Name: evaluating autophagy levels in two different pancreatic cell models using lc3 immunofluorescence
Uploaded: 2023-04-28T13:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluating Autophagy Levels in Two Different Pancreatic Cell Models Using LC3 Immunofluorescence at JoVE.com

Este trabajo fue apoyado por becas de la Universidad de Buenos Aires (UBACyT 2018-2020 20020170100082BA), el Consejo Nacional de Investigación Científica y Tecnológica (CONICET) (PIP 2021-2023 GI− 11220200101549CO; y PUE 22920170100033) y la Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica (PICT 2019-01664).

1. Preparación celular
<ol><li>Remoje los cubreobjetos redondos de 12 mm en etanol absoluto y colóquelos verticalmente en los pocillos de una placa de 24 pocillos.</li>
	<li>Retire la cubierta y exponga la placa de pocillos múltiples a la radiación ultravioleta durante 15 minutos.</li>
	<li>Coloque los cubreobjetos horizontalmente y lávelos con el medio de águila modificado (DMEM) de Dulbecco.</li>
	<li>Sembrar un número bajo de células pancreáticas. La cantidad debe ajustarse para obtener una...

<ol>
	<li>Grasso, D., Renna, F. J., Vaccaro, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initial+steps+in+mammalian+autophagosome+biogenesis.">Initial steps in mammalian autophagosome biogenesis.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 146 (2018).</li><li>Galluzzi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+definitions+of+autophagy+and+related+processes.">Molecular definitions of autophagy and related processes.</a> EMBO Journal. 36 (13), 1811-1836 (2017).</li><li>Kitada, M., Koya, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+in+metabolic+disease+and+ageing.">Autophagy in metabolic disease and ageing.</a> Nature Reviews Endocrinology. 17 (11), 647-661 (2021).</li><li>Ktistakis, N. T., Tooze, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digesting+the+expanding+mechanisms+of+autophagy.">Digesting the expanding mechanisms of autophagy.</a> Trends in Cell Biology. 26 (8), 624-635 (2016).</li><li>Tanida, I., Ueno, T., Kominami, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LC3+and+autophagy.">LC3 and autophagy.</a> Methods in Molecular Biology. 445, 77-88 (2008).</li><li>Kabeya, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LC3,+a+mammalian+homologue+of+yeast+Apg8p,+is+localized+in+autophagosome+membranes+after+processing.">LC3, a mammalian homologue of yeast Apg8p, is localized in autophagosome membranes after processing.</a> EMBO Journal. 19 (21), 5720-5728 (2000).</li><li>Mizushima, N., Yoshimori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+interpret+LC3+immunoblotting.">How to interpret LC3 immunoblotting.</a> Autophagy. 3 (6), 542-545 (2007).</li><li>Vanasco, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dynamics+and+VMP1-related+selective+mitophagy+in+experimental+acute+pancreatitis.">Mitochondrial dynamics and VMP1-related selective mitophagy in experimental acute pancreatitis.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 640094 (2021).</li><li>Williams, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+mechanisms+in+pancreas+and+salivary+acini.">Regulatory mechanisms in pancreas and salivary acini.</a> Annual Review of Physiology. 46, 361-375 (1984).</li><li>Mizrahi, J. D., Surana, R., Valle, J. W., Shroff, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+cancer.">Pancreatic cancer.</a> Lancet. 395 (10242), 2008-2020 (2020).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+and+function+of+autophagy+in+pancreatic+cancer.">Regulation and function of autophagy in pancreatic cancer.</a> Autophagy. 17 (11), 3275-3296 (2021).</li><li>Ropolo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+E2F1-EP300-VMP1+pathway+mediates+gemcitabine-induced+autophagy+in+pancreatic+cancer+cells+carrying+oncogenic+KRAS.">A novel E2F1-EP300-VMP1 pathway mediates gemcitabine-induced autophagy in pancreatic cancer cells carrying oncogenic KRAS.</a> Frontiers in Endocrinology. 11, 411 (2020).</li><li>Pardo, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gemcitabine+induces+the+VMP1-mediated+autophagy+pathway+to+promote+apoptotic+death+in+human+pancreatic+cancer+cells.">Gemcitabine induces the VMP1-mediated autophagy pathway to promote apoptotic death in human pancreatic cancer cells.</a> Pancreatology. 10 (1), 19-26 (2010).</li><li>Logsdon, C. D., Moessner, J., Williams, J. A., Goldfine, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucocorticoids+increase+amylase+mRNA+levels,+secretory+organelles,+and+secretion+in+pancreatic+acinar+AR42J+cells.">Glucocorticoids increase amylase mRNA levels, secretory organelles, and secretion in pancreatic acinar AR42J cells.</a> Journal of Cell Biology. 100 (4), 1200-1208 (1985).</li><li>Klionsky, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+assays+for+monitoring+autophagy+(4th+edition).">Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (4th edition).</a> Autophagy. 17 (1), 1 (2021).</li><li>Segeritz, C. -. P., Vallier, L., Jalali, M., Saldanha, F. Y. L., Jalali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+9+-+Cell+culture:+Growing+cells+as+model+systems+in+vitro.">Chapter 9 - Cell culture: Growing cells as model systems in vitro.</a> Basic Science Methods for Clinical Researchers. , 151-172 (2017).</li><li>Elliott, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+microscopy:+Principles+and+modern+practices.">Confocal microscopy: Principles and modern practices.</a> Current Protocols in Cytometry. 92 (1), 68 (2020).</li><li>Grasso, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+novel+selective+autophagy+pathway+mediated+by+VMP1-USP9x-p62,+prevents+pancreatic+cell+death.">a novel selective autophagy pathway mediated by VMP1-USP9x-p62, prevents pancreatic cell death.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (10), 8308-8324 (2011).</li><li>Ropolo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pancreatitis-induced+vacuole+membrane+protein+1+triggers+autophagy+in+mammalian+cells.">The pancreatitis-induced vacuole membrane protein 1 triggers autophagy in mammalian cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 282 (51), 37124-37133 (2007).</li><li>Karanasios, E., Stapleton, E., Walker, S. A., Manifava, M., Ktistakis, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+imaging+of+early+autophagy+events:+Omegasomes+and+beyond.">Live cell imaging of early autophagy events: Omegasomes and beyond.</a> Journal of Visualized Experiments. (77), e50484 (2013).</li><li>Kuma, A., Matsui, M., Mizushima, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LC3,+an+autophagosome+marker,+can+be+incorporated+into+protein+aggregates+independent+of+autophagy:+caution+in+the+interpretation+of+LC3+localization.">LC3, an autophagosome marker, can be incorporated into protein aggregates independent of autophagy: caution in the interpretation of LC3 localization.</a> Autophagy. 3 (4), 323-328 (2007).</li><li>Zhang, Z., Singh, R., Aschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+the+detection+of+autophagy+in+mammalian+cells.">Methods for the detection of autophagy in mammalian cells.</a> Current Protocols in Toxicology. 69, 1-26 (2016).</li><li>Yoshii, S. R., Mizushima, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+and+measuring+autophagy.">Monitoring and measuring autophagy.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (9), 1865 (2017).</li><li>Betriu, N., Andreeva, A., Semino, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erlotinib+promotes+ligand-induced+EGFR+degradation+in+3D+but+not+2D+cultures+of+pancreatic+ductal+adenocarcinoma+cells.">Erlotinib promotes ligand-induced EGFR degradation in 3D but not 2D cultures of pancreatic ductal adenocarcinoma cells.</a> Cancers. 13 (18), 4504 (2021).</li><li>Wang, W., Dong, L., Zhao, B., Lu, J., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E-cadherin+is+downregulated+by+microenvironmental+changes+in+pancreatic+cancer+and+induces+EMT.">E-cadherin is downregulated by microenvironmental changes in pancreatic cancer and induces EMT.</a> Oncology Reports. 40 (3), 1641-1649 (2018).</li><li>Kim, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+heterogeneity+and+plasticity+of+cancer+cell+migration+in+a+pancreatic+tumor+three-dimensional+culture+model.">Phenotypic heterogeneity and plasticity of cancer cell migration in a pancreatic tumor three-dimensional culture model.</a> Cancers. 12 (5), 1305 (2020).</li><li>Meng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+EpCAM+over-expression+is+associated+with+favorable+clinical+outcomes+in+pancreatic+cancer+patients+with+Hepatitis+B+virus+negative+infection.">Cytoplasmic EpCAM over-expression is associated with favorable clinical outcomes in pancreatic cancer patients with Hepatitis B virus negative infection.</a> International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 8 (12), 22204-22216 (2015).</li><li>Brock, R., Hamelers, I. H., Jovin, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+fixation+protocols+for+adherent+cultured+cells+applied+to+a+GFP+fusion+protein+of+the+epidermal+growth+factor+receptor.">Comparison of fixation protocols for adherent cultured cells applied to a GFP fusion protein of the epidermal growth factor receptor.</a> Cytometry. 35 (4), 353-362 (1999).</li></ol>

El método descrito en este protocolo permite visualizar la distribución endógena de CL3 en la célula y cuantificar los niveles autofágicos en diferentes condiciones. Otro método similar utilizado para analizar la distribución de CL3 y determinar la activación de la autofagia implica la transfección de LC3 marcada con fluorescencia (como RFP-LC3)19. La transfección RFP-LC3 tiene las ventajas de no necesitar fijación (lo que permite aplicar este método en imágenes de células vivas<sup ...

La macroautofagia (comúnmente conocida como autofagia) es un proceso catabólico especializado que degrada selectivamente los componentes citoplasmáticos, incluidas las proteínas y los orgánulos dañados 1,2. La autofagia permite a las células responder fisiológicamente a los estímulos de estrés y, así, mantener la homeostasis celular3. Durante la autofagia, se forma una vesícula de doble membrana: el autofagosoma. El autofagosoma contiene las moléculas de carga y las conduce al lisosoma para su degradación 1,4.
Los autofagosomas están decorados por la proteína autofágica de la cadena ligera 3 (CL3)5. Cuando no se induce la autofagia, la CL3 se difunde en el citoplasma y el núcleo en la conformación LC3-I. Por otro lado, cuando se induce la autofagia, la CL3 se conjuga con una fosfatidiletanolamina en la membrana de las estructuras autofágicas6. Esta nueva conformación LC3 se conoce como LC3-II1. El cambio de conformación de LC3 provoca cambios en su localización celular y su migración de electroforesis en gel de dodecil sulfato de sodio-poliacrilamida (SDS-PAGE), que puede ser detectada por técnicas como la inmunofluorescencia y el western blot 5,7. De esta manera, la conjugación de CL3 es un evento clave en el proceso autofágico que se puede utilizar para medir la actividad autofágica.
La célula acinar pancreática es una célula altamente diferenciada que, en condiciones saludables, tiene una baja tasa de autofagia. Sin embargo, en diferentes condiciones fisiológicas o bajo estimulación farmacológica, pueden activar la autofagia. Por lo tanto, la determinación de los niveles autofágicos en esta línea celular es útil para estudiar los posibles efectos directos o indirectos de diferentes agentes farmacológicos o biológicos sobre la autofagia 8,9.
El adenocarcinoma pancreático ductal es uno de los tipos de cáncer más mortales, dado su diagnóstico tardío y su alta resistencia a la quimioterapia10. Las células de cáncer de páncreas tienen una alta actividad de autofagia debido a la regulación transcripcional positiva y la activación postraduccional de proteínas relacionadas con la autofagia11. Las células de cáncer de páncreas pueden ajustar sus niveles de autofagia en respuesta a condiciones desfavorables como hipoxia, privación de nutrientes o daño inducido por la quimioterapia11. Por lo tanto, analizar los niveles de autofagia en las células de cáncer de páncreas puede ayudar a comprender cómo se adaptan a diferentes entornos y evaluar la efectividad de los tratamientos moduladores de la autofagia.
Este estudio muestra un método para realizar la inmunofluorescencia de LC3 en dos modelos celulares pancreáticos distintos. El primer modelo, las células PANC-1, sirvió como modelo para el adenocarcinoma ductal pancreático. Estas células fueron tratadas con gemcitabina, un agente quimioterápico que previamente ha demostrado inducir autofagia, específicamente en células de cáncer de páncreas portadoras del gen oncogénico del virus del sarcoma de rata Kirsten (KRAS)12,13. El segundo modelo, las células AR42J, sirvió como un modelo más fisiológico de las células pancreáticas exocrinas. Estas células fueron diferenciadas con dexametasona para volverse más similares a las células pancreáticas acinares14. En estas células, la autofagia fue inducida farmacológicamente mediante el uso de PP242, que es un potente inhibidor de mTOR15. En este estudio, demostramos la aplicabilidad del protocolo descrito con dos modelos pancreáticos diferentes y su capacidad para discriminar entre estados de baja y alta autofagia.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10x Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>46-013-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 mm round coverslips</td>
			<td>HDA</td>
			<td>CBR_OBJ_6467</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 Well- Cell Culture Plate</td>
			<td>Sorfa</td>
			<td>220300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute ethanol</td>
			<td>Biopack</td>
			<td>2207.10.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 Donkey anti-rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R37119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Laser Scanning Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM 800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>62248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D4902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEN</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>01-052-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>NATOCOR&#160;</td>
			<td>Lintc-634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gemcitabina</td>
			<td>Eli Lilly</td>
			<td>VL7502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC3B (D11) XP Rabbit mAb</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>3868S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Anedra</td>
			<td>6197</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm &#34;M&#34; (Laboratory Sealing Film)</td>
			<td>Bemis/Curwood</td>
			<td>PM-996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Strep Solution</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>03-031-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PP242</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>SC-301606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11570626</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluating autophagy levels in two different pancreatic cell models using lc3 immunofluorescence

La autofagia es un proceso catabólico especializado que degrada selectivamente los componentes citoplasmáticos, incluidas las proteínas y los orgánulos dañados. La autofagia permite a las células responder fisiológicamente a los estímulos de estrés y, por lo tanto, mantener la homeostasis celular. Las células cancerosas pueden modular sus niveles de autofagia para adaptarse a condiciones adversas como hipoxia, deficiencia de nutrientes o daño causado por la quimioterapia. El adenocarcinoma pancreático ductal es uno de los tipos de cáncer más mortales. Las células de cáncer de páncreas tienen una alta actividad de autofagia debido a la regulación transcripcional positiva y la activación postraduccional de las proteínas de autofagia.
Aquí, la línea celular PANC-1 se utilizó como modelo de células de cáncer de páncreas humano, y la línea celular acinar pancreática AR42J se utilizó como modelo fisiológico de células de mamíferos altamente diferenciadas. Este estudio utilizó la inmunofluorescencia de la cadena ligera 3 de la proteína asociada a microtúbulos (CL3) como un indicador del estado de activación de la autofagia. La CL3 es una proteína de autofagia que, en condiciones basales, muestra un patrón difuso de distribución en el citoplasma (conocido como LC3-I en esta condición). La inducción de autofagia desencadena la conjugación de CL3 a fosfatidiletanolamina en la superficie de los autofagosomas recién formados para formar LC3-II, una proteína unida a la membrana que ayuda en la formación y expansión de autofagosomas. Para cuantificar el número de estructuras autofágicas etiquetadas, se utilizó el software de código abierto FIJI con la ayuda de la herramienta "3D Objects Counter".
La medida de los niveles autofágicos tanto en condiciones fisiológicas como en células cancerosas nos permite estudiar la modulación de la autofagia en diversas condiciones como la hipoxia, el tratamiento de quimioterapia o el derribo de ciertas proteínas.

Este protocolo realiza inmunofluorescencia de CL3 en líneas celulares pancreáticas para determinar los niveles de autofagia en diferentes condiciones. El resultado de este experimento fue la obtención de imágenes celulares de los canales rojo y azul, correspondientes a LC3 y DAPI. Las imágenes de LC3 indican la distribución celular de esta proteína, mientras que la DAPI muestra la localización nuclear. La Figura 2A muestra una imagen representativa de la inmunofluorescencia de LC3 y ...

Watch this Scientific Journal Video about Evaluating Autophagy Levels in Two Different Pancreatic Cell Models Using LC3 Immunofluorescence at JoVE.com

Evaluating Autophagy Levels in Two Different Pancreatic Cell Models Using LC3 Immunofluorescence

El objetivo de este protocolo es determinar los niveles autofágicos en el cáncer de páncreas y las células acinares pancreáticas a través de la inmunofluorescencia LC3 y la cuantificación de puntos LC3.

Evaluación de los niveles de autofagia en dos modelos diferentes de células pancreáticas utilizando inmunofluorescencia LC3

Autophagy is a specialized catabolic process that selectively degrades cytoplasmic components, including proteins and damaged organelles. Autophagy allows ...

La inmunofluorescencia CL3 permite la determinación de los niveles de autofagia en las células pancreáticas. Permite estudiar los efectos potenciales de diferentes agentes sobre la autofagia de las células pancreáticas. La inmunofluorescencia es una técnica utilizada para detectar la proteína CL3 endógena, que evita los problemas causados por la sobreexpresión de CL3, como la formación de agregados de proteínas no relacionados con la autofagia.Demostrando el procedimiento estarán Felipe Renna, graduado de doctorado, y Malena Herrera López, estudiante de doctorado del laboratorio de María Inés Vaccaro. Para comenzar la preparación de la celda, remoje los resbalones de cubierta redonda de 12 milímetros en etanol absoluto. Después de quitar la cubierta, coloque el deslizamiento de la cubierta empapado verticalmente en la placa de 24 pocillos.Exponga la placa de pocillos múltiples a la radiación ultravioleta durante 15 minutos. Luego coloque el cubreobjetos horizontalmente y lávelo con DMEM. Ahora vea el bajo número de paso de células pancreáticas, resuspendidas en DMEM, que contienen 10% FBS, penicilina y estreptomicina, e incube las células durante dos días.Dos días después de la siembra celular, prepare la solución de gemcitabina en DMEM a un microgramo por concentración de microlitro. Luego aspire la mitad del volumen de cada pocillo en un tubo separado y agregue la cantidad adecuada de solución de gemcitabina. Devolver la mitad del volumen correspondiente a cada pocillo a los pocillos tratados e incubar las células durante 24 horas.Para fijar y permeabilizar las células, agregue metanol frío en una placa de 24 pocillos que contenga células. También prepare un plato de seis pocillos con PBS frío. Usando una aguja de jeringa y pinzas, tome cada hoja de cubierta y lávela dos veces en PBS.Luego incubar en metanol durante seis minutos. Después de lavar dos veces con PBS, incubar los cubos de la cubierta en una solución de bloqueo durante una hora. Agregue un anti LC3 en la solución de bloqueo en una proporción de uno a 1000, y manténgalo en hielo.Coloque un trozo de película de sellado de laboratorio sobre la tapa de varios pocillos y agregue 25 microlitros de solución anti-LC3 por cubreobjetos sobre la película de sellado. Usando una aguja de jeringa y pinzas, coloque cada cubierta sobre la gota de anticuerpos primarios, asegurándose de que el lado celular esté en contacto con la solución. Coloque la placa de varios pocillos en la cámara de humedad.Cúbralo con papel de aluminio e incube durante la noche en la nevera. Al día siguiente, retire la placa de pocillos múltiples de la cámara de humedad. Coloque los resbalones de la cubierta en la placa de varios pocillos y lávelos con PBS tres veces.Diluya el anti-conejo marcado con fluorescencia en una solución de bloqueo en una proporción de uno a 800, y manténgalo en hielo en la oscuridad. Después de sellar la tapa de pocillos múltiples, agregue 25 microlitros de solución anticonejo por cubrebacabezas sobre la película de sellado. Y trate el deslizamiento de la cubierta con un anticuerpo secundario como se demostró anteriormente.Luego incubar la placa en la cámara de humedad durante dos horas a temperatura ambiente, protegida de la luz. Al final de la incubación con anticuerpos, lave las hojas de cubierta en la placa de pocillos múltiples con PBS tres veces. Incubar cada cuba con la solución DAPI preparada durante 10 minutos.Una vez lavado con PBS, mantenga la placa de múltiples pocillos en la oscuridad. Para el montaje celular, prepare dos vasos de precipitados con agua y un pedazo de papel. Agregue 10 microlitros de solución de PVA-DABCO por cubreobjetos en un portaobjetos.Lave la cubierta en agua y luego séquela en papel. Finalmente, colóquelo sobre la gota PVA-DABCO. Y secar durante la noche en la oscuridad.Al día siguiente, utilizando un microscopio confocal invertido, visualice las células marcadas y capture las imágenes. Después de capturar imágenes, arrastre y suelte cada archivo de imagen que contenga los canales capturados en la pantalla de Fiji. En el cuadro de diálogo, haga clic en Aceptar para abrir la imagen.A continuación, cierre la ventana de consola abierta. En la pestaña Imagen, seleccione Color y, a continuación, Dividir canales. Cierre la imagen correspondiente a los canales distintos de la imagen LC3.Luego, en la pestaña Imagen, seleccione Ajustar, seguido de Balance de color. Mueva el control deslizante máximo hacia la izquierda hasta que la imagen se sature para visualizar los contornos de la celda. Utilice la herramienta de selección a mano alzada para dibujar el contorno de la celda y haga clic en restablecer para ajustar los colores.Para cortar el elemento seleccionado en la ficha Editar, seleccione Cortar y cierre la imagen sin guardarla. Y en la pestaña Editar, seleccione pegar. En el menú Analizar, elija la herramienta Contador de objetos 3D.Establezca el umbral en 2000 y el filtro de tamaño en 50 a 500. Asegúrese de que los objetos y los cuadros de resumen estén marcados, y haga clic en OK.In la ventana de registro, el número de puntos se describirá como objetos detectados. La inmunofluorescencia indicó la distribución celular de la proteína LC3, mientras que el DAPI mostró localización nuclear en las células pancreáticas.Los puntos CL3 aumentaron significativamente bajo el tratamiento con gemcitabina, lo que indica actividad autofágica. Bajo una confluencia excesiva, las células exocrinas del páncreas tienden a acumularse y crecer una encima de la otra. El método de fijación de células de paraformaldehído fue ineficaz para preservar las proteínas LC3, ya que no reflejaba una distribución precisa.Cuando la fijación o el tratamiento se realizó sin esperar dos días después de la siembra, las células PANC1 tenían una forma redonda. Esta morfología disminuyó la relación entre el citoplasma y el núcleo, dificultando la comprensión de la distribución intracelular de la CL3. La fijación incompleta de metanol podría interferir con el inmunoetiquetado adecuado de LC3, lo que daría lugar a imágenes poco claras y a una cuantificación subóptima.Lo más importante que debe recordar durante este procedimiento es que las células deben fijarse en metanol frío durante seis minutos, en lugar de paraformaldehído. Tras este procedimiento, se puede analizar la colocalización entre CL3 y otras proteínas, permitiendo el estudio de diferentes vías moleculares relacionadas con las funciones de LC3.

Research

JoVE Journal

Biology

Monitoring Dynamic Changes In Mitochondrial Calcium Levels During Apoptosis Using A Genetically Encoded Calcium Sensor

Seguimiento de los cambios dinámicos en niveles de calcio mitocondrial de la apoptosis mediante un sensor de calcio genéticamente codificados

Dynamic changes in intracellular calcium concentration in response to various stimuli regulates many cellular processes such as proliferation, ...

Investigación

Biología

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the I&middot;Cryo Kit

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the IÃƒâ€šÃ‚Â·Cryo Kit

Criopreservación de espermatozoides de ratón y de recuperación con el I · Kit de Cryo

Thousands of new genetically modified (GM) strains of mice have been created since the advent of transgenesis and knockout technologies.  Many of these ...

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Medición de niveles hemo síntesis en células de mamífero

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

Quantitative Immunofluorescence Assay to Measure the Variation in Protein Levels at Centrosomes

Cuantitativa inmunofluorescencia Ensayo para medir la variación en los niveles de proteína en centrosomas

Centrosomes are small but important organelles that serve as the poles of mitotic spindle to maintain genomic integrity or assemble primary cilia to ...

Comparison of Three Different Methods for Determining Cell Proliferation in Breast Cancer Cell Lines

Comparación de tres diferentes métodos para determinar la proliferación celular en líneas celulares de cáncer de mama

Measuring cell proliferation can be performed by a number of different methods, each with varying levels of sensitivity, reproducibility and compatibility ...

Activating Autophagy by Aerobic Exercise in Mice

La activación de la autofagia mediante ejercicio aeróbico en ratones

Autophagy is a lysosomal degradation pathway essential for cell homeostasis, function and differentiation. Under stress conditions, autophagy is induced ...

Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing

Análisis de microbiota utilizando PCR de dos pasos y secuenciación genética de rRNA 16S de próxima generación

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the ...

Functional Assessment of Kinesin-7 CENP-E in Spermatocytes Using In Vivo Inhibition, Immunofluorescence and Flow Cytometry

Functional Assessment of Kinesin-7 CENP-E in Spermatocytes Using In Vivo Inhibition, Immunofluorescence and Flow Cytometry

Evaluación funcional de la quinesina-7 CENP-E en espermatocitos mediante inhibición in vivo , inmunofluorescencia y citometría de flujo

In eukaryotes, meiosis is essential for genome stability and genetic diversity in sexual reproduction. Experimental analyses of spermatocytes in testes ...

Analyzing Starvation-Induced Autophagy in the Drosophila melanogaster Larval Fat Body

Analyzing Starvation-Induced Autophagy in the Drosophila melanogaster Larval Fat Body

Análisis de la autofagia inducida por inanición en el cuerpo graso larvario de Drosophila melanogaster

Autophagy is a cellular self-digestion process. It delivers cargo to the lysosomes for degradation in response to various stresses, including starvation. ...

Ultrastructural Localization of Endogenous LC3 by On-Section Correlative Light-Electron Microscopy

Localización ultraestructural de LC3 endógena mediante microscopía óptica correlativa en sección

The visualization of autophagic organelles at the ultrastructural level by electron microscopy (EM) is essential to establish their identity and reveal ...