Name: evaluating autophagy levels in two different pancreatic cell models using lc3 immunofluorescence
Uploaded: 2023-04-28T13:40:00
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この研究は、ブエノスアイレス大学(UBACyT 2018-2020 20020170100082BA)、国立科学研究技術評議会(CONICET)(PIP 2021-2023 GI− 11220200101549CO;およびPUE 22920170100033)、および国立科学技術振興庁(PICT 2019-01664)からの助成金によって支援されました。

1.細胞調製
<ol><li>12 mmの丸いカバーガラスを無水エタノールに浸し、24ウェルプレートのウェルに垂直に置きます。</li>
	<li>カバーを取り外し、マルチウェルプレートを紫外線に15分間さらします。</li>
	<li>カバーガラスを水平に置き、ダルベッコのモディファイドイーグルミディアム(DMEM)で洗います。</li>
	<li>低継代数の膵臓細胞を播種する。固定日に50%〜75%のコンフルエンシー?...

<ol>
	<li>Grasso, D., Renna, F. J., Vaccaro, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initial+steps+in+mammalian+autophagosome+biogenesis.">Initial steps in mammalian autophagosome biogenesis.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 146 (2018).</li><li>Galluzzi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+definitions+of+autophagy+and+related+processes.">Molecular definitions of autophagy and related processes.</a> EMBO Journal. 36 (13), 1811-1836 (2017).</li><li>Kitada, M., Koya, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+in+metabolic+disease+and+ageing.">Autophagy in metabolic disease and ageing.</a> Nature Reviews Endocrinology. 17 (11), 647-661 (2021).</li><li>Ktistakis, N. T., Tooze, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digesting+the+expanding+mechanisms+of+autophagy.">Digesting the expanding mechanisms of autophagy.</a> Trends in Cell Biology. 26 (8), 624-635 (2016).</li><li>Tanida, I., Ueno, T., Kominami, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LC3+and+autophagy.">LC3 and autophagy.</a> Methods in Molecular Biology. 445, 77-88 (2008).</li><li>Kabeya, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LC3,+a+mammalian+homologue+of+yeast+Apg8p,+is+localized+in+autophagosome+membranes+after+processing.">LC3, a mammalian homologue of yeast Apg8p, is localized in autophagosome membranes after processing.</a> EMBO Journal. 19 (21), 5720-5728 (2000).</li><li>Mizushima, N., Yoshimori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+interpret+LC3+immunoblotting.">How to interpret LC3 immunoblotting.</a> Autophagy. 3 (6), 542-545 (2007).</li><li>Vanasco, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dynamics+and+VMP1-related+selective+mitophagy+in+experimental+acute+pancreatitis.">Mitochondrial dynamics and VMP1-related selective mitophagy in experimental acute pancreatitis.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 640094 (2021).</li><li>Williams, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+mechanisms+in+pancreas+and+salivary+acini.">Regulatory mechanisms in pancreas and salivary acini.</a> Annual Review of Physiology. 46, 361-375 (1984).</li><li>Mizrahi, J. D., Surana, R., Valle, J. W., Shroff, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+cancer.">Pancreatic cancer.</a> Lancet. 395 (10242), 2008-2020 (2020).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+and+function+of+autophagy+in+pancreatic+cancer.">Regulation and function of autophagy in pancreatic cancer.</a> Autophagy. 17 (11), 3275-3296 (2021).</li><li>Ropolo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+E2F1-EP300-VMP1+pathway+mediates+gemcitabine-induced+autophagy+in+pancreatic+cancer+cells+carrying+oncogenic+KRAS.">A novel E2F1-EP300-VMP1 pathway mediates gemcitabine-induced autophagy in pancreatic cancer cells carrying oncogenic KRAS.</a> Frontiers in Endocrinology. 11, 411 (2020).</li><li>Pardo, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gemcitabine+induces+the+VMP1-mediated+autophagy+pathway+to+promote+apoptotic+death+in+human+pancreatic+cancer+cells.">Gemcitabine induces the VMP1-mediated autophagy pathway to promote apoptotic death in human pancreatic cancer cells.</a> Pancreatology. 10 (1), 19-26 (2010).</li><li>Logsdon, C. D., Moessner, J., Williams, J. A., Goldfine, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucocorticoids+increase+amylase+mRNA+levels,+secretory+organelles,+and+secretion+in+pancreatic+acinar+AR42J+cells.">Glucocorticoids increase amylase mRNA levels, secretory organelles, and secretion in pancreatic acinar AR42J cells.</a> Journal of Cell Biology. 100 (4), 1200-1208 (1985).</li><li>Klionsky, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+assays+for+monitoring+autophagy+(4th+edition).">Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (4th edition).</a> Autophagy. 17 (1), 1 (2021).</li><li>Segeritz, C. -. P., Vallier, L., Jalali, M., Saldanha, F. Y. L., Jalali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+9+-+Cell+culture:+Growing+cells+as+model+systems+in+vitro.">Chapter 9 - Cell culture: Growing cells as model systems in vitro.</a> Basic Science Methods for Clinical Researchers. , 151-172 (2017).</li><li>Elliott, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+microscopy:+Principles+and+modern+practices.">Confocal microscopy: Principles and modern practices.</a> Current Protocols in Cytometry. 92 (1), 68 (2020).</li><li>Grasso, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+novel+selective+autophagy+pathway+mediated+by+VMP1-USP9x-p62,+prevents+pancreatic+cell+death.">a novel selective autophagy pathway mediated by VMP1-USP9x-p62, prevents pancreatic cell death.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (10), 8308-8324 (2011).</li><li>Ropolo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pancreatitis-induced+vacuole+membrane+protein+1+triggers+autophagy+in+mammalian+cells.">The pancreatitis-induced vacuole membrane protein 1 triggers autophagy in mammalian cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 282 (51), 37124-37133 (2007).</li><li>Karanasios, E., Stapleton, E., Walker, S. A., Manifava, M., Ktistakis, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+imaging+of+early+autophagy+events:+Omegasomes+and+beyond.">Live cell imaging of early autophagy events: Omegasomes and beyond.</a> Journal of Visualized Experiments. (77), e50484 (2013).</li><li>Kuma, A., Matsui, M., Mizushima, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LC3,+an+autophagosome+marker,+can+be+incorporated+into+protein+aggregates+independent+of+autophagy:+caution+in+the+interpretation+of+LC3+localization.">LC3, an autophagosome marker, can be incorporated into protein aggregates independent of autophagy: caution in the interpretation of LC3 localization.</a> Autophagy. 3 (4), 323-328 (2007).</li><li>Zhang, Z., Singh, R., Aschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+the+detection+of+autophagy+in+mammalian+cells.">Methods for the detection of autophagy in mammalian cells.</a> Current Protocols in Toxicology. 69, 1-26 (2016).</li><li>Yoshii, S. R., Mizushima, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+and+measuring+autophagy.">Monitoring and measuring autophagy.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (9), 1865 (2017).</li><li>Betriu, N., Andreeva, A., Semino, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erlotinib+promotes+ligand-induced+EGFR+degradation+in+3D+but+not+2D+cultures+of+pancreatic+ductal+adenocarcinoma+cells.">Erlotinib promotes ligand-induced EGFR degradation in 3D but not 2D cultures of pancreatic ductal adenocarcinoma cells.</a> Cancers. 13 (18), 4504 (2021).</li><li>Wang, W., Dong, L., Zhao, B., Lu, J., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E-cadherin+is+downregulated+by+microenvironmental+changes+in+pancreatic+cancer+and+induces+EMT.">E-cadherin is downregulated by microenvironmental changes in pancreatic cancer and induces EMT.</a> Oncology Reports. 40 (3), 1641-1649 (2018).</li><li>Kim, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+heterogeneity+and+plasticity+of+cancer+cell+migration+in+a+pancreatic+tumor+three-dimensional+culture+model.">Phenotypic heterogeneity and plasticity of cancer cell migration in a pancreatic tumor three-dimensional culture model.</a> Cancers. 12 (5), 1305 (2020).</li><li>Meng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+EpCAM+over-expression+is+associated+with+favorable+clinical+outcomes+in+pancreatic+cancer+patients+with+Hepatitis+B+virus+negative+infection.">Cytoplasmic EpCAM over-expression is associated with favorable clinical outcomes in pancreatic cancer patients with Hepatitis B virus negative infection.</a> International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 8 (12), 22204-22216 (2015).</li><li>Brock, R., Hamelers, I. H., Jovin, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+fixation+protocols+for+adherent+cultured+cells+applied+to+a+GFP+fusion+protein+of+the+epidermal+growth+factor+receptor.">Comparison of fixation protocols for adherent cultured cells applied to a GFP fusion protein of the epidermal growth factor receptor.</a> Cytometry. 35 (4), 353-362 (1999).</li></ol>

このプロトコルに記載されている方法は、細胞内の内因性LC3分布を視覚化し、異なる条件下でオートファジーレベルを定量化することを可能にする。LC3の分布を分析し、オートファジーの活性化を決定するために使用される別の同様の方法には、蛍光標識されたLC3トランスフェクション(RFP-LC3など)が含まれます19。RFP-LC3トランスフェクションには、固定が不要(この方法をラ...

マクロオートファジー(一般にオートファジーと呼ばれる)は、タンパク質や損傷した細胞小器官などの細胞質成分を選択的に分解する特殊な異化プロセスです1,2。オートファジーは、細胞がストレス刺激に生理学的に応答することを可能にし、したがって、細胞の恒常性を維持する3。オートファジーの間に、二重膜小胞、すなわちオートファゴソームが形成される。オートファゴソームは貨物分子を含み、分解のためにそれらをリソソームに駆動します1,4。
オートファゴソームは、オートファジータンパク質微小管関連タンパク質軽鎖3(LC3)5によって装飾されています。オートファジーが誘導されない場合、LC3は細胞質に拡散し、核はLC3-I立体構造に拡散します。一方、オートファジーが誘導されると、LC3はオートファジー構造6の膜においてホスファチジルエタノールアミンと共役する。この新しいLC3立体配座はLC3-II1として知られています。LC3コンフォメーションシフトは、その細胞局在とドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)の移行に変化を引き起こし、免疫蛍光法やウェスタンブロットなどの手法で検出できます5,7。このように、LC3コンジュゲーションは、オートファジー活動の測定に使用できるオートファジープロセスの重要なイベントです。
膵臓腺房細胞は高度に分化した細胞であり、健康な条件下ではオートファジーの発生率が低い。しかしながら、異なる生理学的条件において、または薬理学的刺激下で、それらはオートファジーを活性化することができる。したがって、この細胞株におけるオートファジーレベルの決定は、オートファジーに対する異なる薬理学的または生物学的薬剤の潜在的な直接的または間接的な効果を研究するのに有用である8,9。
乳管膵臓腺癌は、診断が遅く、化学療法耐性が高いことを考えると、最も致命的な種類の癌の10つです。膵臓がん細胞は、オートファジー関連タンパク質の転写アップレギュレーションと翻訳後活性化により、高いオートファジー活性を示します11。膵臓がん細胞は、低酸素症、栄養不足、化学療法による損傷などの好ましくない条件に応じてオートファジーレベルを調整する可能性があります11。したがって、膵臓がん細胞のオートファジーレベルを分析することは、それらがさまざまな環境にどのように適応するかを理解し、オートファジー調節治療の有効性を評価するのに役立ちます。
この研究は、2つの異なる膵臓細胞モデルでLC3免疫蛍光を実行する方法を示しています。最初のモデルであるPANC-1細胞は、膵管腺癌のモデルとして機能しました。これらの細胞は、発癌性キルステンラット肉腫ウイルス遺伝子(KRAS)12,13を有する膵臓癌細胞において、オートファジーを誘導することが以前に示されている化学療法剤であるゲムシタビンで処理されました。第2のモデルであるAR42J細胞は、膵臓外分泌細胞のより生理学的なモデルとして役立った。これらの細胞をデキサメタゾンで分化させて、腺房膵臓細胞14により類似したものとなった。これらの細胞では、強力なmTOR阻害剤であるPP242を使用することでオートファジーが薬理学的に誘導されました15。本研究では、2つの異なる膵臓モデルで記述されたプロトコルの適用性と、低オートファジーと高オートファジーの状態を区別する能力を実証します。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10x Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>46-013-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 mm round coverslips</td>
			<td>HDA</td>
			<td>CBR_OBJ_6467</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 Well- Cell Culture Plate</td>
			<td>Sorfa</td>
			<td>220300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute ethanol</td>
			<td>Biopack</td>
			<td>2207.10.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 Donkey anti-rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R37119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Laser Scanning Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM 800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>62248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D4902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEN</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>01-052-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>NATOCOR&#160;</td>
			<td>Lintc-634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gemcitabina</td>
			<td>Eli Lilly</td>
			<td>VL7502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC3B (D11) XP Rabbit mAb</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>3868S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Anedra</td>
			<td>6197</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm &#34;M&#34; (Laboratory Sealing Film)</td>
			<td>Bemis/Curwood</td>
			<td>PM-996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Strep Solution</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>03-031-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PP242</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>SC-301606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11570626</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluating autophagy levels in two different pancreatic cell models using lc3 immunofluorescence

オートファジーは、タンパク質や損傷した細胞小器官などの細胞質成分を選択的に分解する特殊な異化プロセスです。オートファジーは、細胞がストレス刺激に生理学的に応答することを可能にし、したがって、細胞の恒常性を維持する。がん細胞は、オートファジーレベルを調節して、低酸素症、栄養不足、化学療法による損傷などの悪条件に適応する可能性があります。乳管膵臓腺癌は、最も致命的な種類の癌の1つです。膵臓がん細胞は、オートファジータンパク質の転写アップレギュレーションと翻訳後活性化により、高いオートファジー活性を示します。
ここでは、膵臓ヒト癌細胞のモデルとしてPANC-1細胞株を用い、高分化哺乳類細胞の生理モデルとしてAR42J膵腺房細胞株を用いた。この研究では、オートファジー活性化の状態の指標として、微小管関連タンパク質軽鎖3(LC3)の免疫蛍光を使用しました。LC3はオートファジータンパク質であり、基底条件下では細胞質内の分布の拡散パターンを示します(この状態ではLC3-Iとして知られています)。オートファジー誘導は、新しく形成されたオートファゴソームの表面上のLC3とホスファチジルエタノールアミンの結合を引き起こし、オートファゴソームの形成と増殖を助ける膜結合タンパク質であるLC3-IIを形成します。標識されたオートファジー構造の数を定量化するために、オープンソースソフトウェアFIJIが「3Dオブジェクトカウンター」ツールの助けを借りて利用されました。
生理学的条件と癌細胞の両方におけるオートファジーレベルの測定により、低酸素症、化学療法治療、または特定のタンパク質のノックダウンなどの多様な条件下でのオートファジーの調節を研究することができます。

このプロトコルは、膵臓細胞株におけるLC3の免疫蛍光を行い、異なる条件下でのオートファジーレベルを決定する。この実験の結果は、LC3とDAPIに対応する赤と青のチャネルからの細胞画像の観察でした。LC3画像はこのタンパク質の細胞分布を示し、DAPIは核局在を示しています。 図2A は、基礎またはゲムシタビン処理条件下でのPANC-1細胞におけるLC3およびそのDAPI染色と...

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Evaluating Autophagy Levels in Two Different Pancreatic Cell Models Using LC3 Immunofluorescence

このプロトコルの目的は、LC3免疫蛍光およびLC3ドット定量を通じて、膵臓癌および膵臓腺房細胞のオートファジーレベルを決定することです。

LC3免疫蛍光を用いた2つの異なる膵臓細胞モデルにおけるオートファジーレベルの評価(英語)

Autophagy is a specialized catabolic process that selectively degrades cytoplasmic components, including proteins and damaged organelles. Autophagy allows ...

LC3免疫蛍光法は、膵臓細胞のオートファジーレベルの測定を可能にします。これにより、膵臓細胞のオートファジーに対するさまざまな薬剤の潜在的な影響の研究が可能になります。免疫蛍光法は、内因性LC3タンパク質を検出するために利用される技術であり、オートファジーとは無関係のタンパク質凝集体の形成など、LC3の過剰発現によって引き起こされる問題を回避します。手順を実演するのは、博士課程の卒業生であるフェリペ・レナと、マリア・イネス・ヴァッカロの研究室の博士課程の学生であるマレーナ・エレーラ・ロペスです。細胞調製を開始するには、12ミリメートルの丸いカバースリップを無水エタノールに浸します。カバーを取り外した後、浸したカバースリップを24ウェルプレートに垂直に置きます。マルチウェルプレートを紫外線に15分間さらします。次に、カバースリップを水平に配置し、DMEMで洗浄します。次に、10%FBS、ペニシリン、およびストレプトマイシンを含むDMEMに再懸濁した膵臓細胞の通過数が少ないことを確認し、細胞を2日間インキュベートします。細胞播種の2日後、DMEM中のゲムシタビン溶液を1マイクロリットル当たり1マイクログラムの濃度で調製する。次に、各ウェルから容量の半分を別々のチューブに吸引し、適量のゲムシタビン溶液を追加します。各ウェルに対応する半量を処理ウェルに戻し、細胞を24時間インキュベートする。細胞を固定および透過処理するには、細胞を含む24ウェルプレートに冷メタノールを加えます。また、コールドPBSを含む6ウェルプレートを準備します。シリンジニードルとピンセットを使用して、各カバースリップを取り、PBSで2回洗浄します。その後、メタノール中で6分間インキュベートします。PBSで2回洗浄した後、カバースリップをブロッキング溶液中で1時間インキュベートします。ブロッキング溶液にアンチLC3を1対1000の比率で加え、氷上で維持します。マルチウェルの蓋の上に実験室用シーリングフィルムを置き、シーリングフィルムの上にカバースリップごとに25マイクロリットルの抗LC3溶液を追加します。シリンジニードルとピンセットを使用して、各カバースリップを一次抗体ドロップの上に置き、細胞側が溶液に接触していることを確認します。マルチウェルプレートを湿度チャンバーに入れます。それをホイルで覆い、冷蔵庫で一晩インキュベートする。翌日、マルチウェルプレートを湿度チャンバーから取り出します。カバースリップをマルチウェルプレートに戻し、PBSで3回洗浄します。蛍光標識した抗ウサギをブロッキング溶液で1対800の比率で希釈し、暗所で氷上に保ちます。マルチウェル蓋を密封した後、シーリングフィルムの上にカバースリップごとに25マイクロリットルの抗ウサギ溶液を追加します。そして、以前に実証されたように、カバースリップを二次抗体で処理します。次に、プレートを湿度チャンバー内で、光から保護された室温で2時間インキュベートします。抗体とのインキュベーションが終了したら、マルチウェルプレート上のカバースリップをPBSで3回洗浄します。各カバースリップを調製したDAPI溶液で10分間インキュベートします。PBSで洗浄したら、マルチウェルプレートを暗所に維持します。セルモンタージュのために、水と一枚の紙で2つのビーカーを準備します。スライドのカバースリップごとに10マイクロリットルのPVA-DABCO溶液を追加します。カバースリップを水で洗い、紙で乾かします。最後に、PVA-DABCOドロップの上に置きます。そして暗闇の中で一晩乾かします。翌日、倒立共焦点顕微鏡を使用して、標識された細胞を視覚化し、画像をキャプチャします。画像をキャプチャした後、キャプチャしたチャネルを含む各画像ファイルをフィジー画面にドラッグアンドドロップします。ダイアログ ボックスで、[OK] をクリックして画像を開きます。次に、開いたコンソールウィンドウを閉じます。[画像] タブで、[色]、[チャンネルの分割] の順に選択します。LC3画像以外のチャンネルに対応する画像を閉じます。次に、[画像]タブで、[調整]、[カラーバランス]の順に選択します。画像が飽和するまで最大スライダーを左に動かして、セルの輪郭を視覚化します。フリーハンド選択ツールを使用してセルの輪郭を描画し、[リセット]をクリックして色を調整します。[編集] タブから選択した項目を切り取るには、[切り取り] を選択し、画像を保存せずに閉じます。そして、[編集]タブから[貼り付け]を選択します。[分析]メニューで、ツール[3Dオブジェクトカウンター]を選択します。しきい値を 2000 に設定し、サイズ フィルターを 50 から 500 に設定します。オブジェクトと概要ボックスがマークされていることを確認し、ログウィンドウ OK.In をクリックすると、ドットの数が検出されたオブジェクトとして説明されます。免疫蛍光はLC3タンパク質の細胞分布を示し、DAPIは膵臓細胞に核局在を示した。LC3ドットはゲムシタビン処理下で有意に増加し、オートファジー活性を示した。過度のコンフルエントの下では、外分泌膵臓細胞は積み重なって互いの上に成長する傾向があります。パラホルムアルデヒド細胞固定法は正確な分布を反映していないため、LC3タンパク質の保存には効果がありませんでした。播種後2日を待たずに固定または処理を行ったところ、PANC1細胞は丸い形状を呈した。この形態は細胞質と核の関係を減少させ、LC3の細胞内分布の理解を困難にしました。メタノールの固定が不完全な場合、LC3の適切な免疫標識が妨げられ、画像が不鮮明になり、定量が最適ではなくなる可能性があります。この手順で覚えておくべき最も重要なことは、細胞をパラホルムアルデヒドの代わりに冷たいメタノールに6分間固定する必要があるということです。この手順に続いて、LC3と他のタンパク質との間の共局在を解析することができ、LC3機能に関連するさまざまな分子経路の研究が可能になります。

Research

JoVE Journal

Biology

Monitoring Dynamic Changes In Mitochondrial Calcium Levels During Apoptosis Using A Genetically Encoded Calcium Sensor

遺伝的にコードされたカルシウムのセンサを用いたアポトーシス時のミトコンドリア内カルシウム濃度の動的変更の監視

Dynamic changes in intracellular calcium concentration in response to various stimuli regulates many cellular processes such as proliferation, ...

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the I&middot;Cryo Kit

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the IÃƒâ€šÃ‚Â·Cryo Kit

I ·クライオキットを使用してマウスの精子の凍結保存と回復

Thousands of new genetically modified (GM) strains of mice have been created since the advent of transgenesis and knockout technologies.  Many of these ...

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

哺乳動物細胞におけるヘム合成レベルの測定

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

Quantitative Immunofluorescence Assay to Measure the Variation in Protein Levels at Centrosomes

中心体におけるタンパク質レベルの変化を測定するための定量的免疫蛍光アッセイ

Centrosomes are small but important organelles that serve as the poles of mitotic spindle to maintain genomic integrity or assemble primary cilia to ...

Comparison of Three Different Methods for Determining Cell Proliferation in Breast Cancer Cell Lines

乳癌細胞株における細胞増殖を決定するための3つの異なる方法の比較

Measuring cell proliferation can be performed by a number of different methods, each with varying levels of sensitivity, reproducibility and compatibility ...

Activating Autophagy by Aerobic Exercise in Mice

マウスで有酸素運動によってオートファジーのアクティブ化

Autophagy is a lysosomal degradation pathway essential for cell homeostasis, function and differentiation. Under stress conditions, autophagy is induced ...

Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing

2段階PCRと次世代16S rRNA遺伝子シーケンシングを用いての微生物叢解析

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the ...

Functional Assessment of Kinesin-7 CENP-E in Spermatocytes Using In Vivo Inhibition, Immunofluorescence and Flow Cytometry

Functional Assessment of Kinesin-7 CENP-E in Spermatocytes Using In Vivo Inhibition, Immunofluorescence and Flow Cytometry

in vivo阻害、免疫蛍光法およびフローサイトメトリーを用いた精母細胞におけるキネシン-7 CENP-Eの機能評価(英語)

In eukaryotes, meiosis is essential for genome stability and genetic diversity in sexual reproduction. Experimental analyses of spermatocytes in testes ...

Analyzing Starvation-Induced Autophagy in the Drosophila melanogaster Larval Fat Body

Analyzing Starvation-Induced Autophagy in the Drosophila melanogaster Larval Fat Body

ショウジョウバエメラノガスター幼虫脂肪体における飢餓誘発オートファジーの解析

Autophagy is a cellular self-digestion process. It delivers cargo to the lysosomes for degradation in response to various stresses, including starvation. ...

Ultrastructural Localization of Endogenous LC3 by On-Section Correlative Light-Electron Microscopy

オンセクション相関光電子顕微鏡による内因性LC3の超微細構造局在

The visualization of autophagic organelles at the ultrastructural level by electron microscopy (EM) is essential to establish their identity and reveal ...