e determinare l'attivazione dell'autofagia coinvolge la trasfezione LC3 marcata con fluorescenza (come RFP-LC3)19. La trasfezione RFP-LC3 ha il vantaggio di non aver bisogno di fissazione (che consente di applicare questo metodo nell'imaging di cellule vive...

La macroautofagia (comunemente indicata come autofagia) è un processo catabolico specializzato che degrada selettivamente i componenti citoplasmatici, comprese le proteine e gli organelli danneggiati 1,2. L'autofagia consente alle cellule di rispondere fisiologicamente agli stimoli di stress e, quindi, mantenere l'omeostasi cellulare3. Durante l'autofagia, si forma una doppia vescicola di membrana: l'autofagosoma. L'autofagosoma contiene le molecole di carico e le guida al lisosoma per la degradazione 1,4.
Gli autofagosomi sono decorati dalla proteina autofagica microtubule-associated protein microtubule-associated protein light chain (LC3)5. Quando l'autofagia non è indotta, la CL3 è diffusa nel citoplasma e nel nucleo nella conformazione LC3-I. D'altra parte, quando viene indotta l'autofagia, LC3 è coniugata con una fosfatidiletanolammina nella membrana delle strutture autofagiche6. Questa nuova conformazione LC3 è nota come LC3-II1. Lo spostamento della conformazione di LC3 provoca cambiamenti nella sua localizzazione cellulare e nella sua migrazione di elettroforesi su gel di sodio solfato-poliacrilammide (SDS-PAGE), che può essere rilevata con tecniche come l'immunofluorescenza e il western blot 5,7. In questo modo, la coniugazione LC3 è un evento chiave nel processo autofagico che può essere utilizzato per misurare l'attività autofagica.
La cellula acinosa pancreatica è una cellula altamente differenziata che, in condizioni di salute, ha un basso tasso di autofagia. Tuttavia, in diverse condizioni fisiologiche o sotto stimolazione farmacologica, possono attivare l'autofagia. Pertanto, la determinazione dei livelli autofagici in questa linea cellulare è utile per studiare i potenziali effetti diretti o indiretti di diversi agenti farmacologici o biologici sull'autofagia 8,9.
L'adenocarcinoma pancreatico duttale è uno dei tipi più letali di cancro, data la sua diagnosi tardiva e la sua elevata resistenza alla chemioterapia10. Le cellule tumorali pancreatiche hanno un'elevata attività autofagica a causa della sovraregolazione trascrizionale e dell'attivazione post-traduzionale delle proteine correlate all'autofagia11. Le cellule tumorali pancreatiche possono regolare i loro livelli di autofagia in risposta a condizioni sfavorevoli come ipossia, privazione di nutrienti o danni indotti dalla chemioterapia11. Quindi, l'analisi dei livelli di autofagia nelle cellule tumorali pancreatiche può aiutare a capire come si adattano a diversi ambienti e valutare l'efficacia dei trattamenti che modulano l'autofagia.
Questo studio mostra un metodo per eseguire l'immunofluorescenza LC3 in due distinti modelli cellulari pancreatici. Il primo modello, le cellule PANC-1, è servito come modello per l'adenocarcinoma duttale pancreatico. Queste cellule sono state trattate con gemcitabina, un agente chemioterapico che ha precedentemente dimostrato di indurre l'autofagia, in particolare nelle cellule tumorali pancreatiche portatrici del gene oncogeno del virus del sarcoma di ratto Kirsten (KRAS)12,13. Il secondo modello, le cellule AR42J, è servito come modello più fisiologico delle cellule pancreatiche esocrine. Queste cellule sono state differenziate con desametasone per diventare più simili alle cellule pancreatiche acinose14. In queste cellule, l'autofagia è stata farmacologicamente indotta attraverso l'uso di PP242, che è un potente inibitore mTOR15. In questo studio, dimostriamo l'applicabilità del protocollo descritto con due diversi modelli pancreatici e la sua capacità di discriminare tra stati di autofagia bassa e alta.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10x Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>46-013-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 mm round coverslips</td>
			<td>HDA</td>
			<td>CBR_OBJ_6467</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 Well- Cell Culture Plate</td>
			<td>Sorfa</td>
			<td>220300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute ethanol</td>
			<td>Biopack</td>
			<td>2207.10.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 Donkey anti-rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R37119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Laser Scanning Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM 800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>62248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D4902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEN</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>01-052-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>NATOCOR&#160;</td>
			<td>Lintc-634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gemcitabina</td>
			<td>Eli Lilly</td>
			<td>VL7502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC3B (D11) XP Rabbit mAb</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>3868S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Anedra</td>
			<td>6197</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm &#34;M&#34; (Laboratory Sealing Film)</td>
			<td>Bemis/Curwood</td>
			<td>PM-996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Strep Solution</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>03-031-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PP242</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>SC-301606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11570626</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluating autophagy levels in two different pancreatic cell models using lc3 immunofluorescence

L'autofagia è un processo catabolico specializzato che degrada selettivamente i componenti citoplasmatici, comprese le proteine e gli organelli danneggiati. L'autofagia consente alle cellule di rispondere fisiologicamente agli stimoli di stress e, quindi, mantenere l'omeostasi cellulare. Le cellule tumorali potrebbero modulare i loro livelli di autofagia per adattarsi a condizioni avverse come ipossia, carenza di nutrienti o danni causati dalla chemioterapia. L'adenocarcinoma pancreatico duttale è uno dei tipi più mortali di cancro. Le cellule tumorali pancreatiche hanno un'elevata attività autofagica a causa della sovraregolazione trascrizionale e dell'attivazione post-traduzionale delle proteine dell'autofagia.
Qui, la linea cellulare PANC-1 è stata utilizzata come modello di cellule tumorali umane pancreatiche e la linea cellulare acinosa pancreatica AR42J è stata utilizzata come modello fisiologico di cellule di mammifero altamente differenziate. Questo studio ha utilizzato l'immunofluorescenza della catena leggera 3 (LC3) della proteina associata ai microtubuli come indicatore dello stato di attivazione dell'autofagia. LC3 è una proteina autofagica che, in condizioni basali, mostra un modello diffuso di distribuzione nel citoplasma (noto come LC3-I in questa condizione). L'induzione dell'autofagia innesca la coniugazione di LC3 alla fosfatidiletanolammina sulla superficie degli autofagosomi appena formati per formare LC3-II, una proteina legata alla membrana che aiuta nella formazione e nell'espansione degli autofagosomi. Per quantificare il numero di strutture autofagiche etichettate, il software open source FIJI è stato utilizzato con l'aiuto dello strumento "3D Objects Counter".
La misura dei livelli autofagici sia in condizioni fisiologiche che nelle cellule tumorali ci permette di studiare la modulazione dell'autofagia in diverse condizioni come l'ipossia, il trattamento chemioterapico o l'abbattimento di alcune proteine.

Questo protocollo esegue l'immunofluorescenza di CL3 in linee cellulari pancreatiche per determinare i livelli di autofagia in diverse condizioni. Il risultato di questo esperimento è stato l'ottenimento di immagini cellulari dai canali rosso e blu, corrispondenti a LC3 e DAPI. Le immagini LC3 indicano la distribuzione cellulare di questa proteina, mentre il DAPI mostra la localizzazione nucleare. La Figura 2A mostra un'immagine rappresentativa dell'immunofluorescenza di LC3 e della sua fus...

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Evaluating Autophagy Levels in Two Different Pancreatic Cell Models Using LC3 Immunofluorescence

L'obiettivo di questo protocollo è determinare i livelli autofagici nel cancro del pancreas e nelle cellule acinose pancreatiche attraverso l'immunofluorescenza LC3 e la quantificazione dei punti LC3.

Valutazione dei livelli di autofagia in due diversi modelli di cellule pancreatiche utilizzando l'immunofluorescenza LC3

Autophagy is a specialized catabolic process that selectively degrades cytoplasmic components, including proteins and damaged organelles. Autophagy allows ...

L'immunofluorescenza LC3 consente la determinazione dei livelli di autofagia nelle cellule pancreatiche. Permette lo studio dei potenziali effetti di diversi agenti sull'autofagia delle cellule pancreatiche. L'immunofluorescenza è una tecnica utilizzata per rilevare la proteina LC3 endogena, che evita problemi causati dalla sovraespressione di LC3, come la formazione di aggregati proteici non correlati all'autofagia.A dimostrare la procedura saranno Felipe Renna, dottorando, e Malena Herrera Lopez, dottoranda del laboratorio di Maria Ines Vaccaro. Per iniziare la preparazione delle cellule, immergere i vetrini di copertura rotondi da 12 millimetri in etanolo assoluto. Dopo aver rimosso il coperchio, posizionare verticalmente la linguetta del coperchio imbevuto nella piastra a 24 pozzetti.Esporre la piastra multipozzetto alle radiazioni ultraviolette per 15 minuti. Quindi posizionare il vetrino del coperchio orizzontalmente e lavarlo con DMEM. Ora vedi il basso numero di cellule pancreatiche, ri-sospese in DMEM, contenenti il 10% di FBS, penicillina e streptomicina, e incubare le cellule per due giorni.Due giorni dopo la semina cellulare, preparare la soluzione di gemcitabina in DMEM a una concentrazione di microgrammi per microlitro. Quindi aspirare metà del volume da ciascun pozzetto in un tubo separato e aggiungere la quantità appropriata di soluzione di gemcitabina. Riportare il mezzo volume corrispondente a ciascun pozzetto nei pozzetti trattati e incubare le cellule per 24 ore.Per fissare e permeabilizzare le cellule, aggiungere metanolo freddo in una piastra contenente celle a 24 pozzetti. Preparare anche una piastra a sei pozzetti con PBS freddo. Utilizzando un ago da siringa e una pinzetta, prendere ogni foglietto di copertura e lavarlo due volte in PBS.Quindi incubare in metanolo per sei minuti. Dopo aver lavato due volte con PBS, incubare i vetrini di copertura in una soluzione bloccante per un'ora. Aggiungere un anti LC3 nella soluzione di blocco in un rapporto di uno a 1000 e mantenere sul ghiaccio.Posizionare un pezzo di pellicola sigillante da laboratorio sul coperchio multipozzetto e aggiungere 25 microlitri di soluzione anti-LC3 per vetrino di copertura sulla pellicola sigillante. Utilizzando un ago da siringa e una pinzetta, posizionare ogni vetrino di copertura sulla goccia dell'anticorpo primario, assicurandosi che il lato cellulare sia in contatto con la soluzione. Posizionare la piastra multipozzetto nella camera di umidità.Coprirlo con un foglio di alluminio e incubare per una notte in frigorifero. Il giorno successivo, rimuovere la piastra multi-pozzetto dalla camera di umidità. Posizionare i foglietti di copertura sulla piastra multipozzetto e lavarli con PBS tre volte.Diluire l'anti-coniglio marcato con fluorescenza in soluzione bloccante in un rapporto di uno a 800 e mantenere sul ghiaccio al buio. Dopo aver sigillato il coperchio multi-pozzetto, aggiungere 25 microlitri di soluzione anti-coniglio per scivolone di copertura sul film sigillante. E trattare il vetrino di copertura con un anticorpo secondario come precedentemente dimostrato.Quindi incubare la piastra nella camera di umidità per due ore a temperatura ambiente, al riparo dalla luce. Alla fine dell'incubazione con anticorpo, lavare tre volte i vetrini di copertura sulla piastra multipozzetto con PBS. Incubare ogni vetrino di copertura con la soluzione DAPI preparata per 10 minuti.Una volta lavato con PBS, mantenere la piastra multi-pozzetto al buio. Per il montaggio cellulare, preparare due bicchieri con acqua e un pezzo di carta. Aggiungere 10 microlitri di soluzione PVA-DABCO per vetrino di copertina.Lavare il coperchio in acqua, quindi asciugarlo su carta. Infine, posizionalo sopra la goccia PVA-DABCO. E asciugare durante la notte al buio.Il giorno successivo, utilizzando un microscopio confocale invertito, visualizzare le cellule etichettate e catturare le immagini. Dopo aver acquisito le immagini, trascina e rilascia ogni file immagine contenente i canali acquisiti nella schermata Fiji. Nella finestra di dialogo, fate clic su OK per aprire l'immagine.Quindi chiudere la finestra della console aperta. Nella scheda Immagine selezionare Colore, quindi Dividi canali. Chiudere l'immagine corrispondente ai canali diversi dall'immagine LC3.Quindi, nella scheda Immagine, seleziona Regola, quindi Bilanciamento colore. Spostare il dispositivo di scorrimento massimo verso sinistra fino a saturare l'immagine per visualizzare i contorni delle celle. Usate lo strumento selezione a mano libera per disegnare il contorno della cella e fate clic su Reimposta per regolare i colori.Per tagliare l'elemento selezionato dalla scheda Modifica, selezionare Taglia e chiudere l'immagine senza salvarla. E dalla scheda Modifica, seleziona incolla. Nel menu Analizza, scegliete lo strumento Contatore oggetti 3D.Impostare la soglia su 2000 e il filtro delle dimensioni su 50-500. Assicurarsi che gli oggetti e le caselle di riepilogo siano contrassegnati e fare clic su OK.In finestra del registro, il numero di punti verrà descritto come oggetti rilevati. L'immunofluorescenza ha indicato la distribuzione cellulare della proteina LC3, mentre il DAPI ha mostrato la localizzazione nucleare nelle cellule pancreatiche.I punti LC3 sono aumentati significativamente durante il trattamento con gemcitabina, indicando attività autofagica. Sotto un'eccessiva confluenza, le cellule del pancreas esocrino tendono ad accumularsi e crescere l'una sopra l'altra. Il metodo di fissazione delle cellule paraformaldeide era inefficace per preservare le proteine LC3, in quanto non rifletteva una distribuzione accurata.Quando la fissazione o il trattamento sono stati eseguiti senza attendere due giorni dopo la semina, le cellule PANC1 avevano una forma rotonda. Questa morfologia ha diminuito la relazione tra il citoplasma e il nucleo, rendendo difficile comprendere la distribuzione intracellulare di LC3. La fissazione incompleta del metanolo potrebbe interferire con la corretta etichettatura immunologica della CL3, portando a immagini poco chiare e a una quantificazione non ottimale.La cosa più importante da ricordare durante questa procedura è che le cellule devono essere fissate in metanolo freddo per sei minuti, invece di paraformaldeide. Seguendo questa procedura, può essere analizzata la colocalizzazione tra LC3 e altre proteine, permettendo lo studio di diversi pathways molecolari correlati alle funzioni di LC3.

Research

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Biology

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