Name: evaluating autophagy levels in two different pancreatic cell models using lc3 immunofluorescence
Uploaded: 2023-04-28T13:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluating Autophagy Levels in Two Different Pancreatic Cell Models Using LC3 Immunofluorescence at JoVE.com

이 작업은 부에노스 아이레스 대학교 (UBACyT 2018-2020 20020170100082BA), 국립 과학 연구 기술위원회 (CONICET) (PIP 2021-2023 GI− 11220200101549CO 및 PUE 22920170100033) 및 국립 과학 기술 진흥기구 (PICT 2019-01664).

1. 세포 준비
<ol><li>12mm 원형 커버슬립을 무수 에탄올에 담그고 24웰 플레이트의 웰에 수직으로 놓습니다.</li>
	<li>덮개를 제거하고 멀티웰 플레이트를 15분 동안 자외선에 노출시킵니다.</li>
	<li>커버슬립을 수평으로 놓고 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)으로 세척합니다.</li>
	<li>낮은 통로 수의 췌장 세포를 시드하십시오. 고정 당일 50%-75% 밀도를 얻기 위해 양을 조정해야 합니다<sup class="...

<ol>
	<li>Grasso, D., Renna, F. J., Vaccaro, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initial+steps+in+mammalian+autophagosome+biogenesis.">Initial steps in mammalian autophagosome biogenesis.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 146 (2018).</li><li>Galluzzi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+definitions+of+autophagy+and+related+processes.">Molecular definitions of autophagy and related processes.</a> EMBO Journal. 36 (13), 1811-1836 (2017).</li><li>Kitada, M., Koya, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+in+metabolic+disease+and+ageing.">Autophagy in metabolic disease and ageing.</a> Nature Reviews Endocrinology. 17 (11), 647-661 (2021).</li><li>Ktistakis, N. T., Tooze, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digesting+the+expanding+mechanisms+of+autophagy.">Digesting the expanding mechanisms of autophagy.</a> Trends in Cell Biology. 26 (8), 624-635 (2016).</li><li>Tanida, I., Ueno, T., Kominami, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LC3+and+autophagy.">LC3 and autophagy.</a> Methods in Molecular Biology. 445, 77-88 (2008).</li><li>Kabeya, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LC3,+a+mammalian+homologue+of+yeast+Apg8p,+is+localized+in+autophagosome+membranes+after+processing.">LC3, a mammalian homologue of yeast Apg8p, is localized in autophagosome membranes after processing.</a> EMBO Journal. 19 (21), 5720-5728 (2000).</li><li>Mizushima, N., Yoshimori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+interpret+LC3+immunoblotting.">How to interpret LC3 immunoblotting.</a> Autophagy. 3 (6), 542-545 (2007).</li><li>Vanasco, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dynamics+and+VMP1-related+selective+mitophagy+in+experimental+acute+pancreatitis.">Mitochondrial dynamics and VMP1-related selective mitophagy in experimental acute pancreatitis.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 640094 (2021).</li><li>Williams, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+mechanisms+in+pancreas+and+salivary+acini.">Regulatory mechanisms in pancreas and salivary acini.</a> Annual Review of Physiology. 46, 361-375 (1984).</li><li>Mizrahi, J. D., Surana, R., Valle, J. W., Shroff, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+cancer.">Pancreatic cancer.</a> Lancet. 395 (10242), 2008-2020 (2020).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+and+function+of+autophagy+in+pancreatic+cancer.">Regulation and function of autophagy in pancreatic cancer.</a> Autophagy. 17 (11), 3275-3296 (2021).</li><li>Ropolo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+E2F1-EP300-VMP1+pathway+mediates+gemcitabine-induced+autophagy+in+pancreatic+cancer+cells+carrying+oncogenic+KRAS.">A novel E2F1-EP300-VMP1 pathway mediates gemcitabine-induced autophagy in pancreatic cancer cells carrying oncogenic KRAS.</a> Frontiers in Endocrinology. 11, 411 (2020).</li><li>Pardo, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gemcitabine+induces+the+VMP1-mediated+autophagy+pathway+to+promote+apoptotic+death+in+human+pancreatic+cancer+cells.">Gemcitabine induces the VMP1-mediated autophagy pathway to promote apoptotic death in human pancreatic cancer cells.</a> Pancreatology. 10 (1), 19-26 (2010).</li><li>Logsdon, C. D., Moessner, J., Williams, J. A., Goldfine, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucocorticoids+increase+amylase+mRNA+levels,+secretory+organelles,+and+secretion+in+pancreatic+acinar+AR42J+cells.">Glucocorticoids increase amylase mRNA levels, secretory organelles, and secretion in pancreatic acinar AR42J cells.</a> Journal of Cell Biology. 100 (4), 1200-1208 (1985).</li><li>Klionsky, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+assays+for+monitoring+autophagy+(4th+edition).">Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (4th edition).</a> Autophagy. 17 (1), 1 (2021).</li><li>Segeritz, C. -. P., Vallier, L., Jalali, M., Saldanha, F. Y. L., Jalali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+9+-+Cell+culture:+Growing+cells+as+model+systems+in+vitro.">Chapter 9 - Cell culture: Growing cells as model systems in vitro.</a> Basic Science Methods for Clinical Researchers. , 151-172 (2017).</li><li>Elliott, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+microscopy:+Principles+and+modern+practices.">Confocal microscopy: Principles and modern practices.</a> Current Protocols in Cytometry. 92 (1), 68 (2020).</li><li>Grasso, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+novel+selective+autophagy+pathway+mediated+by+VMP1-USP9x-p62,+prevents+pancreatic+cell+death.">a novel selective autophagy pathway mediated by VMP1-USP9x-p62, prevents pancreatic cell death.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (10), 8308-8324 (2011).</li><li>Ropolo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pancreatitis-induced+vacuole+membrane+protein+1+triggers+autophagy+in+mammalian+cells.">The pancreatitis-induced vacuole membrane protein 1 triggers autophagy in mammalian cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 282 (51), 37124-37133 (2007).</li><li>Karanasios, E., Stapleton, E., Walker, S. A., Manifava, M., Ktistakis, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+imaging+of+early+autophagy+events:+Omegasomes+and+beyond.">Live cell imaging of early autophagy events: Omegasomes and beyond.</a> Journal of Visualized Experiments. (77), e50484 (2013).</li><li>Kuma, A., Matsui, M., Mizushima, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LC3,+an+autophagosome+marker,+can+be+incorporated+into+protein+aggregates+independent+of+autophagy:+caution+in+the+interpretation+of+LC3+localization.">LC3, an autophagosome marker, can be incorporated into protein aggregates independent of autophagy: caution in the interpretation of LC3 localization.</a> Autophagy. 3 (4), 323-328 (2007).</li><li>Zhang, Z., Singh, R., Aschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+the+detection+of+autophagy+in+mammalian+cells.">Methods for the detection of autophagy in mammalian cells.</a> Current Protocols in Toxicology. 69, 1-26 (2016).</li><li>Yoshii, S. R., Mizushima, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+and+measuring+autophagy.">Monitoring and measuring autophagy.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (9), 1865 (2017).</li><li>Betriu, N., Andreeva, A., Semino, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erlotinib+promotes+ligand-induced+EGFR+degradation+in+3D+but+not+2D+cultures+of+pancreatic+ductal+adenocarcinoma+cells.">Erlotinib promotes ligand-induced EGFR degradation in 3D but not 2D cultures of pancreatic ductal adenocarcinoma cells.</a> Cancers. 13 (18), 4504 (2021).</li><li>Wang, W., Dong, L., Zhao, B., Lu, J., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E-cadherin+is+downregulated+by+microenvironmental+changes+in+pancreatic+cancer+and+induces+EMT.">E-cadherin is downregulated by microenvironmental changes in pancreatic cancer and induces EMT.</a> Oncology Reports. 40 (3), 1641-1649 (2018).</li><li>Kim, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+heterogeneity+and+plasticity+of+cancer+cell+migration+in+a+pancreatic+tumor+three-dimensional+culture+model.">Phenotypic heterogeneity and plasticity of cancer cell migration in a pancreatic tumor three-dimensional culture model.</a> Cancers. 12 (5), 1305 (2020).</li><li>Meng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+EpCAM+over-expression+is+associated+with+favorable+clinical+outcomes+in+pancreatic+cancer+patients+with+Hepatitis+B+virus+negative+infection.">Cytoplasmic EpCAM over-expression is associated with favorable clinical outcomes in pancreatic cancer patients with Hepatitis B virus negative infection.</a> International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 8 (12), 22204-22216 (2015).</li><li>Brock, R., Hamelers, I. H., Jovin, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+fixation+protocols+for+adherent+cultured+cells+applied+to+a+GFP+fusion+protein+of+the+epidermal+growth+factor+receptor.">Comparison of fixation protocols for adherent cultured cells applied to a GFP fusion protein of the epidermal growth factor receptor.</a> Cytometry. 35 (4), 353-362 (1999).</li></ol>

이 프로토콜에 설명된 방법을 사용하면 세포 내 내인성 LC3 분포를 시각화하고 다양한 조건에서 자가포식 수준을 정량화할 수 있습니다. LC3 분포를 분석하고 자가포식 활성화를 결정하는 데 사용되는 또 다른 유사한 방법은 형광 표지된 LC3 형질감염(예: RFP-LC3)을 포함합니다19. RFP-LC3 형질감염은 고정을 필요로 하지 않고(이는 생세포 이미징(20)에서 이 방법을 적?...

Macroautophagy (일반적으로 autophagy라고 함)는 단백질과 손상된 세포 소기관을 포함한 세포질 구성 요소를 선택적으로 분해하는 특수 이화 과정입니다 1,2. 자가포식은 세포가 스트레스 자극에 생리학적으로 반응하여 세포 항상성을 유지하도록 합니다3. autophagy 동안, 이중 막 소포가 형성됩니다 : autophagosome. 자가포식소체는 화물 분자를 포함하고 분해를 위해 리소좀으로 유도합니다 1,4.
자가포식소체는 자가포식 단백질 미세소관 관련 단백질 경쇄 3(LC3)5에 의해 장식됩니다. 자가포식이 유도되지 않을 때, LC3는 LC3-I 입체형태의 세포질 및 핵에서 확산된다. 한편, 자가포식이 유도되면, LC3은 자가포식 구조6의 막에서 포스파티딜에탄올아민과 접합된다. 이 새로운 LC3 형태는 LC3-II1로 알려져 있습니다. LC3 형태 이동은 세포 국소화 및 도데실 황산나트륨-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE) 이동의 변화를 일으키며, 이는 면역형광 및 웨스턴 블롯 5,7과 같은 기술로 감지할 수 있습니다. 이러한 방식으로 LC3 접합은 자가포식 활성을 측정하는 데 사용할 수 있는 자가포식 과정의 핵심 이벤트입니다.
췌장 acinar 세포는 건강한 조건에서 자가포식 비율이 낮은 고도로 분화된 세포입니다. 그러나 다른 생리적 조건이나 약리학적 자극 하에서 자가포식을 활성화할 수 있습니다. 그러므로, 이 세포주에서 자가포식 수준의 측정은 자가포식에 대한 다양한 약리학적 또는 생물학적 제제의 잠재적인 직간접적인 효과를 연구하는 데 유용하다8,9.
유관 췌장 선암종은 진단이 늦고 화학요법 저항성이 높기 때문에 가장 치명적인 유형의 암 중 하나이다10. 췌장암 세포는 자가포식 관련 단백질의 전사 상향 조절 및 번역 후 활성화로 인해 높은 자가포식 활성을 갖는다11. 췌장암 세포는 저산소증, 영양 결핍 또는 화학 요법으로 인한 손상과 같은 불리한 조건에 반응하여 자가포식 수준을 조정할 수 있습니다11. 따라서 췌장암 세포의 자가포식 수준을 분석하면 다양한 환경에 적응하는 방법을 이해하고 자가포식 조절 치료의 효과를 평가하는 데 도움이 될 수 있습니다.
이 연구는 두 개의 별개의 췌장 세포 모델에서 LC3 면역형광을 수행하는 방법을 보여줍니다. 첫 번째 모델인 PANC-1 세포는 췌관 선암의 모델로 사용되었습니다. 이 세포는 이전에 자가포식을 유도하는 것으로 밝혀진 화학요법제인 젬시타빈으로 처리되었으며, 특히 발암성 Kirsten 쥐 육종 바이러스 유전자(KRAS)를 운반하는 췌장암 세포에서 12,13. 두 번째 모델인 AR42J 세포는 외분비 췌장 세포의 보다 생리학적 모델로 사용되었습니다. 이 세포들은 덱사메타손으로 분화되어 acinar pancreatic cells14와 더 유사해졌습니다. 이들 세포에서, 자가포식은 강력한 mTOR 억제제인 PP242의 사용을 통해 약리학적으로 유도되었다15. 이 연구에서 우리는 두 가지 다른 췌장 모델로 설명된 프로토콜의 적용 가능성과 낮은 자가포식 상태와 높은 자가포식 상태를 구별하는 능력을 보여줍니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10x Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>46-013-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 mm round coverslips</td>
			<td>HDA</td>
			<td>CBR_OBJ_6467</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 Well- Cell Culture Plate</td>
			<td>Sorfa</td>
			<td>220300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute ethanol</td>
			<td>Biopack</td>
			<td>2207.10.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 Donkey anti-rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R37119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Laser Scanning Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM 800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>62248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D4902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEN</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>01-052-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>NATOCOR&#160;</td>
			<td>Lintc-634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gemcitabina</td>
			<td>Eli Lilly</td>
			<td>VL7502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC3B (D11) XP Rabbit mAb</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>3868S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Anedra</td>
			<td>6197</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm &#34;M&#34; (Laboratory Sealing Film)</td>
			<td>Bemis/Curwood</td>
			<td>PM-996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Strep Solution</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>03-031-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PP242</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>SC-301606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11570626</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluating autophagy levels in two different pancreatic cell models using lc3 immunofluorescence

자가포식은 단백질과 손상된 세포 소기관을 포함한 세포질 성분을 선택적으로 분해하는 특수한 이화 과정입니다. 자가포식은 세포가 스트레스 자극에 생리적으로 반응하여 세포 항상성을 유지하도록 합니다. 암세포는 저산소증, 영양 결핍 또는 화학 요법으로 인한 손상과 같은 불리한 조건에 적응하기 위해 자가포식 수준을 조절할 수 있습니다. 관 췌장 선암종은 가장 치명적인 유형의 암 중 하나입니다. 췌장암 세포는 자가포식 단백질의 전사 상향 조절 및 번역 후 활성화로 인해 높은 자가포식 활성을 가지고 있습니다.
여기서, 췌장 인간 암세포의 모델로 PANC-1 세포주를 사용하였고, 고도로 분화된 포유류 세포의 생리학적 모델로 AR42J 췌장 선엽 세포주를 사용하였다. 이 연구는 자가포식 활성화 상태의 지표로 미세소관 관련 단백질 경쇄 3(LC3)의 면역형광을 사용했습니다. LC3는 기저 조건에서 세포질의 확산 분포 패턴을 나타내는 자가포식 단백질입니다(이 조건에서는 LC3-I로 알려짐). 자가포식 유도는 새로 형성된 자가포식소체 표면의 포스파티딜에탄올아민에 대한 LC3의 접합을 촉발하여 자가포식소체의 형성 및 확장을 돕는 막 결합 단백질인 LC3-II를 형성합니다. 라벨이 붙은 자가포식 구조의 수를 정량화하기 위해 오픈 소스 소프트웨어 FIJI가 "3D Objects Counter" 도구를 사용하여 활용되었습니다.
생리적 조건과 암세포 모두에서 자가포식 수준을 측정하면 저산소증, 화학 요법 치료 또는 특정 단백질의 녹다운과 같은 다양한 조건에서 자가포식의 조절을 연구할 수 있습니다.

이 프로토콜은 췌장 세포주에서 LC3의 면역형광을 수행하여 다양한 조건에서 자가포식 수준을 결정합니다. 이 실험의 결과는 LC3 및 DAPI에 해당하는 적색 및 청색 채널에서 세포 이미지를 획득하는 것이었습니다. LC3 이미지는 이 단백질의 세포 분포를 나타내는 반면 DAPI는 핵 국소화를 나타냅니다. 도 2A 는 기저 또는 젬시타빈 처리 조건 하에서 PANC-1 세포에서 LC3의 면역형광 ?...

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Evaluating Autophagy Levels in Two Different Pancreatic Cell Models Using LC3 Immunofluorescence

이 프로토콜의 목표는 LC3 면역형광 및 LC3 도트 정량화를 통해 췌장암 및 췌장 전초 세포의 자가포식 수준을 결정하는 것입니다.

LC3 면역형광법을 사용하여 두 가지 다른 췌장 세포 모델에서 자가포식 수준 평가

Autophagy is a specialized catabolic process that selectively degrades cytoplasmic components, including proteins and damaged organelles. Autophagy allows ...

LC3 면역형광을 사용하면 췌장 세포의 자가포식 수준을 측정할 수 있습니다. 그것은 췌장 세포 자가포식에 대한 다양한 약제의 잠재적 효과에 대한 연구를 허용합니다. 면역형광법은 내인성 LC3 단백질을 검출하는 데 사용되는 기술로, 자가포식과 관련이 없는 단백질 응집체 형성과 같은 LC3 과발현으로 인한 문제를 방지합니다.이 절차를 시연하는 것은 박사 학위 졸업생 인 펠리페 레나 (Felipe Renna)와 마리아 이네스 바카로 (Maria Ines Vaccaro) 연구소의 박사 과정 학생 인 말레나 에레라 로페즈 (Malena Herrera Lopez)가 될 것입니다. 세포 준비를 시작하려면 12mm 원형 커버 슬립을 무수 에탄올에 담그십시오. 덮개를 제거한 후 담근 덮개 슬립을 24웰 플레이트에 수직으로 놓습니다.멀티웰 플레이트를 자외선에 15분 동안 노출시킨다. 그런 다음 커버 슬립을 수평으로 놓고 DMEM으로 세척합니다. 이제 췌장 세포의 낮은 계대 수를 확인하고, 10% FBS, 페니실린 및 스트렙토마이신을 함유한 DMEM에 재현탁하고, 세포를 이틀 동안 배양한다.세포 파종 2일 후, DMEM에서 젬시타빈 용액을 마이크로리터당 1마이크로그램 농도로 준비한다. 그런 다음 별도의 튜브에서 각 웰의 부피 절반을 흡인하고 적절한 양의 젬시 타빈 용액을 첨가하십시오. 각 웰에 상응하는 절반 부피를 처리된 웰로 되돌리고, 세포를 24시간 동안 인큐베이션한다.세포를 고정하고 투과시키기 위해, 차가운 메탄올을 세포를 함유하는 24-웰 플레이트에 첨가한다. 또한 차가운 PBS로 6 웰 플레이트를 준비하십시오. 주사기 바늘과 핀셋을 사용하여 각 커버 슬립을 꺼내 PBS로 두 번 씻습니다.그런 다음 메탄올에서 6 분 동안 배양합니다. PBS로 2회 세척한 후, 커버슬립을 블로킹 용액에서 1시간 동안 인큐베이션한다. 블로킹 용액에 안티 LC3를 1:1000의 비율로 첨가하고 얼음 위에서 유지한다.멀티웰 뚜껑 위에 실험실 밀봉 필름 조각을 놓고 밀봉 필름 위에 커버 슬립당 25마이크로리터의 anti-LC3 용액을 추가합니다. 주사기 바늘과 핀셋을 사용하여 각 커버 슬립을 1차 항체 방울 위에 놓고 세포 쪽이 용액과 접촉하도록 합니다. 멀티웰 플레이트를 습도 챔버에 놓습니다.호일로 덮고 냉장고에서 밤새 부화시킵니다. 다음날, 습도 챔버로부터 멀티웰 플레이트를 제거한다. 커버 슬립을 멀티웰 플레이트에 다시 놓고 PBS로 세 번 세척합니다.형광 표지 된 anti-rabbit을 차단 용액에 1 : 800의 비율로 희석하고 어둠 속에서 얼음 위에 보관하십시오. 멀티 웰 뚜껑을 밀봉 한 후 밀봉 필름 위에 커버 슬립 당 25 마이크로 리터의 토끼 방지 용액을 추가합니다. 그리고 이전에 입증된 바와 같이 커버 슬립을 2차 항체로 처리한다.그런 다음 빛으로부터 보호 된 실온에서 2 시간 동안 습도 챔버에서 플레이트를 배양하십시오. 항체와 함께 배양이 끝나면 PBS로 멀티웰 플레이트 상의 커버 슬립을 3회 세척합니다. 준비된 DAPI 용액으로 각 커버 슬립을 10분 동안 배양합니다.PBS로 세척한 후, 멀티웰 플레이트를 어둠 속에서 유지한다. 세포 몽타주를 위해 물과 종이 한 장으로 두 개의 비커를 준비하십시오. 슬라이드의 커버 슬립당 10마이크로리터의 PVA-DABCO 용액을 추가합니다.커버 슬립을 물로 씻은 다음 종이로 말리십시오. 마지막으로 PVA-DABCO 드롭 위에 놓습니다. 그리고 어둠 속에서 밤새 말리십시오.다음 날, 도립 컨포칼 현미경을 사용하여 라벨링된 세포를 시각화하고 이미지를 캡처합니다. 이미지를 캡처한 후 캡처된 채널이 포함된 각 이미지 파일을 피지 화면으로 끌어다 놓습니다. 대화 상자에서 확인을 클릭하여 이미지를 엽니다.그런 다음 열려 있는 콘솔 창을 닫습니다. Image(이미지) 탭에서 Color(색상)를 선택한 다음 Split Channels(채널 분할)를 선택합니다. LC3 이미지 이외의 채널에 해당하는 이미지를 닫습니다.그런 다음 Image(이미지) 탭에서 Adjust(조정)를 선택한 다음 Color Balance(색상 균형)를 선택합니다. 이미지가 포화될 때까지 최대 슬라이더를 왼쪽으로 이동하여 셀 윤곽을 시각화합니다. 자유형 선택 도구를 사용하여 셀 윤곽선을 그리고 [재설정]을 클릭하여 색상을 조정합니다.편집 탭에서 선택한 항목을 잘라내려면 잘라내기를 선택하고 이미지를 저장하지 않고 닫습니다. 그리고 편집 탭에서 붙여넣기를 선택합니다. 분석 메뉴에서 3D 개체 카운터 도구를 선택합니다.임계값을 2000으로 설정하고 크기 필터를 50에서 500으로 설정합니다. 개체 및 요약 상자가 표시되어 있는지 확인하고 로그 창 OK.In 클릭하면 개체 수가 감지된 개체로 설명됩니다. 면역형광은 LC3 단백질의 세포 분포를 나타내는 반면, DAPI는 췌장 세포에서 핵 국소화를 나타냈다.LC3 도트는 젬시타빈 처리 하에서 유의하게 증가하여 자가포식 활성을 나타냅니다. 과도한 합류 하에서, 외분비 췌장 세포는 쌓여서 서로 위로 자라는 경향이 있습니다. 파라포름알데히드 세포 고정 방법은 정확한 분포를 반영하지 않았기 때문에 LC3 단백질을 보존하는 데 효과적이지 않았습니다.파종 후 이틀을 기다리지 않고 고정 또는 처리를 수행하였을 때, PANC1 세포는 둥근 모양을 가졌다. 이 형태는 세포질과 핵 사이의 관계를 감소시켜 LC3의 세포 내 분포를 이해하기 어렵게 만듭니다. 불완전한 메탄올 고정은 적절한 LC3 면역 표지를 방해하여 이미지가 불분명하고 정량화가 최적화되지 않을 수 있습니다.이 과정에서 기억해야 할 가장 중요한 점은 파라 포름 알데히드 대신 차가운 메탄올에 6 분 동안 세포를 고정해야한다는 것입니다. 이 절차에 따라 LC3와 다른 단백질 간의 공동 국소화를 분석하여 LC3 기능과 관련된 다양한 분자 경로를 연구할 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Biology

Monitoring Dynamic Changes In Mitochondrial Calcium Levels During Apoptosis Using A Genetically Encoded Calcium Sensor

유전자 변형으로 인코딩된 칼슘 센서를 사용하여 Apoptosis 동안 Mitochondrial 칼슘 레벨에서 동적 변경 사항 모니터링

Dynamic changes in intracellular calcium concentration in response to various stimuli regulates many cellular processes such as proliferation, ...

연구

생물학

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the I&middot;Cryo Kit

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the IÃƒâ€šÃ‚Â·Cryo Kit

전 · Cryo 키트를 사용하여 마우스 정자 Cryopreservation 및 복구

Thousands of new genetically modified (GM) strains of mice have been created since the advent of transgenesis and knockout technologies.  Many of these ...

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

포유 동물 세포에서 헴 합성 레벨 측정

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

Quantitative Immunofluorescence Assay to Measure the Variation in Protein Levels at Centrosomes

정량 면역 형광 분석은 중심체에서 단백질 수준의 변화를 측정하기 위해

Centrosomes are small but important organelles that serve as the poles of mitotic spindle to maintain genomic integrity or assemble primary cilia to ...

Comparison of Three Different Methods for Determining Cell Proliferation in Breast Cancer Cell Lines

유방암 세포주에서 세포 증식을 결정하기위한 세 가지 방법 비교

Measuring cell proliferation can be performed by a number of different methods, each with varying levels of sensitivity, reproducibility and compatibility ...

Activating Autophagy by Aerobic Exercise in Mice

마우스에 유산소 운동에 의해 자식 작용을 활성화

Autophagy is a lysosomal degradation pathway essential for cell homeostasis, function and differentiation. Under stress conditions, autophagy is induced ...

Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing

2단계 PCR 및 차세대 16S rRNA 유전자 시퀀싱을 사용한 미생물 분석

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the ...

Functional Assessment of Kinesin-7 CENP-E in Spermatocytes Using In Vivo Inhibition, Immunofluorescence and Flow Cytometry

Functional Assessment of Kinesin-7 CENP-E in Spermatocytes Using In Vivo Inhibition, Immunofluorescence and Flow Cytometry

In Vivo Inhibition, Immunofluorescence 및 Flow Cytometry를 이용한 정자 세포 내 Kinesin-7 CENP-E의 기능 평가

In eukaryotes, meiosis is essential for genome stability and genetic diversity in sexual reproduction. Experimental analyses of spermatocytes in testes ...

Analyzing Starvation-Induced Autophagy in the Drosophila melanogaster Larval Fat Body

Analyzing Starvation-Induced Autophagy in the Drosophila melanogaster Larval Fat Body

Drosophila melanogaster 유충 지방체에서 기아로 인한 자가포식 분석

Autophagy is a cellular self-digestion process. It delivers cargo to the lysosomes for degradation in response to various stresses, including starvation. ...

Ultrastructural Localization of Endogenous LC3 by On-Section Correlative Light-Electron Microscopy

On-Section Correlative Light-Electron Microscopy를 통한 내인성 LC3의 초구조적 국소화

The visualization of autophagic organelles at the ultrastructural level by electron microscopy (EM) is essential to establish their identity and reveal ...