Name: evaluating autophagy levels in two different pancreatic cell models using lc3 immunofluorescence
Uploaded: 2023-04-28T13:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluating Autophagy Levels in Two Different Pancreatic Cell Models Using LC3 Immunofluorescence at JoVE.com

Эта работа была поддержана грантами Университета Буэнос-Айреса (UBACyT 2018-2020 20020170100082BA), Национального совета по научным исследованиям и технологиям (CONICET) (PIP 2021-2023 GI− 11220200101549CO; и PUE 22920170100033) и Национального агентства по развитию науки и технологий (PICT 2019-01664).

1. Подготовка клеток
<ol><li>Смочите 12-миллиметровые круглые покровные стекла в абсолютном этаноле и поместите их вертикально в лунки 24-луночной пластины.</li>
	<li>Снимите крышку и подвергните многолуночную пластину ультрафиолетовому излучению в течение 15 минут.</li>
	<li>Расположите ?...

<ol>
	<li>Grasso, D., Renna, F. J., Vaccaro, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initial+steps+in+mammalian+autophagosome+biogenesis.">Initial steps in mammalian autophagosome biogenesis.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 146 (2018).</li><li>Galluzzi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+definitions+of+autophagy+and+related+processes.">Molecular definitions of autophagy and related processes.</a> EMBO Journal. 36 (13), 1811-1836 (2017).</li><li>Kitada, M., Koya, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+in+metabolic+disease+and+ageing.">Autophagy in metabolic disease and ageing.</a> Nature Reviews Endocrinology. 17 (11), 647-661 (2021).</li><li>Ktistakis, N. T., Tooze, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digesting+the+expanding+mechanisms+of+autophagy.">Digesting the expanding mechanisms of autophagy.</a> Trends in Cell Biology. 26 (8), 624-635 (2016).</li><li>Tanida, I., Ueno, T., Kominami, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LC3+and+autophagy.">LC3 and autophagy.</a> Methods in Molecular Biology. 445, 77-88 (2008).</li><li>Kabeya, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LC3,+a+mammalian+homologue+of+yeast+Apg8p,+is+localized+in+autophagosome+membranes+after+processing.">LC3, a mammalian homologue of yeast Apg8p, is localized in autophagosome membranes after processing.</a> EMBO Journal. 19 (21), 5720-5728 (2000).</li><li>Mizushima, N., Yoshimori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+interpret+LC3+immunoblotting.">How to interpret LC3 immunoblotting.</a> Autophagy. 3 (6), 542-545 (2007).</li><li>Vanasco, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dynamics+and+VMP1-related+selective+mitophagy+in+experimental+acute+pancreatitis.">Mitochondrial dynamics and VMP1-related selective mitophagy in experimental acute pancreatitis.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 640094 (2021).</li><li>Williams, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+mechanisms+in+pancreas+and+salivary+acini.">Regulatory mechanisms in pancreas and salivary acini.</a> Annual Review of Physiology. 46, 361-375 (1984).</li><li>Mizrahi, J. D., Surana, R., Valle, J. W., Shroff, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+cancer.">Pancreatic cancer.</a> Lancet. 395 (10242), 2008-2020 (2020).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+and+function+of+autophagy+in+pancreatic+cancer.">Regulation and function of autophagy in pancreatic cancer.</a> Autophagy. 17 (11), 3275-3296 (2021).</li><li>Ropolo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+E2F1-EP300-VMP1+pathway+mediates+gemcitabine-induced+autophagy+in+pancreatic+cancer+cells+carrying+oncogenic+KRAS.">A novel E2F1-EP300-VMP1 pathway mediates gemcitabine-induced autophagy in pancreatic cancer cells carrying oncogenic KRAS.</a> Frontiers in Endocrinology. 11, 411 (2020).</li><li>Pardo, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gemcitabine+induces+the+VMP1-mediated+autophagy+pathway+to+promote+apoptotic+death+in+human+pancreatic+cancer+cells.">Gemcitabine induces the VMP1-mediated autophagy pathway to promote apoptotic death in human pancreatic cancer cells.</a> Pancreatology. 10 (1), 19-26 (2010).</li><li>Logsdon, C. D., Moessner, J., Williams, J. A., Goldfine, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucocorticoids+increase+amylase+mRNA+levels,+secretory+organelles,+and+secretion+in+pancreatic+acinar+AR42J+cells.">Glucocorticoids increase amylase mRNA levels, secretory organelles, and secretion in pancreatic acinar AR42J cells.</a> Journal of Cell Biology. 100 (4), 1200-1208 (1985).</li><li>Klionsky, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+assays+for+monitoring+autophagy+(4th+edition).">Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (4th edition).</a> Autophagy. 17 (1), 1 (2021).</li><li>Segeritz, C. -. P., Vallier, L., Jalali, M., Saldanha, F. Y. L., Jalali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+9+-+Cell+culture:+Growing+cells+as+model+systems+in+vitro.">Chapter 9 - Cell culture: Growing cells as model systems in vitro.</a> Basic Science Methods for Clinical Researchers. , 151-172 (2017).</li><li>Elliott, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+microscopy:+Principles+and+modern+practices.">Confocal microscopy: Principles and modern practices.</a> Current Protocols in Cytometry. 92 (1), 68 (2020).</li><li>Grasso, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+novel+selective+autophagy+pathway+mediated+by+VMP1-USP9x-p62,+prevents+pancreatic+cell+death.">a novel selective autophagy pathway mediated by VMP1-USP9x-p62, prevents pancreatic cell death.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (10), 8308-8324 (2011).</li><li>Ropolo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pancreatitis-induced+vacuole+membrane+protein+1+triggers+autophagy+in+mammalian+cells.">The pancreatitis-induced vacuole membrane protein 1 triggers autophagy in mammalian cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 282 (51), 37124-37133 (2007).</li><li>Karanasios, E., Stapleton, E., Walker, S. A., Manifava, M., Ktistakis, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+imaging+of+early+autophagy+events:+Omegasomes+and+beyond.">Live cell imaging of early autophagy events: Omegasomes and beyond.</a> Journal of Visualized Experiments. (77), e50484 (2013).</li><li>Kuma, A., Matsui, M., Mizushima, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LC3,+an+autophagosome+marker,+can+be+incorporated+into+protein+aggregates+independent+of+autophagy:+caution+in+the+interpretation+of+LC3+localization.">LC3, an autophagosome marker, can be incorporated into protein aggregates independent of autophagy: caution in the interpretation of LC3 localization.</a> Autophagy. 3 (4), 323-328 (2007).</li><li>Zhang, Z., Singh, R., Aschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+the+detection+of+autophagy+in+mammalian+cells.">Methods for the detection of autophagy in mammalian cells.</a> Current Protocols in Toxicology. 69, 1-26 (2016).</li><li>Yoshii, S. R., Mizushima, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+and+measuring+autophagy.">Monitoring and measuring autophagy.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (9), 1865 (2017).</li><li>Betriu, N., Andreeva, A., Semino, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erlotinib+promotes+ligand-induced+EGFR+degradation+in+3D+but+not+2D+cultures+of+pancreatic+ductal+adenocarcinoma+cells.">Erlotinib promotes ligand-induced EGFR degradation in 3D but not 2D cultures of pancreatic ductal adenocarcinoma cells.</a> Cancers. 13 (18), 4504 (2021).</li><li>Wang, W., Dong, L., Zhao, B., Lu, J., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E-cadherin+is+downregulated+by+microenvironmental+changes+in+pancreatic+cancer+and+induces+EMT.">E-cadherin is downregulated by microenvironmental changes in pancreatic cancer and induces EMT.</a> Oncology Reports. 40 (3), 1641-1649 (2018).</li><li>Kim, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+heterogeneity+and+plasticity+of+cancer+cell+migration+in+a+pancreatic+tumor+three-dimensional+culture+model.">Phenotypic heterogeneity and plasticity of cancer cell migration in a pancreatic tumor three-dimensional culture model.</a> Cancers. 12 (5), 1305 (2020).</li><li>Meng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+EpCAM+over-expression+is+associated+with+favorable+clinical+outcomes+in+pancreatic+cancer+patients+with+Hepatitis+B+virus+negative+infection.">Cytoplasmic EpCAM over-expression is associated with favorable clinical outcomes in pancreatic cancer patients with Hepatitis B virus negative infection.</a> International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 8 (12), 22204-22216 (2015).</li><li>Brock, R., Hamelers, I. H., Jovin, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+fixation+protocols+for+adherent+cultured+cells+applied+to+a+GFP+fusion+protein+of+the+epidermal+growth+factor+receptor.">Comparison of fixation protocols for adherent cultured cells applied to a GFP fusion protein of the epidermal growth factor receptor.</a> Cytometry. 35 (4), 353-362 (1999).</li></ol>

Способ, описанный в этом протоколе, позволяет визуализировать эндогенное распределение LC3 в клетке и количественно определять аутофагические уровни в различных условиях. Другой аналогичный метод, используемый для анализа распределения LC3 и определения активации аутофагии, включает м...

Макроаутофагия (обычно называемая аутофагией) представляет собой специализированный катаболический процесс, который избирательно разрушает цитоплазматические компоненты, включая белки и поврежденные органеллы 1,2. Аутофагия позволяет клеткам физиологически реагировать на стрессовые стимулы и, таким образом, поддерживать клеточный гомеостаз3. Во время аутофагии образуется пузырь с двойной мембраной: аутофагосома. Аутофагосома содержит молекулы груза и направляет их в лизосому для деградации 1,4.
Аутофагосомы украшены легкой цепью белка 3 (LC3)5, ассоциированной с аутофагическим белком, связанным с микротрубочками. Когда аутофагия не индуцирована, LC3 диффундирует в цитоплазме и ядре в конформации LC3-I. С другой стороны, когда индуцируется аутофагия, LC3 конъюгируется с фосфатидилэтаноламином в мембране аутофагических структур6. Эта новая конформация LC3 известна как LC3-II1. Конформационный сдвиг LC3 вызывает изменения в его клеточной локализации и миграции электрофореза в додецилсульфате натрия-полиакриламидном геле (SDS-PAGE), которые могут быть обнаружены такими методами, как иммунофлуоресценция и вестерн-блоттинг 5,7. Таким образом, конъюгация LC3 является ключевым событием в аутофагическом процессе, которое может быть использовано для измерения аутофагической активности.
Ацинарная клетка поджелудочной железы является высокодифференцированной клеткой, которая в здоровых условиях имеет низкий уровень аутофагии. Однако в различных физиологических условиях или при фармакологической стимуляции они могут активировать аутофагию. Следовательно, определение аутофагических уровней в этой клеточной линии полезно для изучения потенциальных прямых или косвенных эффектов различных фармакологических или биологических агентов на аутофагию 8,9.
Протоковая аденокарцинома поджелудочной железы является одним из самых смертоносных видов рака, учитывая его позднюю диагностику и высокую устойчивость к химиотерапии10. Раковые клетки поджелудочной железы обладают высокой аутофагической активностью из-за транскрипционной апрегуляции и посттрансляционной активации белков, связанных с аутофагией11. Раковые клетки поджелудочной железы могут корректировать свои уровни аутофагии в ответ на неблагоприятные условия, такие как гипоксия, лишение питательных веществ или повреждение, вызванное химиотерапией11. Следовательно, анализ уровней аутофагии в раковых клетках поджелудочной железы может помочь понять, как они адаптируются к различным средам, и оценить эффективность лечения, модулирующего аутофагию.
В этом исследовании показан метод проведения иммунофлуоресценции LC3 на двух различных клеточных моделях поджелудочной железы. Первая модель, клетки PANC-1, послужили моделью для аденокарциномы протоков поджелудочной железы. Эти клетки обрабатывали гемцитабином, химиотерапевтическим агентом, который, как было показано ранее, индуцирует аутофагию, особенно в раковых клетках поджелудочной железы, несущих онкогенный ген вируса саркомы крысы Кирстен (KRAS)12,13. Вторая модель, клетки AR42J, служила более физиологической моделью экзокринных клеток поджелудочной железы. Эти клетки дифференцировались с дексаметазоном, чтобы стать более похожими на ацинарные клетки поджелудочной железы14. В этих клетках аутофагия была фармакологически индуцирована с помощью PP242, который является мощным ингибитором mTOR15. В этом исследовании мы демонстрируем применимость протокола, описанного с двумя разными моделями поджелудочной железы, и его способность различать состояния низкой и высокой аутофагии.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10x Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>46-013-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 mm round coverslips</td>
			<td>HDA</td>
			<td>CBR_OBJ_6467</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 Well- Cell Culture Plate</td>
			<td>Sorfa</td>
			<td>220300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute ethanol</td>
			<td>Biopack</td>
			<td>2207.10.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 Donkey anti-rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R37119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Laser Scanning Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM 800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>62248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D4902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEN</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>01-052-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>NATOCOR&#160;</td>
			<td>Lintc-634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gemcitabina</td>
			<td>Eli Lilly</td>
			<td>VL7502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC3B (D11) XP Rabbit mAb</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>3868S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Anedra</td>
			<td>6197</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm &#34;M&#34; (Laboratory Sealing Film)</td>
			<td>Bemis/Curwood</td>
			<td>PM-996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Strep Solution</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>03-031-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PP242</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>SC-301606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11570626</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluating autophagy levels in two different pancreatic cell models using lc3 immunofluorescence

Аутофагия представляет собой специализированный катаболический процесс, который избирательно разрушает цитоплазматические компоненты, включая белки и поврежденные органеллы. Аутофагия позволяет клеткам физиологически реагировать на стрессовые стимулы и, таким образом, поддерживать клеточный гомеостаз. Раковые клетки могут модулировать свои уровни аутофагии, чтобы адаптироваться к неблагоприятным условиям, таким как гипоксия, дефицит питательных веществ или повреждение, вызванное химиотерапией. Протоковая аденокарцинома поджелудочной железы является одним из самых смертоносных видов рака. Раковые клетки поджелудочной железы обладают высокой аутофагической активностью из-за транскрипционной апрегуляции и посттрансляционной активации белков аутофагии.
Здесь клеточная линия PANC-1 использовалась в качестве модели раковых клеток поджелудочной железы человека, а линия ацинарных клеток поджелудочной железы AR42J использовалась в качестве физиологической модели высокодифференцированных клеток млекопитающих. В этом исследовании в качестве индикатора состояния активации аутофагии использовали иммунофлуоресценцию связанного с микротрубочками белка легкой цепи 3 (LC3). LC3 представляет собой белок аутофагии, который в базальных условиях демонстрирует диффузный паттерн распределения в цитоплазме (известный как LC3-I в этом состоянии). Индукция аутофагии запускает конъюгацию LC3 с фосфатидилэтаноламином на поверхности новообразованных аутофагосом с образованием LC3-II, связанного с мембраной белка, который помогает в образовании и расширении аутофагосом. Для количественной оценки количества меченых автофагических структур было использовано программное обеспечение с открытым исходным кодом FIJI с помощью инструмента «3D Objects Counter».
Измерение аутофагических уровней как в физиологических условиях, так и в раковых клетках позволяет нам изучать модуляцию аутофагии при различных условиях, таких как гипоксия, химиотерапия или нокдаун определенных белков.

Этот протокол выполняет иммунофлуоресценцию LC3 в клеточных линиях поджелудочной железы для определения уровней аутофагии в различных условиях. Результатом этого эксперимента стало получение клеточных изображений из красного и синего каналов, соответствующих LC3 и DAPI. Изображения LC3 п?...

Watch this Scientific Journal Video about Evaluating Autophagy Levels in Two Different Pancreatic Cell Models Using LC3 Immunofluorescence at JoVE.com

Evaluating Autophagy Levels in Two Different Pancreatic Cell Models Using LC3 Immunofluorescence

Целью этого протокола является определение аутофагических уровней в раке поджелудочной железы и ацинарных клетках поджелудочной железы с помощью иммунофлуоресценции LC3 и количественного определения точек LC3.

Оценка уровней аутофагии в двух разных моделях клеток поджелудочной железы с использованием иммунофлуоресценции LC3

Autophagy is a specialized catabolic process that selectively degrades cytoplasmic components, including proteins and damaged organelles. Autophagy allows ...

Иммунофлуоресценция LC3 позволяет определять уровни аутофагии в клетках поджелудочной железы. Это позволяет изучать потенциальное влияние различных агентов на аутофагию клеток поджелудочной железы. Иммунофлуоресценция - это метод, используемый для обнаружения эндогенного белка LC3, который позволяет избежать проблем, вызванных чрезмерной экспрессией LC3, таких как образование белковых агрегатов, не связанных с аутофагией.Продемонстрируют процедуру Фелипе Ренна, аспирант, и Малена Эррера Лопес, аспирант лаборатории Марии Инес Ваккаро. Чтобы начать подготовку клеток, замочите 12-миллиметровые круглые покровные листы в абсолютном этаноле. Сняв крышку, поместите пропитанную крышку вертикально в 24-луночную пластину.Подвергните многолуночную пластину ультрафиолетовому излучению в течение 15 минут. Затем установите защитное стекло горизонтально и промойте его ДМЭМ. Теперь посмотрите на низкое количество проходов клеток поджелудочной железы, повторно суспендированных в DMEM, содержащих 10% FBS, пенициллина и стрептомицина, и инкубируйте клетки в течение двух дней.Через два дня после посева клеток приготовьте раствор гемцитабина в ДМЭМ в концентрации один микрограмм на микролитр. Затем аспирируйте половину объема из каждой лунки в отдельную пробирку и добавьте соответствующее количество раствора гемцитабина. Верните половину объема, соответствующую каждой лунке, обратно в обработанные лунки и инкубируйте клетки в течение 24 часов.Для фиксации и проникновения клеток добавьте холодный метанол в 24-луночную пластину, содержащую клетки. Также подготовьте шестилуночную тарелку с холодным PBS. Используя иглу шприца и пинцет, возьмите каждый листок крышки и дважды промойте его в PBS.Затем инкубировать в метаноле в течение шести минут. После двукратной промывки с помощью PBS инкубируйте покровные шликеры в блокирующем растворе в течение одного часа. Добавьте анти-LC3 в блокирующий раствор в соотношении один к 1000 и поддерживайте на льду.Поместите кусок лабораторной герметизирующей пленки на многолуночную крышку и добавьте 25 микролитров раствора анти-LC3 на покровное стекло поверх герметизирующей пленки. Используя иглу шприца и пинцет, поместите каждую крышку на первичную каплю антитела, убедившись, что сторона клетки находится в контакте с раствором. Поместите многолуночную пластину в камеру влажности.Накройте его фольгой и выдержите ночь в холодильнике. На следующий день извлеките многолуночную пластину из камеры влажности. Поместите пальцы крышки обратно на многолуночную пластину и промойте их PBS три раза.Разбавьте флуоресцентно меченный антикролик в блокирующем растворе в соотношении один к 800 и держите на льду в темноте. После запечатывания многолуночной крышки добавьте 25 микролитров раствора против кролика на защитную пленку. И обработайте покровный листок вторичным антителом, как было продемонстрировано ранее.Затем выдержите пластину во влажной камере в течение двух часов при комнатной температуре, защищенной от света. По окончании инкубации с антителами трижды промойте покровные листы на многолуночной пластине ПБС. Инкубируйте каждый покровный лист приготовленным раствором DAPI в течение 10 минут.После промывки с помощью PBS держите многолуночную пластину в темноте. Для монтажа клеток подготовьте два стакана с водой и лист бумаги. Добавьте 10 микролитров раствора ПВА-ДАБКО на покровное стекло предметного стекла.Промойте покровное стекло в воде, а затем высушите его на бумаге. Наконец, поместите его на каплю PVA-DABCO. И сушить на ночь в темноте.На следующий день с помощью инвертированного конфокального микроскопа визуализируйте меченые клетки и сделайте снимки. После захвата изображений перетащите каждый файл изображения, содержащий захваченные каналы, на экран Фиджи. В диалоговом окне нажмите кнопку ОК, чтобы открыть изображение.Затем закройте открывшееся окно консоли. На вкладке «Изображение» выберите «Цвет», а затем «Разделить каналы». Закройте изображение, соответствующее каналам, отличным от изображения LC3.Затем на вкладке «Изображение» выберите «Настроить», а затем «Цветовой баланс». Перемещайте ползунок «Максимум» влево, пока изображение не насытится, чтобы визуализировать контуры ячеек. Используйте инструмент выделения от руки, чтобы нарисовать контур ячейки, и нажмите кнопку сброса, чтобы настроить цвета.Чтобы вырезать выбранный элемент на вкладке «Правка», выберите «Вырезать» и закройте изображение, не сохраняя его. И на вкладке «Правка» выберите «Вставить». В меню «Анализ» выберите инструмент «Счетчик 3D-объектов».Установите пороговое значение 2000, а фильтр по размеру — от 50 до 500. Убедитесь, что объекты и поля сводки помечены, и нажмите OK.In окне журнала, количество точек будет описано как обнаруженные объекты. Иммунофлуоресценция показала клеточное распределение белка LC3, тогда как DAPI показал ядерную локализацию в клетках поджелудочной железы.Точки LC3 значительно увеличивались при лечении гемцитабином, что указывает на аутофагическую активность. При чрезмерном слиянии экзокринные клетки поджелудочной железы имеют тенденцию накапливаться и расти друг на друге. Метод фиксации клеток параформальдегида был неэффективен для сохранения белков LC3, так как не отражал точного распределения.Когда фиксацию или обработку проводили, не дожидаясь двух дней после посева, клетки PANC1 имели круглую форму. Эта морфология уменьшала связь между цитоплазмой и ядром, что затрудняло понимание внутриклеточного распределения LC3. Неполная фиксация метанола может помешать правильной иммуномаркировке LC3, что приведет к нечетким изображениям и неоптимальному количественному определению.Самое важное, что нужно помнить во время этой процедуры, это то, что клетки должны быть зафиксированы в холодном метаноле в течение шести минут, а не в параформальдегиде. После этой процедуры можно проанализировать колокализацию между LC3 и другими белками, что позволит изучить различные молекулярные пути, связанные с функциями LC3.

Research

JoVE Journal

Biology

Monitoring Dynamic Changes In Mitochondrial Calcium Levels During Apoptosis Using A Genetically Encoded Calcium Sensor

Мониторинг динамических изменений в митохондриальной уровня кальция во время апоптоза Использование генетически закодированные Кальций датчика

Dynamic changes in intracellular calcium concentration in response to various stimuli regulates many cellular processes such as proliferation, ...

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the I&middot;Cryo Kit

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the IÃƒâ€šÃ‚Â·Cryo Kit

Мышь Криоконсервация спермы и восстановление использованием I · Cryo Kit

Thousands of new genetically modified (GM) strains of mice have been created since the advent of transgenesis and knockout technologies.  Many of these ...

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Измерение уровней Гем синтез в клетках млекопитающих

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

Quantitative Immunofluorescence Assay to Measure the Variation in Protein Levels at Centrosomes

Количественный иммунофлюоресценции для измерения различий в уровне белка на центросомах

Centrosomes are small but important organelles that serve as the poles of mitotic spindle to maintain genomic integrity or assemble primary cilia to ...

Comparison of Three Different Methods for Determining Cell Proliferation in Breast Cancer Cell Lines

Сравнение трех различных методов для определения пролиферации клеток рака молочной железы в клеточных линиях

Measuring cell proliferation can be performed by a number of different methods, each with varying levels of sensitivity, reproducibility and compatibility ...

Activating Autophagy by Aerobic Exercise in Mice

Активация аутофагии аэробикой у мышей

Autophagy is a lysosomal degradation pathway essential for cell homeostasis, function and differentiation. Under stress conditions, autophagy is induced ...

Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing

Анализ микробиоты с использованием двухступенчатого ПЦР и секвенирования гена нового поколения 16S rRNA

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the ...

Functional Assessment of Kinesin-7 CENP-E in Spermatocytes Using In Vivo Inhibition, Immunofluorescence and Flow Cytometry

Functional Assessment of Kinesin-7 CENP-E in Spermatocytes Using In Vivo Inhibition, Immunofluorescence and Flow Cytometry

Функциональная оценка кинезина-7 CENP-E в сперматоцитах с использованием ингибирования, иммунофлюоресценции и проточной цитометрии in vivo

In eukaryotes, meiosis is essential for genome stability and genetic diversity in sexual reproduction. Experimental analyses of spermatocytes in testes ...

Analyzing Starvation-Induced Autophagy in the Drosophila melanogaster Larval Fat Body

Analyzing Starvation-Induced Autophagy in the Drosophila melanogaster Larval Fat Body

Анализ аутофагии, вызванной голоданием, в личиночном жировом теле Drosophila melanogaster

Autophagy is a cellular self-digestion process. It delivers cargo to the lysosomes for degradation in response to various stresses, including starvation. ...

Ultrastructural Localization of Endogenous LC3 by On-Section Correlative Light-Electron Microscopy

Ультраструктурная локализация эндогенного LC3 методом срезовой коррелятивной светоэлектронной микроскопии

The visualization of autophagic organelles at the ultrastructural level by electron microscopy (EM) is essential to establish their identity and reveal ...