Name: evaluating autophagy levels in two different pancreatic cell models using lc3 immunofluorescence
Uploaded: 2023-04-28T13:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluating Autophagy Levels in Two Different Pancreatic Cell Models Using LC3 Immunofluorescence at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra Universitetet i Buenos Aires (UBACyT 2018-2020 20020170100082BA), Nasjonalt råd for vitenskapelig forskning og teknologi (CONICET) (PIP 2021-2023 GI− 11220200101549CO; og PUE 22920170100033) og National Agency for Scientific and Technological Promotion (PICT 2019-01664).

1. Cell forberedelse
<ol><li>Bløtlegg 12 mm runde deksler i absolutt etanol, og plasser dem vertikalt i brønnene på en 24-brønnsplate.</li>
	<li>Fjern dekselet, og utsett flerbrønnsplaten for ultrafiolett stråling i 15 minutter.</li>
	<li>Plasser dekslene horisontalt, og vask dem med Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM).</li>
	<li>Frø et lavt passasje antall bukspyttkjertelceller. Mengden bør justeres for å oppnå 50% -75% sammenløp på fikseringsdagen16. MERK: De...

<ol>
	<li>Grasso, D., Renna, F. J., Vaccaro, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initial+steps+in+mammalian+autophagosome+biogenesis.">Initial steps in mammalian autophagosome biogenesis.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 146 (2018).</li><li>Galluzzi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+definitions+of+autophagy+and+related+processes.">Molecular definitions of autophagy and related processes.</a> EMBO Journal. 36 (13), 1811-1836 (2017).</li><li>Kitada, M., Koya, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+in+metabolic+disease+and+ageing.">Autophagy in metabolic disease and ageing.</a> Nature Reviews Endocrinology. 17 (11), 647-661 (2021).</li><li>Ktistakis, N. T., Tooze, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digesting+the+expanding+mechanisms+of+autophagy.">Digesting the expanding mechanisms of autophagy.</a> Trends in Cell Biology. 26 (8), 624-635 (2016).</li><li>Tanida, I., Ueno, T., Kominami, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LC3+and+autophagy.">LC3 and autophagy.</a> Methods in Molecular Biology. 445, 77-88 (2008).</li><li>Kabeya, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LC3,+a+mammalian+homologue+of+yeast+Apg8p,+is+localized+in+autophagosome+membranes+after+processing.">LC3, a mammalian homologue of yeast Apg8p, is localized in autophagosome membranes after processing.</a> EMBO Journal. 19 (21), 5720-5728 (2000).</li><li>Mizushima, N., Yoshimori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+interpret+LC3+immunoblotting.">How to interpret LC3 immunoblotting.</a> Autophagy. 3 (6), 542-545 (2007).</li><li>Vanasco, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dynamics+and+VMP1-related+selective+mitophagy+in+experimental+acute+pancreatitis.">Mitochondrial dynamics and VMP1-related selective mitophagy in experimental acute pancreatitis.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 640094 (2021).</li><li>Williams, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+mechanisms+in+pancreas+and+salivary+acini.">Regulatory mechanisms in pancreas and salivary acini.</a> Annual Review of Physiology. 46, 361-375 (1984).</li><li>Mizrahi, J. D., Surana, R., Valle, J. W., Shroff, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+cancer.">Pancreatic cancer.</a> Lancet. 395 (10242), 2008-2020 (2020).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+and+function+of+autophagy+in+pancreatic+cancer.">Regulation and function of autophagy in pancreatic cancer.</a> Autophagy. 17 (11), 3275-3296 (2021).</li><li>Ropolo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+E2F1-EP300-VMP1+pathway+mediates+gemcitabine-induced+autophagy+in+pancreatic+cancer+cells+carrying+oncogenic+KRAS.">A novel E2F1-EP300-VMP1 pathway mediates gemcitabine-induced autophagy in pancreatic cancer cells carrying oncogenic KRAS.</a> Frontiers in Endocrinology. 11, 411 (2020).</li><li>Pardo, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gemcitabine+induces+the+VMP1-mediated+autophagy+pathway+to+promote+apoptotic+death+in+human+pancreatic+cancer+cells.">Gemcitabine induces the VMP1-mediated autophagy pathway to promote apoptotic death in human pancreatic cancer cells.</a> Pancreatology. 10 (1), 19-26 (2010).</li><li>Logsdon, C. D., Moessner, J., Williams, J. A., Goldfine, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucocorticoids+increase+amylase+mRNA+levels,+secretory+organelles,+and+secretion+in+pancreatic+acinar+AR42J+cells.">Glucocorticoids increase amylase mRNA levels, secretory organelles, and secretion in pancreatic acinar AR42J cells.</a> Journal of Cell Biology. 100 (4), 1200-1208 (1985).</li><li>Klionsky, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+assays+for+monitoring+autophagy+(4th+edition).">Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (4th edition).</a> Autophagy. 17 (1), 1 (2021).</li><li>Segeritz, C. -. P., Vallier, L., Jalali, M., Saldanha, F. Y. L., Jalali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+9+-+Cell+culture:+Growing+cells+as+model+systems+in+vitro.">Chapter 9 - Cell culture: Growing cells as model systems in vitro.</a> Basic Science Methods for Clinical Researchers. , 151-172 (2017).</li><li>Elliott, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+microscopy:+Principles+and+modern+practices.">Confocal microscopy: Principles and modern practices.</a> Current Protocols in Cytometry. 92 (1), 68 (2020).</li><li>Grasso, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+novel+selective+autophagy+pathway+mediated+by+VMP1-USP9x-p62,+prevents+pancreatic+cell+death.">a novel selective autophagy pathway mediated by VMP1-USP9x-p62, prevents pancreatic cell death.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (10), 8308-8324 (2011).</li><li>Ropolo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pancreatitis-induced+vacuole+membrane+protein+1+triggers+autophagy+in+mammalian+cells.">The pancreatitis-induced vacuole membrane protein 1 triggers autophagy in mammalian cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 282 (51), 37124-37133 (2007).</li><li>Karanasios, E., Stapleton, E., Walker, S. A., Manifava, M., Ktistakis, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+imaging+of+early+autophagy+events:+Omegasomes+and+beyond.">Live cell imaging of early autophagy events: Omegasomes and beyond.</a> Journal of Visualized Experiments. (77), e50484 (2013).</li><li>Kuma, A., Matsui, M., Mizushima, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LC3,+an+autophagosome+marker,+can+be+incorporated+into+protein+aggregates+independent+of+autophagy:+caution+in+the+interpretation+of+LC3+localization.">LC3, an autophagosome marker, can be incorporated into protein aggregates independent of autophagy: caution in the interpretation of LC3 localization.</a> Autophagy. 3 (4), 323-328 (2007).</li><li>Zhang, Z., Singh, R., Aschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+the+detection+of+autophagy+in+mammalian+cells.">Methods for the detection of autophagy in mammalian cells.</a> Current Protocols in Toxicology. 69, 1-26 (2016).</li><li>Yoshii, S. R., Mizushima, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+and+measuring+autophagy.">Monitoring and measuring autophagy.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (9), 1865 (2017).</li><li>Betriu, N., Andreeva, A., Semino, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erlotinib+promotes+ligand-induced+EGFR+degradation+in+3D+but+not+2D+cultures+of+pancreatic+ductal+adenocarcinoma+cells.">Erlotinib promotes ligand-induced EGFR degradation in 3D but not 2D cultures of pancreatic ductal adenocarcinoma cells.</a> Cancers. 13 (18), 4504 (2021).</li><li>Wang, W., Dong, L., Zhao, B., Lu, J., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E-cadherin+is+downregulated+by+microenvironmental+changes+in+pancreatic+cancer+and+induces+EMT.">E-cadherin is downregulated by microenvironmental changes in pancreatic cancer and induces EMT.</a> Oncology Reports. 40 (3), 1641-1649 (2018).</li><li>Kim, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+heterogeneity+and+plasticity+of+cancer+cell+migration+in+a+pancreatic+tumor+three-dimensional+culture+model.">Phenotypic heterogeneity and plasticity of cancer cell migration in a pancreatic tumor three-dimensional culture model.</a> Cancers. 12 (5), 1305 (2020).</li><li>Meng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+EpCAM+over-expression+is+associated+with+favorable+clinical+outcomes+in+pancreatic+cancer+patients+with+Hepatitis+B+virus+negative+infection.">Cytoplasmic EpCAM over-expression is associated with favorable clinical outcomes in pancreatic cancer patients with Hepatitis B virus negative infection.</a> International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 8 (12), 22204-22216 (2015).</li><li>Brock, R., Hamelers, I. H., Jovin, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+fixation+protocols+for+adherent+cultured+cells+applied+to+a+GFP+fusion+protein+of+the+epidermal+growth+factor+receptor.">Comparison of fixation protocols for adherent cultured cells applied to a GFP fusion protein of the epidermal growth factor receptor.</a> Cytometry. 35 (4), 353-362 (1999).</li></ol>

Metoden beskrevet i denne protokollen gjør det mulig å visualisere den endogene LC3-fordelingen i cellen og kvantifisere de autofagiske nivåene under forskjellige forhold. En annen lignende metode som brukes til å analysere LC3-fordelingen og bestemme autofagiaktivering, involverer fluorescensmerket LC3-transfeksjon (som RFP-LC3)19. RFP-LC3-transfeksjon har fordelene ved ikke å trenge fiksering (som gjør det mulig å anvende denne metoden i levende celleavbildning20),...

Makroautofagi (ofte referert til som autofagi) er en spesialisert katabolsk prosess som selektivt nedbryter cytoplasmatiske komponenter, inkludert proteiner og skadede organeller 1,2. Autofagi gjør det mulig for celler å fysiologisk reagere på stressstimuli og dermed opprettholde cellulær homeostase3. Under autofagi dannes en dobbel membranvesikkel: autofagosomet. Autofagosomet inneholder lastmolekylene og driver dem til lysosomet for nedbrytning 1,4.
Autofagosomer er dekorert av den autofagiske proteinmikrotubuli-assosierte proteinlyskjeden 3 (LC3)5. Når autofagi ikke induseres, diffunderes LC3 i cytoplasma og kjernen i LC3-I-konformasjonen. På den annen side, når autofagi induseres, konjugeres LC3 med et fosfatidyletanolamin i membranen til de autofagiske strukturer6. Denne nye LC3-konformasjonen er kjent som LC3-II1. LC3-konformasjonsskiftet forårsaker endringer i cellulær lokalisering og dets dodecylnatriumsulfat-polyakrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) migrasjon, som kan detekteres ved teknikker som immunfluorescens og vestlig blot 5,7. På denne måten er LC3-konjugering en nøkkelhendelse i autofagisk prosess som kan brukes til å måle autofagisk aktivitet.
Acinarcellen i bukspyttkjertelen er en svært differensiert celle som under sunne forhold har lav autofagi. Men under forskjellige fysiologiske forhold eller under farmakologisk stimulering kan de aktivere autofagi. Derfor er bestemmelsen av autofagiske nivåer i denne cellelinjen nyttig for å studere potensielle direkte eller indirekte effekter av forskjellige farmakologiske eller biologiske agenser på autofagi 8,9.
Duktalt adenokarsinom i bukspyttkjertelen er en av de dødeligste krefttypene, gitt sin sene diagnose og dens høye kjemoterapiresistens10. Kreftceller i bukspyttkjertelen har høy autofagiaktivitet på grunn av transkripsjonell oppregulering og posttranslasjonell aktivering av autofagirelaterte proteiner11. Kreftceller i bukspyttkjertelen kan justere autofaginivåene sine som respons på ugunstige forhold som hypoksi, næringsmangel eller kjemoterapi-indusert skade11. Derfor kan analyse av autofaginivåene i kreftceller i bukspyttkjertelen bidra til å forstå hvordan de tilpasser seg varierende miljøer og evaluere effektiviteten av autofagimodulerende behandlinger.
Denne studien viser en metode for å utføre LC3-immunfluorescens i to forskjellige pankreascellulære modeller. Den første modellen, PANC-1-celler, fungerte som en modell for bukspyttkjertelduktalt adenokarsinom. Disse cellene ble behandlet med gemcitabin, et kjemoterapimiddel som tidligere har vist seg å indusere autofagi, spesielt i kreftceller i bukspyttkjertelen som bærer det onkogene Kirsten-rottesarkomvirusgenet (KRAS)12,13. Den andre modellen, AR42J-celler, fungerte som en mer fysiologisk modell av eksokrine bukspyttkjertelceller. Disse cellene ble differensiert med deksametason for å bli mer lik acinare pankreasceller14. I disse cellene ble autofagi farmakologisk indusert ved bruk av PP242, som er en potent mTOR-hemmer15. I denne studien demonstrerer vi anvendeligheten av protokollen beskrevet med to forskjellige bukspyttkjertelmodeller og dens evne til å diskriminere mellom tilstander med lav og høy autofagi.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10x Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>46-013-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 mm round coverslips</td>
			<td>HDA</td>
			<td>CBR_OBJ_6467</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 Well- Cell Culture Plate</td>
			<td>Sorfa</td>
			<td>220300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute ethanol</td>
			<td>Biopack</td>
			<td>2207.10.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 Donkey anti-rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R37119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Laser Scanning Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM 800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>62248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D4902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEN</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>01-052-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>NATOCOR&#160;</td>
			<td>Lintc-634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gemcitabina</td>
			<td>Eli Lilly</td>
			<td>VL7502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC3B (D11) XP Rabbit mAb</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>3868S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Anedra</td>
			<td>6197</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm &#34;M&#34; (Laboratory Sealing Film)</td>
			<td>Bemis/Curwood</td>
			<td>PM-996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Strep Solution</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>03-031-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PP242</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>SC-301606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11570626</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluating autophagy levels in two different pancreatic cell models using lc3 immunofluorescence

Autofagi er en spesialisert katabolsk prosess som selektivt nedbryter cytoplasmatiske komponenter, inkludert proteiner og skadede organeller. Autofagi gjør det mulig for celler å fysiologisk reagere på stressstimuli og dermed opprettholde cellulær homeostase. Kreftceller kan modulere autofaginivåene sine for å tilpasse seg ugunstige tilstander som hypoksi, næringsmangel eller skade forårsaket av kjemoterapi. Ductal pankreas adenokarsinom er en av de dødeligste typer kreft. Kreftceller i bukspyttkjertelen har høy autofagiaktivitet på grunn av transkripsjonell oppregulering og posttranslasjonell aktivering av autofagiproteiner.
Her ble PANC-1-cellelinjen brukt som en modell av kreftceller i bukspyttkjertelen, og AR42J pankreatisk acinarcelle cellelinje ble brukt som en fysiologisk modell av høyt differensierte pattedyrceller. Denne studien brukte immunfluorescens av mikrotubuli-assosiert proteinlyskjede 3 (LC3) som en indikator på status for autofagiaktivering. LC3 er et autofagiprotein som i basalforhold viser et diffust distribusjonsmønster i cytoplasma (kjent som LC3-I i denne tilstanden). Autofagi-induksjon utløser konjugering av LC3 til fosfatidyletanolamin på overflaten av nydannede autofagosomer for å danne LC3-II, et membranbundet protein som hjelper til med dannelse og utvidelse av autofagosomer. For å kvantifisere antall merkede autofagiske strukturer ble åpen kildekode-programvaren FIJI brukt ved hjelp av verktøyet "3D Objects Counter".
Målingen av autofagiske nivåer både i fysiologiske forhold og i kreftceller tillater oss å studere modulering av autofagi under ulike forhold som hypoksi, kjemoterapibehandling eller knockdown av visse proteiner.

Denne protokollen utfører immunfluorescens av LC3 i bukspyttkjertelcellelinjer for å bestemme autofaginivåene under forskjellige forhold. Resultatet av dette eksperimentet var obtention av cellulære bilder fra de røde og blå kanalene, tilsvarende LC3 og DAPI. LC3-bildene indikerer den cellulære fordelingen av dette proteinet, mens DAPI viser den nukleære lokaliseringen. Figur 2A viser et representativt bilde av immunfluorescensen av LC3 og dens sammenslåing med DAPI-farging i PANC-1...

Watch this Scientific Journal Video about Evaluating Autophagy Levels in Two Different Pancreatic Cell Models Using LC3 Immunofluorescence at JoVE.com

Evaluating Autophagy Levels in Two Different Pancreatic Cell Models Using LC3 Immunofluorescence

Målet med denne protokollen er å bestemme autofagiske nivåer i kreft i bukspyttkjertelen og akinarceller i bukspyttkjertelen gjennom LC3-immunfluorescens og LC3-punktkvantifisering.

Evaluering av autofaginivåer i to forskjellige bukspyttkjertelcellemodeller ved bruk av LC3-immunfluorescens

Autophagy is a specialized catabolic process that selectively degrades cytoplasmic components, including proteins and damaged organelles. Autophagy allows ...

LC3-immunfluorescensen muliggjør bestemmelse av autofaginivåer i bukspyttkjertelceller. Det tillater studier av potensielle effekter av forskjellige midler på autofagi i bukspyttkjertelceller. Immunfluorescens er en teknikk som brukes til å oppdage endogent LC3-protein, som unngår problemer forårsaket av overuttrykkende LC3, for eksempel dannelse av proteinaggregater som ikke er relatert til autofagi.Demonstrere prosedyren vil være Felipe Renna, en doktorgradsstudent, og Malena Herrera Lopez, en doktorgradsstudent fra laboratoriet til Maria Ines Vaccaro. For å starte cellepreparasjon, suge 12 millimeter runde deksel slips i absolutt etanol. Etter å ha fjernet dekselet, plasser det gjennomvåt dekselet vertikalt i 24-brønnplaten.Utsett flerbrønnsplaten for ultrafiolett stråling i 15 minutter. Plasser deretter dekselet horisontalt og vask det med DMEM. Se nå det lave passasjenummeret av bukspyttkjertelceller, suspendert i DMEM, som inneholder 10% FBS, penicillin og streptomycin, og inkuber cellene i to dager.To dager etter cellesåing, klargjør gemcitabinoppløsning i DMEM ved en mikrogram per mikroliter konsentrasjon. Aspirer deretter halvparten av volumet fra hver brønn i et separat rør, og tilsett passende mengde gemcitabinoppløsning. Returner halvvolumet tilsvarende hver brønn tilbake i de behandlede brønnene, og inkuber cellene i 24 timer.For å fikse og permeabilisere cellene, tilsett kald metanol i en 24-brønnplate som inneholder celler. Forbered også en seks-brønns plate med kald PBS. Bruk en sprøytenål og pinsett, ta hvert deksel og vask det to ganger i PBS.Inkuber deretter i metanol i seks minutter. Etter vask to ganger med PBS, inkuber dekselet glir i en blokkerende løsning i en time. Legg til en anti LC3 i blokkeringsløsningen i forholdet en til 1000, og vedlikehold på is.Legg et stykke laboratorieforseglingsfilm over flerbrønnslokket, og tilsett 25 mikroliter anti-LC3-løsning per dekselslipp over tetningsfilmen. Bruk en sprøytenål og pinsett, plasser hver dekselglid over den primære antistoffdråpen, og sørg for at cellesiden er i kontakt med løsningen. Plasser flerbrønnsplaten i fuktighetskammeret.Dekk det med folie og rug over natten i kjøleskapet. Neste dag, fjern multibrønnplaten fra fuktighetskammeret. Plasser dekselet tilbake på flerbrønnsplaten og vask dem med PBS tre ganger.Fortynn fluorescerende merket antikanin i blokkeringsløsning i forholdet mellom en og 800, og hold på is i mørket. Etter forsegling av flerbrønnslokket, tilsett 25 mikroliter antikaninoppløsning per deksel over tetningsfilmen. Og behandle dekselet med et sekundært antistoff som tidligere demonstrert.Inkuber deretter platen i fuktighetskammeret i to timer ved romtemperatur, beskyttet mot lys. På slutten av inkubasjon med antistoff, vask dekselet på flerbrønnsplaten med PBS tre ganger. Inkuber hvert deksel med den forberedte DAPI-løsningen i 10 minutter.Når den er vasket med PBS, oppretthold multibrønnplaten i mørket. For cellemontasje, lag to beger med vann og et stykke papir. Tilsett 10 mikroliter PVA-DABCO-løsning per deksel på et lysbilde.Vask dekselet i vann, og tørk det deretter på papir. Til slutt legger du den over PVA-DABCO-dråpen. Og tørt over natten i mørket.Neste dag, ved hjelp av et invertert konfokalmikroskop, visualiser de merkede cellene og ta bildene. Etter å ha tatt bilder, dra og slipp hver bildefil som inneholder de fangede kanalene på Fiji-skjermen. Klikk OK i dialogboksen for å åpne bildet.Lukk deretter det åpne konsollvinduet. Fra Bilde-fanen velger du Farge og deretter Delte kanaler. Lukk bildet som tilsvarer andre kanaler enn LC3-bildet.Velg deretter Juster i Bilde-fanen, etterfulgt av Fargebalanse. Flytt glidebryteren for maksimum til venstre til bildet metter for å visualisere cellekonturene. Bruk frihåndsmarkeringsverktøyet til å tegne celleomrisset, og klikk tilbakestill for å justere fargene.Hvis du vil klippe ut det valgte elementet fra Rediger-fanen, velger du Klipp ut og lukker bildet uten å lagre det. Og fra Rediger-fanen velger du lim inn. I Analyser-menyen velger du verktøyet Teller for 3D-objekter.Sett terskelen til 2000, og størrelsesfilteret til 50 til 500. Forsikre deg om at objektene og sammendragsboksene er merket, og klikk på OK.In loggvinduet, antall prikker vil bli beskrevet som objekter oppdaget. Immunfluorescensen indikerte den cellulære fordelingen av LC3-protein, mens DAPI viste nukleær lokalisering i bukspyttkjertelceller.LC3-prikkene økte signifikant under gemcitabinbehandling, noe som indikerer autofagisk aktivitet. Under en overdreven sammenløp har de eksokrine bukspyttkjertelcellene en tendens til å hope seg opp og vokse oppå hverandre. Paraformaldehydcellefikseringsmetoden var ineffektiv for å bevare LC3-proteiner, da den ikke reflekterte nøyaktig fordeling.Når fiksering eller behandling ble utført uten å vente to dager etter såing, hadde PANC1-cellene en rund form. Denne morfologien reduserte forholdet mellom cytoplasma og kjerne, noe som gjorde det vanskelig å forstå den intracellulære fordelingen av LC3. Ufullstendig metanolfiksering kan forstyrre riktig LC3-immunmerking, noe som fører til uklare bilder og suboptimal kvantifisering.Det viktigste å huske under denne prosedyren er at cellene må festes i kald metanol i seks minutter, i stedet for paraformaldehyd. Etter denne prosedyren kan kolokalisering mellom LC3 og andre proteiner analyseres, slik at studiet av forskjellige molekylære veier relatert til LC3-funksjoner.

Research

JoVE Journal

Biology

Monitoring Dynamic Changes In Mitochondrial Calcium Levels During Apoptosis Using A Genetically Encoded Calcium Sensor

Dynamic changes in intracellular calcium concentration in response to various stimuli regulates many cellular processes such as proliferation, ...

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the I&middot;Cryo Kit

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the IÃƒâ€šÃ‚Â·Cryo Kit

Mus Sperm Kryokonservering og Recovery bruke I · Cryo Kit

Thousands of new genetically modified (GM) strains of mice have been created since the advent of transgenesis and knockout technologies.  Many of these ...

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Måling av Heme Synthesis Levels i pattedyrceller

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

Quantitative Immunofluorescence Assay to Measure the Variation in Protein Levels at Centrosomes

Kvantitativ Immunfluorescens analysen Mål Variasjon i protein nivåer på Centrosomes

Centrosomes are small but important organelles that serve as the poles of mitotic spindle to maintain genomic integrity or assemble primary cilia to ...

Comparison of Three Different Methods for Determining Cell Proliferation in Breast Cancer Cell Lines

Sammenligning av tre forskjellige metoder for bestemmelse Cell Proliferation i brystkreftcellelinjer

Measuring cell proliferation can be performed by a number of different methods, each with varying levels of sensitivity, reproducibility and compatibility ...

Activating Autophagy by Aerobic Exercise in Mice

Aktivering Autophagy av Aerobic Exercise i Mus

Autophagy is a lysosomal degradation pathway essential for cell homeostasis, function and differentiation. Under stress conditions, autophagy is induced ...

Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing

Bakterieflora analyse ved hjelp av to-trinns PCR og neste generasjons 16S rRNA Gene sekvensering

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the ...

Functional Assessment of Kinesin-7 CENP-E in Spermatocytes Using In Vivo Inhibition, Immunofluorescence and Flow Cytometry

Functional Assessment of Kinesin-7 CENP-E in Spermatocytes Using In Vivo Inhibition, Immunofluorescence and Flow Cytometry

Funksjonsvurdering av kinesin-7 CENP-E i spermatocytter ved bruk av in vivo hemming, immunfluorescens og flowcytometri

In eukaryotes, meiosis is essential for genome stability and genetic diversity in sexual reproduction. Experimental analyses of spermatocytes in testes ...

Analyzing Starvation-Induced Autophagy in the Drosophila melanogaster Larval Fat Body

Analyzing Starvation-Induced Autophagy in the Drosophila melanogaster Larval Fat Body

Analyse av sultindusert autofagi i Drosophila melanogaster larvefettlegeme

Autophagy is a cellular self-digestion process. It delivers cargo to the lysosomes for degradation in response to various stresses, including starvation. ...

Ultrastructural Localization of Endogenous LC3 by On-Section Correlative Light-Electron Microscopy

Ultrastrukturell lokalisering av endogen LC3 ved korrelativ lyselektronmikroskopi på snittet

The visualization of autophagic organelles at the ultrastructural level by electron microscopy (EM) is essential to establish their identity and reveal ...