Name: evaluating autophagy levels in two different pancreatic cell models using lc3 immunofluorescence
Uploaded: 2023-04-28T13:40:00
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Este trabalho foi apoiado por bolsas da Universidade de Buenos Aires (UBACyT 2018-2020 20020170100082BA), do Conselho Nacional de Pesquisa Científica e Tecnologia (CONICET) (PIP 2021-2023 GI− 11220200101549CO; e PUE 22920170100033) e da Agência Nacional de Promoção Científica e Tecnológica (PICT 2019-01664).

1. Preparação celular
<ol><li>Mergulhe as tampas redondas de 12 mm em etanol absoluto e coloque-as verticalmente nos poços de uma placa de 24 poços.</li>
	<li>Retire a tampa e exponha a placa de poço múltiplo à radiação ultravioleta por 15 min.</li>
	<li>Posicione as tampas horizontalmente e lave-as com o DMEM (Modified Eagle Medium) da Dulbecco.</li>
	<li>Semear um baixo número de passagem de células pancreáticas. O valor deve ser ajustado para se obter 50%-75% de confluência no dia da fi...

<ol>
	<li>Grasso, D., Renna, F. J., Vaccaro, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initial+steps+in+mammalian+autophagosome+biogenesis.">Initial steps in mammalian autophagosome biogenesis.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 146 (2018).</li><li>Galluzzi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+definitions+of+autophagy+and+related+processes.">Molecular definitions of autophagy and related processes.</a> EMBO Journal. 36 (13), 1811-1836 (2017).</li><li>Kitada, M., Koya, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+in+metabolic+disease+and+ageing.">Autophagy in metabolic disease and ageing.</a> Nature Reviews Endocrinology. 17 (11), 647-661 (2021).</li><li>Ktistakis, N. T., Tooze, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digesting+the+expanding+mechanisms+of+autophagy.">Digesting the expanding mechanisms of autophagy.</a> Trends in Cell Biology. 26 (8), 624-635 (2016).</li><li>Tanida, I., Ueno, T., Kominami, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LC3+and+autophagy.">LC3 and autophagy.</a> Methods in Molecular Biology. 445, 77-88 (2008).</li><li>Kabeya, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LC3,+a+mammalian+homologue+of+yeast+Apg8p,+is+localized+in+autophagosome+membranes+after+processing.">LC3, a mammalian homologue of yeast Apg8p, is localized in autophagosome membranes after processing.</a> EMBO Journal. 19 (21), 5720-5728 (2000).</li><li>Mizushima, N., Yoshimori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+interpret+LC3+immunoblotting.">How to interpret LC3 immunoblotting.</a> Autophagy. 3 (6), 542-545 (2007).</li><li>Vanasco, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dynamics+and+VMP1-related+selective+mitophagy+in+experimental+acute+pancreatitis.">Mitochondrial dynamics and VMP1-related selective mitophagy in experimental acute pancreatitis.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 640094 (2021).</li><li>Williams, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+mechanisms+in+pancreas+and+salivary+acini.">Regulatory mechanisms in pancreas and salivary acini.</a> Annual Review of Physiology. 46, 361-375 (1984).</li><li>Mizrahi, J. D., Surana, R., Valle, J. W., Shroff, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+cancer.">Pancreatic cancer.</a> Lancet. 395 (10242), 2008-2020 (2020).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+and+function+of+autophagy+in+pancreatic+cancer.">Regulation and function of autophagy in pancreatic cancer.</a> Autophagy. 17 (11), 3275-3296 (2021).</li><li>Ropolo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+E2F1-EP300-VMP1+pathway+mediates+gemcitabine-induced+autophagy+in+pancreatic+cancer+cells+carrying+oncogenic+KRAS.">A novel E2F1-EP300-VMP1 pathway mediates gemcitabine-induced autophagy in pancreatic cancer cells carrying oncogenic KRAS.</a> Frontiers in Endocrinology. 11, 411 (2020).</li><li>Pardo, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gemcitabine+induces+the+VMP1-mediated+autophagy+pathway+to+promote+apoptotic+death+in+human+pancreatic+cancer+cells.">Gemcitabine induces the VMP1-mediated autophagy pathway to promote apoptotic death in human pancreatic cancer cells.</a> Pancreatology. 10 (1), 19-26 (2010).</li><li>Logsdon, C. D., Moessner, J., Williams, J. A., Goldfine, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucocorticoids+increase+amylase+mRNA+levels,+secretory+organelles,+and+secretion+in+pancreatic+acinar+AR42J+cells.">Glucocorticoids increase amylase mRNA levels, secretory organelles, and secretion in pancreatic acinar AR42J cells.</a> Journal of Cell Biology. 100 (4), 1200-1208 (1985).</li><li>Klionsky, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+assays+for+monitoring+autophagy+(4th+edition).">Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (4th edition).</a> Autophagy. 17 (1), 1 (2021).</li><li>Segeritz, C. -. P., Vallier, L., Jalali, M., Saldanha, F. Y. L., Jalali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+9+-+Cell+culture:+Growing+cells+as+model+systems+in+vitro.">Chapter 9 - Cell culture: Growing cells as model systems in vitro.</a> Basic Science Methods for Clinical Researchers. , 151-172 (2017).</li><li>Elliott, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+microscopy:+Principles+and+modern+practices.">Confocal microscopy: Principles and modern practices.</a> Current Protocols in Cytometry. 92 (1), 68 (2020).</li><li>Grasso, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+novel+selective+autophagy+pathway+mediated+by+VMP1-USP9x-p62,+prevents+pancreatic+cell+death.">a novel selective autophagy pathway mediated by VMP1-USP9x-p62, prevents pancreatic cell death.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (10), 8308-8324 (2011).</li><li>Ropolo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pancreatitis-induced+vacuole+membrane+protein+1+triggers+autophagy+in+mammalian+cells.">The pancreatitis-induced vacuole membrane protein 1 triggers autophagy in mammalian cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 282 (51), 37124-37133 (2007).</li><li>Karanasios, E., Stapleton, E., Walker, S. A., Manifava, M., Ktistakis, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+imaging+of+early+autophagy+events:+Omegasomes+and+beyond.">Live cell imaging of early autophagy events: Omegasomes and beyond.</a> Journal of Visualized Experiments. (77), e50484 (2013).</li><li>Kuma, A., Matsui, M., Mizushima, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LC3,+an+autophagosome+marker,+can+be+incorporated+into+protein+aggregates+independent+of+autophagy:+caution+in+the+interpretation+of+LC3+localization.">LC3, an autophagosome marker, can be incorporated into protein aggregates independent of autophagy: caution in the interpretation of LC3 localization.</a> Autophagy. 3 (4), 323-328 (2007).</li><li>Zhang, Z., Singh, R., Aschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+the+detection+of+autophagy+in+mammalian+cells.">Methods for the detection of autophagy in mammalian cells.</a> Current Protocols in Toxicology. 69, 1-26 (2016).</li><li>Yoshii, S. R., Mizushima, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+and+measuring+autophagy.">Monitoring and measuring autophagy.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (9), 1865 (2017).</li><li>Betriu, N., Andreeva, A., Semino, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erlotinib+promotes+ligand-induced+EGFR+degradation+in+3D+but+not+2D+cultures+of+pancreatic+ductal+adenocarcinoma+cells.">Erlotinib promotes ligand-induced EGFR degradation in 3D but not 2D cultures of pancreatic ductal adenocarcinoma cells.</a> Cancers. 13 (18), 4504 (2021).</li><li>Wang, W., Dong, L., Zhao, B., Lu, J., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E-cadherin+is+downregulated+by+microenvironmental+changes+in+pancreatic+cancer+and+induces+EMT.">E-cadherin is downregulated by microenvironmental changes in pancreatic cancer and induces EMT.</a> Oncology Reports. 40 (3), 1641-1649 (2018).</li><li>Kim, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+heterogeneity+and+plasticity+of+cancer+cell+migration+in+a+pancreatic+tumor+three-dimensional+culture+model.">Phenotypic heterogeneity and plasticity of cancer cell migration in a pancreatic tumor three-dimensional culture model.</a> Cancers. 12 (5), 1305 (2020).</li><li>Meng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+EpCAM+over-expression+is+associated+with+favorable+clinical+outcomes+in+pancreatic+cancer+patients+with+Hepatitis+B+virus+negative+infection.">Cytoplasmic EpCAM over-expression is associated with favorable clinical outcomes in pancreatic cancer patients with Hepatitis B virus negative infection.</a> International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 8 (12), 22204-22216 (2015).</li><li>Brock, R., Hamelers, I. H., Jovin, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+fixation+protocols+for+adherent+cultured+cells+applied+to+a+GFP+fusion+protein+of+the+epidermal+growth+factor+receptor.">Comparison of fixation protocols for adherent cultured cells applied to a GFP fusion protein of the epidermal growth factor receptor.</a> Cytometry. 35 (4), 353-362 (1999).</li></ol>

O método descrito neste protocolo permite visualizar a distribuição endógena da CL3 na célula e quantificar os níveis autofágicos sob diferentes condições. Outro método semelhante utilizado para analisar a distribuição da CL3 e determinar a ativação da autofagia envolve a transfecção de LC3 marcada com fluorescência (como RFP-LC3)19. A transfecção RFP-LC3 tem as vantagens de não necessitar de fixação (o que permite a aplicação deste método em imagens de células<sup class=...

A macroautofagia (comumente referida como autofagia) é um processo catabólico especializado que degrada seletivamente componentes citoplasmáticos, incluindo proteínas e organelas danificadas 1,2. A autofagia permite que as células respondam fisiologicamente aos estímulos de estresse e, assim, mantenham a homeostase celular3. Durante a autofagia, uma dupla vesícula de membrana é formada: o autofagossomo. O autofagossomo contém as moléculas de carga e as conduz ao lisossomo para degradação 1,4.
Os autofagossomos são decorados pela proteína autofágica associada à proteína microtubular de cadeia leve 3 (CL3)5. Quando a autofagia não é induzida, a CL3 é difundida no citoplasma e no núcleo na conformação da LC3-I. Por outro lado, quando a autofagia é induzida, a CL3 é conjugada com uma fosfatidiletanolamina na membrana das estruturas autofágicas6. Essa nova conformação da LC3 é conhecida como LC3-II1. O desvio de conformação da CL3 provoca alterações em sua localização celular e sua migração por eletroforese em gel de dodecil sulfato de sódio e poliacrilamida (SDS-PAGE), que pode ser detectada por técnicas como imunofluorescência e western blot 5,7. Dessa forma, a conjugação da CL3 é um evento chave no processo autofágico que pode ser usado para medir a atividade autofágica.
A célula acinar pancreática é uma célula altamente diferenciada que, em condições saudáveis, apresenta baixa taxa de autofagia. Entretanto, em diferentes condições fisiológicas ou sob estimulação farmacológica, podem ativar a autofagia. Portanto, a determinação dos níveis autofágicos nessa linhagem celular é útil para estudar os potenciais efeitos diretos ou indiretos de diferentes agentes farmacológicos ou biológicos sobre aautofagia8,9.
O adenocarcinoma ductal de pâncreas é um dos tipos de câncer mais letais, dado seu diagnóstico tardio e sua alta resistência àquimioterapia10. As células cancerosas do pâncreas apresentam alta atividade autofágica devido à suprarregulação transcricional e ativação pós-traducional de proteínas relacionadas à autofagia11. As células do câncer de pâncreas podem ajustar seus níveis de autofagia em resposta a condições desfavoráveis como hipóxia, privação de nutrientes ou dano induzido por quimioterapia11. Assim, analisar os níveis de autofagia em células de câncer de pâncreas pode ajudar a entender como elas se adaptam a diferentes ambientes e avaliar a eficácia de tratamentos moduladores da autofagia.
Este estudo mostra um método para realizar a imunofluorescência CL3 em dois modelos celulares pancreáticos distintos. O primeiro modelo, células PANC-1, serviu de modelo para adenocarcinoma ductal pancreático. Essas células foram tratadas com gemcitabina, um agente quimioterápico que já demonstrou induzir autofagia, especificamente em células de câncer de pâncreas portadoras do gene oncogênico Kirsten rat sarcoma virus (KRAS)12,13. O segundo modelo, células AR42J, serviu como um modelo mais fisiológico de células pancreáticas exócrinas. Essas células foram diferenciadas com dexametasona para se tornarem mais semelhantes às células pancreáticas acinares14. Nessas células, a autofagia foi induzida farmacologicamente pelo uso da PP242, que é um potente inibidor da mTOR15. Neste estudo, demonstramos a aplicabilidade do protocolo descrito com dois modelos pancreáticos diferentes e sua capacidade de discriminar estados de baixa e alta autofagia.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10x Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>46-013-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 mm round coverslips</td>
			<td>HDA</td>
			<td>CBR_OBJ_6467</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 Well- Cell Culture Plate</td>
			<td>Sorfa</td>
			<td>220300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute ethanol</td>
			<td>Biopack</td>
			<td>2207.10.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 Donkey anti-rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R37119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Laser Scanning Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM 800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>62248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D4902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEN</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>01-052-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>NATOCOR&#160;</td>
			<td>Lintc-634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gemcitabina</td>
			<td>Eli Lilly</td>
			<td>VL7502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC3B (D11) XP Rabbit mAb</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>3868S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Anedra</td>
			<td>6197</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm &#34;M&#34; (Laboratory Sealing Film)</td>
			<td>Bemis/Curwood</td>
			<td>PM-996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Strep Solution</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>03-031-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PP242</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>SC-301606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11570626</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluating autophagy levels in two different pancreatic cell models using lc3 immunofluorescence

A autofagia é um processo catabólico especializado que degrada seletivamente componentes citoplasmáticos, incluindo proteínas e organelas danificadas. A autofagia permite que as células respondam fisiologicamente aos estímulos de estresse e, assim, mantenham a homeostase celular. As células cancerosas podem modular seus níveis de autofagia para se adaptar a condições adversas como hipóxia, deficiência de nutrientes ou danos causados pela quimioterapia. O adenocarcinoma ductal do pâncreas é um dos tipos mais mortais de câncer. As células cancerosas do pâncreas apresentam alta atividade autofágica devido à suprarregulação transcricional e ativação pós-traducional das proteínas autofágicas.
Aqui, a linhagem celular PANC-1 foi usada como modelo de células cancerosas humanas pancreáticas, e a linhagem celular acinar pancreática AR42J foi usada como modelo fisiológico de células de mamíferos altamente diferenciadas. Este estudo utilizou a imunofluorescência da proteína de cadeia leve 3 associada a microtúbulos (CL3) como um indicador do estado de ativação da autofagia. A LC3 é uma proteína autofágica que, em condições basais, apresenta um padrão difuso de distribuição no citoplasma (conhecido como CL3-I nessa condição). A indução da autofagia desencadeia a conjugação da LC3 à fosfatidiletanolamina na superfície dos autofagossomos recém-formados para formar a LC3-II, uma proteína ligada à membrana que auxilia na formação e expansão dos autofagossomos. Para quantificar o número de estruturas autofágicas marcadas, utilizou-se o software de código aberto FIJI com o auxílio da ferramenta "3D Objects Counter".
A medida dos níveis autofágicos tanto em condições fisiológicas quanto em células cancerosas permite estudar a modulação da autofagia sob diversas condições, como hipóxia, tratamento quimioterápico ou knockdown de certas proteínas.

Este protocolo realiza a imunofluorescência da CL3 em linhagens celulares pancreáticas para determinar os níveis de autofagia em diferentes condições. O resultado deste experimento foi a obtenção de imagens celulares dos canais vermelho e azul, correspondentes a CL3 e DAPI. As imagens de CL3 indicam a distribuição celular dessa proteína, enquanto o DAPI mostra a localização nuclear. A Figura 2A mostra uma imagem representativa da imunofluorescência da CL3 e sua fusão com a colo...

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Evaluating Autophagy Levels in Two Different Pancreatic Cell Models Using LC3 Immunofluorescence

O objetivo deste protocolo é determinar os níveis autofágicos em câncer de pâncreas e células acinares pancreáticas através da imunofluorescência da LC3 e quantificação do ponto da CL3.

Avaliação dos Níveis de Autofagia em Dois Diferentes Modelos de Células Pancreáticas Utilizando Imunofluorescência LC3

Autophagy is a specialized catabolic process that selectively degrades cytoplasmic components, including proteins and damaged organelles. Autophagy allows ...

A imunofluorescência da CL3 permite a determinação dos níveis de autofagia nas células pancreáticas. Permite o estudo dos potenciais efeitos de diferentes agentes sobre a autofagia das células pancreáticas. A imunofluorescência é uma técnica utilizada para detectar a proteína LC3 endógena, que evita problemas causados pela superexpressão da CL3, como a formação de agregados proteicos não relacionados à autofagia.Quem demonstrará o procedimento serão Felipe Renna, doutorando, e Malena Herrera Lopez, doutoranda do laboratório de Maria Inês Vaccaro. Para iniciar a preparação celular, mergulhe a tampa redonda de 12 milímetros em etanol absoluto. Depois de remover a tampa, coloque a tampa embebida verticalmente na placa de 24 poços.Expor a placa multipoço à radiação ultravioleta por 15 minutos. Em seguida, posicione a tampa na horizontal e lave-a com DMEM. Agora veja o baixo número de passagem de células pancreáticas, ressuspensas em DMEM, contendo 10% FBS, penicilina e estreptomicina, e incube as células por dois dias.Dois dias após a semeadura celular, preparar solução de gemcitabina em DMEM na concentração de um micrograma por microlitro. Em seguida, aspirar metade do volume de cada poço em um tubo separado e adicionar a quantidade adequada de solução de gemcitabina. Devolver o meio volume correspondente a cada poço de volta aos poços tratados e incubar as células por 24 horas.Para fixar e permeabilizar as células, adicione metanol frio em uma placa de 24 poços contendo células. Prepare também um prato de seis poços com PBS frio. Usando uma agulha de seringa e uma pinça, pegue cada tampa e lave-a duas vezes em PBS.Em seguida, incube em metanol por seis minutos. Depois de lavar duas vezes com PBS, incube as lamínulas de tampa em uma solução de bloqueio por uma hora. Adicione um anti LC3 na solução de bloqueio na proporção de um para 1000 e mantenha no gelo.Coloque um pedaço de filme de vedação de laboratório sobre a tampa de vários poços e adicione 25 microlitros de solução anti-LC3 por deslizamento de tampa sobre a película de vedação. Usando uma agulha de seringa e uma pinça, coloque cada tampa deslizante sobre a gota primária de anticorpos, garantindo que o lado celular esteja em contato com a solução. Coloque a placa de vários poços na câmara de umidade.Cubra com papel alumínio e incube durante a noite na geladeira. No dia seguinte, remova a placa de poço múltiplo da câmara de umidade. Coloque as tampas de volta na placa de vários poços e lave-as com PBS três vezes.Diluir o anticoelho fluorescente marcado em solução de bloqueio na proporção de um para 800 e manter o gelo no escuro. Depois de selar a tampa de vários poços, adicione 25 microlitros de solução anti-coelho por deslizamento da tampa sobre a película de vedação. E tratar a tampa com um anticorpo secundário, como demonstrado anteriormente.Em seguida, incube a placa na câmara de umidade por duas horas à temperatura ambiente, protegida da luz. Ao final da incubação com anticorpo, lave as lamínulas da tampa na placa de poço múltiplo com PBS três vezes. Incubar cada lamínula de cobertura com a solução DAPI preparada durante 10 minutos.Depois de lavada com PBS, mantenha a placa de poço múltiplo no escuro. Para a montagem celular, prepare dois copos com água e um pedaço de papel. Adicione 10 microlitros de solução de PVA-DABCO por lamínula em uma lâmina.Lave a tampa em água e depois seque em papel. Por fim, coloque-o sobre a gota PVA-DABCO. E secar durante a noite no escuro.No dia seguinte, utilizando microscópio confocal invertido, visualize as células marcadas e capture as imagens. Depois de capturar imagens, arraste e solte cada arquivo de imagem contendo os canais capturados na tela de Fiji. Na caixa de diálogo, clique em OK para abrir a imagem.Em seguida, feche a janela do console aberta. Na guia Imagem, selecione Cor e Canais Divididos. Feche a imagem correspondente aos canais diferentes da imagem LC3.Em seguida, na guia Imagem, selecione Ajustar, seguido de Equilíbrio de Cores. Mova o controle deslizante máximo para a esquerda até que a imagem satura para visualizar os contornos da célula. Use a ferramenta de seleção à mão livre para desenhar o contorno da célula e clique em redefinir para ajustar as cores.Para cortar o item selecionado na guia Editar, selecione Recortar e feche a imagem sem salvá-la. E na guia Editar, selecione colar. No menu Analisar, escolha a ferramenta Contador de objetos 3D.Defina o limite em 2000 e o filtro de tamanho em 50 a 500. Verifique se os objetos e as caixas de resumo estão marcados e clique em OK.In janela de log, o número de pontos será descrito como objetos detectados. A imunofluorescência indicou a distribuição celular da proteína LC3, enquanto o DAPI mostrou localização nuclear nas células pancreáticas.Os pontos da CL3 aumentaram significativamente sob o tratamento com gencitabina, indicando atividade autofágica. Sob uma confluência excessiva, as células exócrinas do pâncreas tendem a se acumular e crescer umas sobre as outras. O método de fixação celular com paraformaldeído foi ineficaz para preservar as proteínas LC3, pois não refletiu distribuição precisa.Quando a fixação ou o tratamento foram realizados sem esperar dois dias após a semeadura, as células PANC1 apresentaram forma arredondada. Essa morfologia diminuiu a relação entre o citoplasma e o núcleo, dificultando o entendimento da distribuição intracelular da CL3. A fixação incompleta de metanol pode interferir na marcação imunológica adequada da LC3, levando a imagens pouco claras e quantificação subótima.A coisa mais importante a lembrar durante este procedimento é que as células devem ser fixadas em metanol frio por seis minutos, em vez de paraformaldeído. Após este procedimento, a colocalização entre a LC3 e outras proteínas pode ser analisada, permitindo o estudo de diferentes vias moleculares relacionadas às funções da LC3.

Research

JoVE Journal

Biology

Monitoring Dynamic Changes In Mitochondrial Calcium Levels During Apoptosis Using A Genetically Encoded Calcium Sensor

Mudanças Dinâmicas de monitoramento dos níveis de cálcio mitocondrial durante a apoptose através de um sensor de cálcio geneticamente codificado

Dynamic changes in intracellular calcium concentration in response to various stimuli regulates many cellular processes such as proliferation, ...

Biologia

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the I&middot;Cryo Kit

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the IÃƒâ€šÃ‚Â·Cryo Kit

Criopreservação do mouse Sperm and Recovery utilizando o I · Cryo Kit

Thousands of new genetically modified (GM) strains of mice have been created since the advent of transgenesis and knockout technologies.  Many of these ...

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Medição dos Níveis de heme em células de mamíferos Síntese

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

Quantitative Immunofluorescence Assay to Measure the Variation in Protein Levels at Centrosomes

Quantitative Reação de Imunofluorescência Indireta para medir a variação nos níveis de proteína no centrossomas

Centrosomes are small but important organelles that serve as the poles of mitotic spindle to maintain genomic integrity or assemble primary cilia to ...

Comparison of Three Different Methods for Determining Cell Proliferation in Breast Cancer Cell Lines

Comparação de três métodos diferentes de determinação da proliferação celular em linhas celulares de cancro da mama

Measuring cell proliferation can be performed by a number of different methods, each with varying levels of sensitivity, reproducibility and compatibility ...

Activating Autophagy by Aerobic Exercise in Mice

Ativando Autophagy pelo exercício aeróbio em ratos

Autophagy is a lysosomal degradation pathway essential for cell homeostasis, function and differentiation. Under stress conditions, autophagy is induced ...

Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing

Análise de microbiota usando PCR de duas etapas e sequenciamento do gene 16S rRNA de próxima geração

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the ...

Functional Assessment of Kinesin-7 CENP-E in Spermatocytes Using In Vivo Inhibition, Immunofluorescence and Flow Cytometry

Functional Assessment of Kinesin-7 CENP-E in Spermatocytes Using In Vivo Inhibition, Immunofluorescence and Flow Cytometry

Avaliação funcional da cinesina-7 CENP-E em espermatócitos utilizando inibição in vivo , imunofluorescência e citometria de fluxo

In eukaryotes, meiosis is essential for genome stability and genetic diversity in sexual reproduction. Experimental analyses of spermatocytes in testes ...

Analyzing Starvation-Induced Autophagy in the Drosophila melanogaster Larval Fat Body

Analyzing Starvation-Induced Autophagy in the Drosophila melanogaster Larval Fat Body

Análise da Autofagia Induzida pela Inanição no Corpo Gorduroso de Larvas de Drosophila melanogaster

Autophagy is a cellular self-digestion process. It delivers cargo to the lysosomes for degradation in response to various stresses, including starvation. ...

Ultrastructural Localization of Endogenous LC3 by On-Section Correlative Light-Electron Microscopy

Localização ultraestrutural da CL3 endógena por microscopia óptica-eletrônica correlativa em seção

The visualization of autophagic organelles at the ultrastructural level by electron microscopy (EM) is essential to establish their identity and reveal ...