Name: evaluating autophagy levels in two different pancreatic cell models using lc3 immunofluorescence
Uploaded: 2023-04-28T13:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluating Autophagy Levels in Two Different Pancreatic Cell Models Using LC3 Immunofluorescence at JoVE.com

Detta arbete stöddes av bidrag från University of Buenos Aires (UBACyT 2018-2020 20020170100082BA), National Council for Scientific Research and Technology (CONICET) (PIP 2021-2023 GI − 11220200101549CO; och PUE 22920170100033) och National Agency for Scientific and Technological Promotion (PICT 2019-01664).

1. Förberedelse av celler
<ol><li>Blötlägg 12 mm runda täckglas i absolut etanol och placera dem vertikalt i brunnarna på en 24-brunnsplatta.</li>
	<li>Ta bort locket och utsätt flerbrunnsplattan för ultraviolett strålning i 15 minuter.</li>
	<li>Placera täckglasen horisontellt och tvätta dem med Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM).</li>
	<li>Frö ett lågt passageantal bukspottskörtelceller. Beloppet bör justeras för att erhålla 50% -75% sammanflöde på fixeringsdagen<sup class="xref...

<ol>
	<li>Grasso, D., Renna, F. J., Vaccaro, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initial+steps+in+mammalian+autophagosome+biogenesis.">Initial steps in mammalian autophagosome biogenesis.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 146 (2018).</li><li>Galluzzi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+definitions+of+autophagy+and+related+processes.">Molecular definitions of autophagy and related processes.</a> EMBO Journal. 36 (13), 1811-1836 (2017).</li><li>Kitada, M., Koya, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+in+metabolic+disease+and+ageing.">Autophagy in metabolic disease and ageing.</a> Nature Reviews Endocrinology. 17 (11), 647-661 (2021).</li><li>Ktistakis, N. T., Tooze, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digesting+the+expanding+mechanisms+of+autophagy.">Digesting the expanding mechanisms of autophagy.</a> Trends in Cell Biology. 26 (8), 624-635 (2016).</li><li>Tanida, I., Ueno, T., Kominami, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LC3+and+autophagy.">LC3 and autophagy.</a> Methods in Molecular Biology. 445, 77-88 (2008).</li><li>Kabeya, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LC3,+a+mammalian+homologue+of+yeast+Apg8p,+is+localized+in+autophagosome+membranes+after+processing.">LC3, a mammalian homologue of yeast Apg8p, is localized in autophagosome membranes after processing.</a> EMBO Journal. 19 (21), 5720-5728 (2000).</li><li>Mizushima, N., Yoshimori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+interpret+LC3+immunoblotting.">How to interpret LC3 immunoblotting.</a> Autophagy. 3 (6), 542-545 (2007).</li><li>Vanasco, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dynamics+and+VMP1-related+selective+mitophagy+in+experimental+acute+pancreatitis.">Mitochondrial dynamics and VMP1-related selective mitophagy in experimental acute pancreatitis.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 640094 (2021).</li><li>Williams, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+mechanisms+in+pancreas+and+salivary+acini.">Regulatory mechanisms in pancreas and salivary acini.</a> Annual Review of Physiology. 46, 361-375 (1984).</li><li>Mizrahi, J. D., Surana, R., Valle, J. W., Shroff, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+cancer.">Pancreatic cancer.</a> Lancet. 395 (10242), 2008-2020 (2020).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+and+function+of+autophagy+in+pancreatic+cancer.">Regulation and function of autophagy in pancreatic cancer.</a> Autophagy. 17 (11), 3275-3296 (2021).</li><li>Ropolo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+E2F1-EP300-VMP1+pathway+mediates+gemcitabine-induced+autophagy+in+pancreatic+cancer+cells+carrying+oncogenic+KRAS.">A novel E2F1-EP300-VMP1 pathway mediates gemcitabine-induced autophagy in pancreatic cancer cells carrying oncogenic KRAS.</a> Frontiers in Endocrinology. 11, 411 (2020).</li><li>Pardo, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gemcitabine+induces+the+VMP1-mediated+autophagy+pathway+to+promote+apoptotic+death+in+human+pancreatic+cancer+cells.">Gemcitabine induces the VMP1-mediated autophagy pathway to promote apoptotic death in human pancreatic cancer cells.</a> Pancreatology. 10 (1), 19-26 (2010).</li><li>Logsdon, C. D., Moessner, J., Williams, J. A., Goldfine, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucocorticoids+increase+amylase+mRNA+levels,+secretory+organelles,+and+secretion+in+pancreatic+acinar+AR42J+cells.">Glucocorticoids increase amylase mRNA levels, secretory organelles, and secretion in pancreatic acinar AR42J cells.</a> Journal of Cell Biology. 100 (4), 1200-1208 (1985).</li><li>Klionsky, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+assays+for+monitoring+autophagy+(4th+edition).">Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (4th edition).</a> Autophagy. 17 (1), 1 (2021).</li><li>Segeritz, C. -. P., Vallier, L., Jalali, M., Saldanha, F. Y. L., Jalali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+9+-+Cell+culture:+Growing+cells+as+model+systems+in+vitro.">Chapter 9 - Cell culture: Growing cells as model systems in vitro.</a> Basic Science Methods for Clinical Researchers. , 151-172 (2017).</li><li>Elliott, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+microscopy:+Principles+and+modern+practices.">Confocal microscopy: Principles and modern practices.</a> Current Protocols in Cytometry. 92 (1), 68 (2020).</li><li>Grasso, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+novel+selective+autophagy+pathway+mediated+by+VMP1-USP9x-p62,+prevents+pancreatic+cell+death.">a novel selective autophagy pathway mediated by VMP1-USP9x-p62, prevents pancreatic cell death.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (10), 8308-8324 (2011).</li><li>Ropolo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pancreatitis-induced+vacuole+membrane+protein+1+triggers+autophagy+in+mammalian+cells.">The pancreatitis-induced vacuole membrane protein 1 triggers autophagy in mammalian cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 282 (51), 37124-37133 (2007).</li><li>Karanasios, E., Stapleton, E., Walker, S. A., Manifava, M., Ktistakis, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+imaging+of+early+autophagy+events:+Omegasomes+and+beyond.">Live cell imaging of early autophagy events: Omegasomes and beyond.</a> Journal of Visualized Experiments. (77), e50484 (2013).</li><li>Kuma, A., Matsui, M., Mizushima, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LC3,+an+autophagosome+marker,+can+be+incorporated+into+protein+aggregates+independent+of+autophagy:+caution+in+the+interpretation+of+LC3+localization.">LC3, an autophagosome marker, can be incorporated into protein aggregates independent of autophagy: caution in the interpretation of LC3 localization.</a> Autophagy. 3 (4), 323-328 (2007).</li><li>Zhang, Z., Singh, R., Aschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+the+detection+of+autophagy+in+mammalian+cells.">Methods for the detection of autophagy in mammalian cells.</a> Current Protocols in Toxicology. 69, 1-26 (2016).</li><li>Yoshii, S. R., Mizushima, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+and+measuring+autophagy.">Monitoring and measuring autophagy.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (9), 1865 (2017).</li><li>Betriu, N., Andreeva, A., Semino, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erlotinib+promotes+ligand-induced+EGFR+degradation+in+3D+but+not+2D+cultures+of+pancreatic+ductal+adenocarcinoma+cells.">Erlotinib promotes ligand-induced EGFR degradation in 3D but not 2D cultures of pancreatic ductal adenocarcinoma cells.</a> Cancers. 13 (18), 4504 (2021).</li><li>Wang, W., Dong, L., Zhao, B., Lu, J., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E-cadherin+is+downregulated+by+microenvironmental+changes+in+pancreatic+cancer+and+induces+EMT.">E-cadherin is downregulated by microenvironmental changes in pancreatic cancer and induces EMT.</a> Oncology Reports. 40 (3), 1641-1649 (2018).</li><li>Kim, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+heterogeneity+and+plasticity+of+cancer+cell+migration+in+a+pancreatic+tumor+three-dimensional+culture+model.">Phenotypic heterogeneity and plasticity of cancer cell migration in a pancreatic tumor three-dimensional culture model.</a> Cancers. 12 (5), 1305 (2020).</li><li>Meng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+EpCAM+over-expression+is+associated+with+favorable+clinical+outcomes+in+pancreatic+cancer+patients+with+Hepatitis+B+virus+negative+infection.">Cytoplasmic EpCAM over-expression is associated with favorable clinical outcomes in pancreatic cancer patients with Hepatitis B virus negative infection.</a> International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 8 (12), 22204-22216 (2015).</li><li>Brock, R., Hamelers, I. H., Jovin, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+fixation+protocols+for+adherent+cultured+cells+applied+to+a+GFP+fusion+protein+of+the+epidermal+growth+factor+receptor.">Comparison of fixation protocols for adherent cultured cells applied to a GFP fusion protein of the epidermal growth factor receptor.</a> Cytometry. 35 (4), 353-362 (1999).</li></ol>

Metoden som beskrivs i detta protokoll gör det möjligt att visualisera den endogena LC3-fördelningen i cellen och kvantifiera de autofagiska nivåerna under olika förhållanden. En annan liknande metod som används för att analysera LC3-fördelningen och bestämma autofagiaktivering involverar fluorescensmärkt LC3-transfektion (såsom RFP-LC3)19. RFP-LC3-transfektion har fördelarna med att inte behöva fixeras (vilket gör det möjligt att tillämpa denna metod i levande cellavbildning<sup ...

Makroautofagi (vanligen kallad autofagi) är en specialiserad katabol process som selektivt bryter ned cytoplasmatiska komponenter, inklusive proteiner och skadade organeller 1,2. Autofagi tillåter celler att fysiologiskt reagera på stressstimuli och därmed upprätthålla cellulär homeostas3. Under autofagi bildas en dubbelmembranvesikel: autofagosomen. Autofagosomen innehåller lastmolekylerna och driver dem till lysosomen för nedbrytning 1,4.
Autofagosomer dekoreras av det autofagiska proteinmikrotubuliassocierade proteinet light chain 3 (LC3)5. När autofagi inte induceras diffunderas LC3 i cytoplasman och kärnan i LC3-I-konformationen. Å andra sidan, när autofagi induceras, konjugeras LC3 med en fosfatidyletanolamin i membranet i de autofagiska strukturerna6. Denna nya LC3-konformation är känd som LC3-II1. LC3-konformationsskiftet orsakar förändringar i dess cellulära lokalisering och dess dodecylnatriumsulfat-polyakrylamidgelelektrofores (SDS-PAGE) migration, som kan detekteras med tekniker som immunofluorescens och western blot 5,7. På detta sätt är LC3-konjugering en nyckelhändelse i den autofagiska processen som kan användas för att mäta autofagisk aktivitet.
Acinarcellen i bukspottskörteln är en mycket differentierad cell som under friska förhållanden har en låg autofagi. Men under olika fysiologiska förhållanden eller under farmakologisk stimulering kan de aktivera autofagi. Därför är bestämningen av autofagiska nivåer i denna cellinje användbar för att studera de potentiella direkta eller indirekta effekterna av olika farmakologiska eller biologiska agens på autofagi 8,9.
Duktalt adenokarcinom i bukspottskörteln är en av de dödligaste typerna av cancer, med tanke på dess sena diagnos och dess höga kemoterapiresistens10. Pankreascancerceller har hög autofagiaktivitet på grund av transkriptionell uppreglering och posttranslationell aktivering av autofagirelaterade proteiner11. Pankreascancerceller kan justera sina autofaginivåer som svar på ogynnsamma förhållanden som hypoxi, näringsbrist eller kemoterapiinducerad skada11. Därför kan analys av autofaginivåerna i bukspottskörtelcancerceller hjälpa till att förstå hur de anpassar sig till olika miljöer och utvärdera effektiviteten av autofagimodulerande behandlingar.
Denna studie visar en metod för att utföra LC3-immunofluorescens i två distinkta pankreascellulära modeller. Den första modellen, PANC-1-celler, fungerade som en modell för pankreas duktalt adenokarcinom. Dessa celler behandlades med gemcitabin, ett kemoterapimedel som tidigare har visat sig inducera autofagi, särskilt i bukspottskörtelcancerceller som bär den onkogena Kirsten rat sarkomvirusgenen (KRAS)12,13. Den andra modellen, AR42J-celler, fungerade som en mer fysiologisk modell av exokrina bukspottskörtelceller. Dessa celler differentierades med dexametason för att bli mer lik acinar pankreasceller14. I dessa celler inducerades autofagi farmakologiskt genom användning av PP242, som är en potent mTOR-hämmare15. I denna studie demonstrerar vi tillämpligheten av protokollet som beskrivs med två olika bukspottkörtelmodeller och dess förmåga att skilja mellan tillstånd av låg och hög autofagi.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10x Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>46-013-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 mm round coverslips</td>
			<td>HDA</td>
			<td>CBR_OBJ_6467</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 Well- Cell Culture Plate</td>
			<td>Sorfa</td>
			<td>220300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute ethanol</td>
			<td>Biopack</td>
			<td>2207.10.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 Donkey anti-rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R37119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Laser Scanning Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM 800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>62248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D4902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEN</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>01-052-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>NATOCOR&#160;</td>
			<td>Lintc-634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gemcitabina</td>
			<td>Eli Lilly</td>
			<td>VL7502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC3B (D11) XP Rabbit mAb</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>3868S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Anedra</td>
			<td>6197</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm &#34;M&#34; (Laboratory Sealing Film)</td>
			<td>Bemis/Curwood</td>
			<td>PM-996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Strep Solution</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>03-031-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PP242</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>SC-301606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11570626</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluating autophagy levels in two different pancreatic cell models using lc3 immunofluorescence

Autofagi är en specialiserad katabol process som selektivt bryter ned cytoplasmatiska komponenter, inklusive proteiner och skadade organeller. Autofagi tillåter celler att fysiologiskt reagera på stressstimuli och därmed upprätthålla cellulär homeostas. Cancerceller kan modulera sina autofaginivåer för att anpassa sig till negativa tillstånd som hypoxi, näringsbrist eller skador orsakade av kemoterapi. Duktalt pankreas adenokarcinom är en av de dödligaste typerna av cancer. Pankreascancerceller har hög autofagiaktivitet på grund av transkriptionell uppreglering och posttranslationell aktivering av autofagiproteiner.
Här användes PANC-1-cellinjen som en modell av humana cancerceller i bukspottskörteln, och AR42J-acinarcellinjen i bukspottskörteln användes som en fysiologisk modell av mycket differentierade däggdjursceller. Denna studie använde immunofluorescensen av mikrotubuliassocierat protein light chain 3 (LC3) som en indikator på statusen för autofagiaktivering. LC3 är ett autofagiprotein som under basala förhållanden visar ett diffust fördelningsmönster i cytoplasman (känd som LC3-I i detta tillstånd). Autofagiinduktion utlöser konjugeringen av LC3 till fosfatidyletanolamin på ytan av nybildade autofagosomer för att bilda LC3-II, ett membranbundet protein som hjälper till att bilda och expandera autofagosomer. För att kvantifiera antalet märkta autofagiska strukturer användes programvaran FIJI med öppen källkod med hjälp av verktyget "3D Objects Counter".
Måttet på autofagiska nivåer både i fysiologiska förhållanden och i cancerceller gör det möjligt för oss att studera moduleringen av autofagi under olika förhållanden såsom hypoxi, kemoterapibehandling eller knockdown av vissa proteiner.

Detta protokoll utför immunofluorescens av LC3 i pankreas cellinjer för att bestämma autofaginivåerna under olika förhållanden. Resultatet av detta experiment var obtentionen av cellulära bilder från de röda och blå kanalerna, motsvarande LC3 och DAPI. LC3-bilderna indikerar den cellulära fördelningen av detta protein, medan DAPI visar kärnlokaliseringen. Figur 2A visar en representativ bild av immunofluorescensen av LC3 och dess sammanslagning med DAPI-färgning i PANC-1-celler...

Watch this Scientific Journal Video about Evaluating Autophagy Levels in Two Different Pancreatic Cell Models Using LC3 Immunofluorescence at JoVE.com

Evaluating Autophagy Levels in Two Different Pancreatic Cell Models Using LC3 Immunofluorescence

Målet med detta protokoll är att bestämma autofagiska nivåer i bukspottskörtelcancer och acinarceller i bukspottskörteln genom LC3-immunofluorescens och LC3-punktkvantifiering.

Utvärdering av autofaginivåer i två olika pankreascellmodeller med LC3-immunofluorescens

Autophagy is a specialized catabolic process that selectively degrades cytoplasmic components, including proteins and damaged organelles. Autophagy allows ...

LC3-immunofluorescensen möjliggör bestämning av autofaginivåer i bukspottskörtelceller. Det möjliggör studier av de potentiella effekterna av olika medel på autofagi i bukspottskörtelceller. Immunofluorescens är en teknik som används för att detektera endogent LC3-protein, vilket undviker problem orsakade av överuttryck av LC3, såsom att bilda proteinaggregat som inte är relaterade till autofagi.Felipe Renna, doktorand, och Malena Herrera Lopez, doktorand från Maria Ines Vaccaros laboratorium, demonstrerar förfarandet. För att börja cellberedning, blötlägg 12 millimeter runda täckglas i absolut etanol. När du har tagit bort locket, placera det blöta locket vertikalt i plattan med 24 brunnar.Utsätt flerbrunnsplattan för ultraviolett strålning i 15 minuter. Placera sedan locket horisontellt och tvätta det med DMEM. Se nu det låga passageantalet bukspottskörtelceller, återsuspenderade i DMEM, innehållande 10% FBS, penicillin och streptomycin, och inkubera cellerna i två dagar.Två dagar efter cellsådd, bereds gemcitabinlösning i DMEM vid ett mikrogram per mikroliter koncentration. Aspirera sedan halva volymen från varje brunn i ett separat rör och tillsätt lämplig mängd gemcitabinlösning. Sätt tillbaka den halva volymen för varje brunn i de behandlade brunnarna och inkubera cellerna i 24 timmar.För fixering och permeabilisering av cellerna, tillsätt kall metanol i en 24-brunnsplatta innehållande celler. Förbered också en sexbrunnsplatta med kall PBS. Använd en sprutnål och pincett, ta varje täcke och tvätta den två gånger i PBS.Inkubera sedan i metanol i sex minuter. Efter tvättning två gånger med PBS, inkubera locket glider i en blockeringslösning i en timme. Tillsätt en anti LC3 i blockeringslösningen i förhållandet en till 1000 och håll den på is.Placera en bit laboratorietätningsfilm över locket med flera brunnar och tillsätt 25 mikroliter anti-LC3-lösning per täcke över tätningsfilmen. Använd en sprutnål och pincett och placera varje lock över det primära antikroppsdroppen, så att cellsidan är i kontakt med lösningen. Placera flerbrunnsplattan i fuktighetskammaren.Täck den med folie och inkubera över natten i kylen. Nästa dag, ta bort multibrunnplattan från fuktighetskammaren. Placera locket glider tillbaka på flerbrunnsplattan och tvätta dem med PBS tre gånger.Späd fluorescerande märkt anti-kanin i blockerande lösning i ett förhållande av en till 800 och håll på is i mörkret. Efter tätning av locket med flera brunnar, tillsätt 25 mikroliter anti-kaninlösning per täcke över tätningsfilmen. Och behandla täckglaset med en sekundär antikropp som tidigare visats.Inkubera sedan plattan i fuktighetskammaren i två timmar vid rumstemperatur, skyddad från ljus. Vid slutet av inkubation med antikropp, tvätta locket på flerbrunnsplattan med PBS tre gånger. Inkubera varje täckglas med den beredda DAPI-lösningen i 10 minuter.När du har tvättat med PBS, behåll flerbrunnsplattan i mörkret. För cellmontage, förbered två bägare med vatten och ett papper. Tillsätt 10 mikroliter PVA-DABCO-lösning per täckglas på ett objektglas.Tvätta locket i vatten och torka det sedan på papper. Slutligen placera den över PVA-DABCO-droppen. Och torka över natten i mörkret.Nästa dag, med hjälp av ett inverterat konfokalmikroskop, visualisera de märkta cellerna och fånga bilderna. Efter att ha tagit bilder, dra och släpp varje bildfil som innehåller de fångade kanalerna på Fiji-skärmen. Klicka på OK i dialogrutan för att öppna bilden.Stäng sedan det öppnade konsolfönstret. På fliken Bild väljer du Färg och sedan Dela kanaler. Stäng bilden som motsvarar andra kanaler än LC3-bilden.På fliken Bild väljer du sedan Justera följt av Färgbalans. Flytta det maximala skjutreglaget åt vänster tills bilden mättas för att visualisera cellkonturerna. Använd markeringsverktyget på frihand för att rita cellkonturen och klicka på Återställ för att justera färgerna.Om du vill klippa ut det markerade objektet från fliken Redigera väljer du Klipp ut och stänger bilden utan att spara den. Och på fliken Redigera väljer du klistra in. I menyn Analysera väljer du verktyget 3D-objekträknare.Ställ in tröskelvärdet på 2000 och storleksfiltret på 50 till 500. Se till att objekten och sammanfattningsrutorna är markerade och klicka på OK.In loggfönstret kommer antalet punkter att beskrivas som upptäckta objekt. Immunofluorescensen indikerade cellulär distribution av LC3-protein, medan DAPI visade nukleär lokalisering i bukspottskörtelceller.LC3-punkterna ökade signifikant under gemcitabinbehandling, vilket indikerar autofagisk aktivitet. Under en överdriven sammanflöde tenderar de exokrina bukspottkörtelcellerna att stapla upp och växa ovanpå varandra. Paraformaldehydcellfixeringsmetoden var ineffektiv för att bevara LC3-proteiner, eftersom den inte återspeglade korrekt fördelning.När fixering eller behandling utfördes utan att vänta två dagar efter sådd hade PANC1-cellerna en rund form. Denna morfologi minskade förhållandet mellan cytoplasman och kärnan, vilket gjorde det svårt att förstå den intracellulära fördelningen av LC3. Ofullständig metanolfixering kan störa korrekt LC3-immunmärkning, vilket leder till oklara bilder och suboptimal kvantifiering.Det viktigaste att komma ihåg under denna procedur är att cellerna måste fixeras i kall metanol i sex minuter, istället för paraformaldehyd. Efter denna procedur kan samlokalisering mellan LC3 och andra proteiner analyseras, vilket möjliggör studier av olika molekylära vägar relaterade till LC3-funktioner.

Research

JoVE Journal

Biology

Monitoring Dynamic Changes In Mitochondrial Calcium Levels During Apoptosis Using A Genetically Encoded Calcium Sensor

Övervakning dynamiska förändringar i mitokondriernas kalciumnivåer under apoptos Använda en genetiskt kodade Kalcium Sensor

Dynamic changes in intracellular calcium concentration in response to various stimuli regulates many cellular processes such as proliferation, ...

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the I&middot;Cryo Kit

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the IÃƒâ€šÃ‚Â·Cryo Kit

Mus Spermier Frysförvaring and Recovery med I · Cryo Kit

Thousands of new genetically modified (GM) strains of mice have been created since the advent of transgenesis and knockout technologies.  Many of these ...

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Mätning av hemsyntesen nivåer i däggdjursceller

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

Quantitative Immunofluorescence Assay to Measure the Variation in Protein Levels at Centrosomes

Kvantitativ Immunofluorescens analys för att mäta variationen i proteinnivåer vid Centrosomes

Centrosomes are small but important organelles that serve as the poles of mitotic spindle to maintain genomic integrity or assemble primary cilia to ...

Comparison of Three Different Methods for Determining Cell Proliferation in Breast Cancer Cell Lines

Jämförelse av tre olika metoder för bestämning av cellproliferation i bröstcancercellinjer

Measuring cell proliferation can be performed by a number of different methods, each with varying levels of sensitivity, reproducibility and compatibility ...

Activating Autophagy by Aerobic Exercise in Mice

Aktivera Autophagy av aerob träning hos möss

Autophagy is a lysosomal degradation pathway essential for cell homeostasis, function and differentiation. Under stress conditions, autophagy is induced ...

Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing

Microbiota analys med två steg PCR och nästa generations 16S rRNA Gene sekvensering

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the ...

Functional Assessment of Kinesin-7 CENP-E in Spermatocytes Using In Vivo Inhibition, Immunofluorescence and Flow Cytometry

Functional Assessment of Kinesin-7 CENP-E in Spermatocytes Using In Vivo Inhibition, Immunofluorescence and Flow Cytometry

Funktionell bedömning av kinesin-7 CENP-E i spermatocyter med användning av in vivo-hämning, immunofluorescens och flödescytometri

In eukaryotes, meiosis is essential for genome stability and genetic diversity in sexual reproduction. Experimental analyses of spermatocytes in testes ...

Analyzing Starvation-Induced Autophagy in the Drosophila melanogaster Larval Fat Body

Analyzing Starvation-Induced Autophagy in the Drosophila melanogaster Larval Fat Body

Analys av svältinducerad autofagi i Drosophila melanogaster Larval Fat Body

Autophagy is a cellular self-digestion process. It delivers cargo to the lysosomes for degradation in response to various stresses, including starvation. ...

Ultrastructural Localization of Endogenous LC3 by On-Section Correlative Light-Electron Microscopy

Ultrastrukturell lokalisering av endogen LC3 med korrelativ ljuselektronmikroskopi på snitt

The visualization of autophagic organelles at the ultrastructural level by electron microscopy (EM) is essential to establish their identity and reveal ...