Name: assessment of chemical toxicity in adult drosophila melanogaster
Uploaded: 2023-03-24T14:00:00
Duration: 7 min 2 s
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Ringraziamo il nostro staff per l'aiuto con il test e l'ottimizzazione di questo protocollo: Ameya Belamkar, Marilyn Clark, Alexander Fitt, Emma Rose Gallant, Ethan Golditch, Matthew Lowe, Morgan Marsh, Kyle McClung, Andy Puga, Darcy Rose, Cameron Stockbridge e Noelle Zolman. Ringraziamo anche i nostri colleghi del Precision Toxicology Group, in particolare le nostre controparti dell'Exposure Group, per aver contribuito a identificare gli obiettivi del protocollo.
Questo progetto ha ricevuto finanziamenti dal programma di ricerca e innovazione Horizon 2020 dell'Unione Europea nell'ambito dell'accordo di sovvenzione n. 965406. Il lavoro presentato in questa pubblicazione è stato eseguito nell'ambito del cluster ASPIS. Questo risultato riflette solo le opinioni degli autori e l'Unione europea non può essere ritenuta responsabile per qualsiasi uso che possa essere fatto delle informazioni in esso contenute. Questa pubblicazione è stata resa possibile anche grazie al supporto dell'Indiana Clinical and Translational Sciences Institute, che è finanziato in parte dal premio numero UL1TR002529 del National Institutes of Health, National Center for Advancing Translational Sciences, Clinical and Translational Sciences Award. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente il punto di vista ufficiale del National Institutes of Health. Parti di questo progetto sono state sostenute da fondi dell'Università dell'Indiana assegnati al JRS e al consorzio PhyloTox. JMH ed EMP sono stati supportati dal premio NIH P40OD018537 al Bloomington Drosophila Stock Center.

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United States Environmental Protection Agency Available from: <a target="_blank" href="https://www.epa.gov/bmds/download-bmds">https://www.epa.gov/bmds/download-bmds</a> (2022)</li><li>Ortiz, J. G., Opoka, R., Kane, D., Cartwright, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+arsenic+susceptibility+from+a+genetic+perspective+in+Drosophila+reveals+a+key+role+for+glutathione+synthetase.">Investigating arsenic susceptibility from a genetic perspective in Drosophila reveals a key role for glutathione synthetase.</a> Toxicological Sciences. 107 (2), 416-426 (2009).</li><li>Pickett, A. D., Patterson, N. 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Nessun conflitto di interessi da divulgare.

Il moscerino della frutta Drosophila melanogaster sta emergendo come un potente sistema per i NAM16,18,19,21. Sfruttando le impareggiabili risorse genetiche disponibili per la comunità dei moscerini, combinate con i recenti progressi nella genomica e nella metabolomica, gli studi di sicurezza chimica che utilizzano Drosophila sono in grado di identificare rapidamente i meccanismi molecolari attraverso i quali i singoli composti interferiscono con il metabolismo, la fisiologia e la segnalazione cellulare (ad esempio, vedi39). Questo protocollo economico è progettato per definire rapidamente le curve dose-risposta e successivamente generare campioni per l'analisi dell'RNA-seq e della metabolomica. Inoltre, questo protocollo flessibile può essere adattato per l'uso con qualsiasi genotipo e può ospitare molte classi di sostanze chimiche.
Un aspetto notevole di questo protocollo è la scelta del cibo liquido utilizzato nell'esposizione chimica, che si basa su uno studio precedente, ma differisce dai terreni solidi utilizzati dalla maggior parte degli studi tossicologici di Drosophila 18,22. Questo specifico mezzo liquido è stato selezionato per riflettere il contenuto nutrizionale del mezzo BDSC standard e solido che le mosche sono anche alimentate in questo protocollo, per garantire che le mosche ricevano un'alimentazione coerente. La semplicità dei mezzi di alimentazione liquidi ha molti vantaggi. I mezzi liquidi sono più facili da maneggiare rispetto agli alimenti solidi, che devono essere fusi e risolidificati o ricostituiti dalla polvere. I fluidi liquidi aumentano anche la produttività del sistema, garantiscono una distribuzione uniforme delle sostanze chimiche in tutti i mezzi di alimentazione e riducono il tempo impiegato per lavorare con composti pericolosi. Inoltre, il fluido non richiede soluzioni da riscaldare, il che facilita il test dei composti di prova volatili. Infine, a causa dei relativamente pochi componenti inclusi nella soluzione alimentare, le reazioni collaterali indesiderate sono ridotte al minimo tra la sostanza chimica in esame e altri componenti dietetici. Anche il lievito utilizzato nel cibo è inattivo, limitando ulteriormente la reattività del mezzo di alimentazione. Tuttavia, si noti che il metodo non è adatto per testare la tossicità dello sviluppo o larvale.
Alcuni dei materiali utilizzati nel protocollo possono essere sostituiti, come l'uso di fiale di mosca di vetro piuttosto che di polipropilene. Tuttavia, i materiali utilizzati sono stati selezionati per essere sia inerti che usa e getta per evitare reazioni chimiche indesiderate tra i reagenti e le esposizioni chimiche che potrebbero derivare dalla pulizia della vetreria.
L'uso di alimenti liquidi richiede un veicolo per la consegna di cibo. La carta da filtro in acetato di cellulosa è stata scelta per questo scopo per la sua flessibilità e natura inerte28. Altri ricercatori hanno utilizzato protocolli simili ma con altri veicoli, come salviette delicate o filtri in fibra di vetro29,30. La carta da filtro in acetato di cellulosa è adatta a queste esigenze perché è un veicolo inerte che può essere tagliato nella forma ideale per inserirlo nel fondo delle fiale di mosca senza grandi spazi tra la carta e la parete della fiala, evitando la morte a causa delle mosche che rimangono bloccate nei mezzi o nel veicolo stesso.
Un importante limite di questo sistema è che la concentrazione massima verificabile di una sostanza chimica è legata alla solubilità della sostanza chimica. I composti non solubili in acqua richiedono un solvente aggiuntivo, che può portare a effetti aggiuntivi o sinergici con la sostanza chimica di interesse. Ciò può anche creare situazioni in cui non è possibile preparare soluzioni madre sufficientemente concentrate per raggiungere l'endpoint desiderato in tutti gli organismi, limitando quindi l'analisi dei dati risultanti31. Per risolvere questo problema, le sostanze chimiche con bassa solubilità in acqua possono essere testate aggiungendo fino allo 0,5% di dimetilsolfossido alla soluzione alimentare. Altri solventi potrebbero essere utilizzati, ma sono necessarie ulteriori ricerche per ciascun solvente di interesse per determinare la concentrazione massima accettabile di solvente all'interno della soluzione per massimizzare la solubilità riducendo al minimo gli effetti del solvente sull'organismo.
Un'ampia caratterizzazione della risposta olfattiva nella Drosophila ha descritto come le mosche evitano di consumare composti tossici40,41, portando a una riduzione dell'alimentazione sui terreni trattati. Il test del colorante blu affronta questo fenomeno consentendo ai ricercatori di esaminare in modo efficiente i comportamenti di alimentazione delle mosche alimentate con ogni concentrazione di sostanza chimica sperimentale42,43,44. La presenza o l'assenza di blu nel tratto gastrointestinale della mosca indica se la mosca ha mangiato il mezzo contenente sostanze tossiche. Sebbene esistano metodi più sofisticati per valutare i comportamenti di alimentazione delle mosche, come il Fly Liquid-Food Interaction Counter45, questo metodo qualitativo è più adatto per lo screening a più alto rendimento.
Un aspetto notevole di questo protocollo è che è stato ottimizzato per un periodo di esposizione di 48 ore senza la necessità di trasferire mosche o aggiungere ulteriore liquido alla fiala di esposizione. L'uso di una camera di umidità e il posizionamento delle camere in un incubatore mantenuto ad alta umidità hanno impedito alla carta da filtro contenente il mezzo di alimentazione di asciugarsi durante questo lasso di tempo. Il protocollo può essere adattato per periodi di esposizione più lunghi, ma il metodo deve essere adattato per garantire che la carta da filtro non si asciughi e causi cambiamenti significativi nella concentrazione della soluzione o nella letalità dovuta all'essiccazione.
Infine, una caratteristica importante di questo protocollo è che può facilmente ospitare varianti genetiche, il che consente ai ricercatori di utilizzare la vasta gamma di strumenti genetici per Drosophila per espandere questi studi preliminari su organismi wild-type per comprendere meglio i meccanismi di azione chimica in vivo. A questo proposito, il protocollo sopra descritto potrebbe essere facilmente modificato per integrare un protocollo JoVE precedentemente descritto da Peterson e Long che consente l'analisi tossicologica delle mosche catturate in natura18.
A causa dell'ampia varietà di studi precedenti sulla tossicità dell'arsenito di sodio in Drosophila 32,33,34,35,36, le mosche Oregon-R sono state trattate con questo composto per dimostrare l'efficacia del nostro sistema. I moscerini maschi hanno mostrato un LD 50 di 0,65 mM e le femmine hanno mostrato un LD50 di 0,90 mM. Ciò si allinea con studi precedenti sulla Drosofila adulta adulta trattata con arsenito di sodio. Ad esempio, Goldstein e Babich37 hanno scoperto che il 50% delle mosche (sessi misti) è morto dopo 7 giorni di esposizione a 0,5 mM NaAsO2. Sebbene questa sia una dose leggermente inferiore a quella attualmente osservata, le differenze tra i loro metodi e questo metodo (compreso l'uso di mezzi di esposizione solidi, una scala temporale più lunga e sessi misti) probabilmente spiegano questa differenza. È importante sottolineare che entrambi i metodi hanno portato a valori LD50 complessivamente simili.
Le osservazioni degli esperimenti che utilizzano questo protocollo possono essere utilizzate per trovare bersagli genetici e molecolari per successivi studi comportamentali o meccanicistici. Il metodo di esposizione può anche essere usato per trattare Drosophila per il campionamento per la metabolomica e la proteomica, rendendo questo protocollo adatto al crescente campo della tossicologia di precisione (modellato dal campo della medicina di precisione46). A questo proposito, le mosche esposte possono essere raccolte dopo la fase 8 per la successiva analisi genomica e metabolomica. I campioni raccolti nella fase 8 possono quindi essere elaborati, come descritto da Li e Tennessen47, a partire dalla fase 3.
In definitiva, i dati acquisiti dagli esperimenti sopra descritti, così come tutti i successivi dati di metabolomica e proteomica, sarebbero idealmente utilizzati nei confronti tra specie. Come notato in precedenza26, tali studi interspecie sono potenti e in grado di determinare come le singole sostanze chimiche interferiscono con i percorsi biologici conservati. Pertanto, il protocollo sopra descritto può essere utilizzato per trovare punti in comune evolutivi in risposta a singoli tossici attraverso i phyla e contribuire a informare la regolamentazione della sicurezza chimica.

Gli esseri umani sono costantemente esposti a sostanze chimiche provenienti da una varietà di fonti, tra cui aria1, cibo2, acqua3,4, farmaci5, detergenti6, prodotti per la cura personale 7, prodotti chimici industriali 7 e materiali da costruzione 7. Inoltre, ogni anno vengono introdotte migliaia di nuove sostanze chimiche8, molte delle quali non sono adeguatamente controllate per la salute e la sicurezza ambientale. Questa mancanza di adeguati test di sicurezza chimica deriva in parte da un'eccessiva dipendenza da modelli di mammiferi, come topi e ratti. Mentre tali modelli di roditori sono informativi, i test di sicurezza chimica in questi sistemi sono costosi, richiedono tempo e spesso causano livelli inaccettabili di sofferenza all'animale da esperimento9.
Gli oneri finanziari ed etici associati ai test di sicurezza chimica sui mammiferi, nonché la natura dispendiosa in termini di tempo degli studi sui mammiferi, sono i principali fattori che contribuiscono alla scarsità di dati che circondano le nuove sostanze chimiche. Per affrontare questo problema, l'Agenzia per la protezione dell'ambiente degli Stati Uniti (EPA), l'Agenzia europea per le sostanze chimiche (ECHA), Health Canada e altre agenzie stanno attuando misure che incorporano metodologie di nuovo approccio (NAM) nei quadri normativi10, ponendo così la politica nordamericana ed europea in linea con gli obiettivi internazionali di sostituire, ridurre e perfezionare l'uso di animali (il principio delle 3R)11, 12,13,14. I NAM comprendono una varietà di saggi basati principalmente su modelli in vitro e in silico che forniscono una comprensione meccanicistica della tossicità chimica invece di osservare le avversità inflitte alle specie di test sui mammiferi, aumentando così il tasso di generazione dei dati per la valutazione del rischio chimico pur producendo risultati ad alta fedeltà15. Tuttavia, questi metodi non hanno ancora dimostrato di salvaguardare dalla tossicità sistemica, compresa l'interruzione dei processi biologici vitali che coinvolgono la comunicazione interorgano e la segnalazione endocrina. Inoltre, non possono spiegare il bioaccumulo di sostanze chimiche all'interno di tessuti specifici, la capacità dei singoli composti di essere assorbiti e secreti e l'interazione tra comportamento ed esposizione chimica.
A causa dei limiti dei modelli in vitro e computazionali, l'uso efficace dei NAM per ridurre o sostituire i modelli di mammiferi dovrebbe includere anche modelli invertebrati in vivo, come il moscerino della frutta, Drosophila melanogaster. Precedenti studi sulla mosca hanno dimostrato che questo organismo è adatto per studiare i percorsi genetici conservati che proteggono le cellule animali dalle molecole tossiche 16,17,18,19,20,21,22. Inoltre, la mosca mostra una notevole somiglianza genetica con l'uomo, compresi gli omologhi funzionali di oltre il 65% delle malattie umane 23,24,25 e una conservazione ancora maggiore di importanti vie funzionali 26. Queste caratteristiche, combinate con il loro ciclo di vita relativamente breve, i bassi costi di manutenzione e le risposte comportamentali prontamente osservabili, rendono Drosophila adatta per l'uso come modello tossicologico27,28,29,30. Inoltre, le mosche hanno un rendimento molto più elevato rispetto ai modelli di roditori e catturano effetti sul metabolismo, sulla fisiologia e sulla segnalazione ormonale che non sono facilmente rilevabili da altri NAM non organismici9.
Il protocollo qui descritto rappresenta un quadro per testare gli effetti dell'esposizione chimica sulla Drosophila adulta. Il metodo è progettato per essere efficiente, economico e riproducibile, riducendo al minimo il tempo che i ricercatori devono essere in contatto con la sostanza chimica in esame e accogliendo la raccolta di campioni per la metabolomica e altri approcci omici. Il protocollo è ottimizzato per testare una singola sostanza chimica per esperimento, ma può facilmente adattarsi ad altri parametri sperimentali, come solventi vari o combinazioni di sostanze chimiche.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 inch flower lever action craft punch</td>
			<td>Bira Craft</td>
			<td>HCP-115-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Centrifuge Tubes&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-666</td>
			<td>High-Performance Centrifuge Tubes with Flat or Plug Caps, Polypropylene, 15 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 ml Tubes&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16466-044</td>
			<td>Micro Centrifuge Tube with Flat Screw-Cap, conical bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml Tubes&#160;</td>
			<td>VWR&#160;</td>
			<td>60818-576</td>
			<td>Culture Tubes, Plastic, with Dual-Position Caps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge Tubes&#160;</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>430290</td>
			<td>50 mL polypropylene centrifuge tubes, conical bottom with plug seal cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchmark Dose Software version 3.2</td>
			<td>U.S. Environmental Protection Agency</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cardboard trays</td>
			<td>Genesee Scientific flystuff</td>
			<td>32-122</td>
			<td>trays and dividers for narrow vials&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 gas pads</td>
			<td>Genesee Scientific flystuff</td>
			<td>59-114</td>
			<td>FlyStuff flypad, CO2 anesthetizing apparatus&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Combitips advanced, 50 mL</td>
			<td>Eppendorf&#160;</td>
			<td>0030089693</td>
			<td>Combitips&#160;advanced, Biopur, 50&#160;mL, light gray, colorless tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton balls</td>
			<td>Genesee Scientific flystuff</td>
			<td>51-101</td>
			<td>Cotton balls, large, fits narrow vials&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delicate task wipes</td>
			<td>Kimtech</td>
			<td>34155</td>
			<td>Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipes, 1 Ply / 8.2&#34; x 4.39&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila Vial Plugs, Cellulose Acetate (aka, Flugs)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89168-888</td>
			<td>Wide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FD&#38;C Blue No. 1</td>
			<td>Spectrum Chemical</td>
			<td>FD110</td>
			<td>CAS number 3844-45-9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flies&#160;</td>
			<td>BDSC</td>
			<td>Stock #2057&#160;</td>
			<td>OregonR wildtype&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gloves (nitrile)</td>
			<td>Kimtech</td>
			<td>55082/55081/55083</td>
			<td>Kimtech purple nitrile exam gloves, 5.9 mil, ambidextrous 9.5&#34;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grade 1 CHR cellulose chromatography paper</td>
			<td>Cytvia</td>
			<td>3001-917</td>
			<td>Sheet, 46 x 57 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mesh for humidity chamber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multipette / Repeater (X) stream&#160;</td>
			<td>Eppendorf&#160;</td>
			<td>022460811</td>
			<td>Repeater Xstream&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic grate</td>
			<td>Plaskolite</td>
			<td>18469 (from lowes)</td>
			<td>Plaskolite 24 in x 48 in 7.85 sq ft louvered ceiling light panels, cut down to fit in rubbermaid tubs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic trays for glass vials</td>
			<td>Genesee Scientific flystuff</td>
			<td>59-207</td>
			<td>Narrow fly vial reload tray&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene Drosophila Vial</td>
			<td>VWR</td>
			<td>75813-156</td>
			<td>Wide (28.5 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubbermaid tubs</td>
			<td>Rubbermaid</td>
			<td>3769017 (from Lowes)</td>
			<td>Rubbermaid Roughneck Tote 10 gallon 18&#34; L x 12&#34; W x 8 1/2&#34; H</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose ultra pure</td>
			<td>MP Biomedicals, Inc.</td>
			<td>821721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube racks for wide-mouthed tubes</td>
			<td>Thermo scientific&#160;</td>
			<td>5970-0230</td>
			<td>Nalgene Unwire Test tube racks, for 30 mm tubes&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Purification System</td>
			<td>Millipore Milli-Q</td>
			<td>ZMQ560F01</td>
			<td>Millipore Milli-Q Biocel Water Purifier&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>451120050</td>
			<td>CAS number 84604-16-0</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of chemical toxicity in adult drosophila melanogaster

Le industrie umane generano centinaia di migliaia di sostanze chimiche, molte delle quali non sono state adeguatamente studiate per la sicurezza ambientale o gli effetti sulla salute umana. Questo deficit di informazioni sulla sicurezza chimica è esacerbato dagli attuali metodi di test nei mammiferi che sono costosi, laboriosi e richiedono molto tempo. Recentemente, scienziati e regolatori hanno lavorato per sviluppare nuove metodologie di approccio (NAM) per i test di sicurezza chimica che sono più economici, più rapidi e riducono la sofferenza degli animali. Uno dei NAM chiave che emergono è l'uso di organismi invertebrati come sostituti dei modelli di mammiferi per chiarire le modalità chimiche di azione conservate in specie lontanamente imparentate, compresi gli esseri umani. Per far avanzare questi sforzi, qui, descriviamo un metodo che utilizza il moscerino della frutta, Drosophila melanogaster, per valutare la sicurezza chimica. Il protocollo descrive una procedura semplice, rapida ed economica per misurare la vitalità e il comportamento alimentare delle mosche adulte esposte. Inoltre, il protocollo può essere facilmente adattato per generare campioni per approcci genomici e metabolomici. Nel complesso, il protocollo rappresenta un importante passo avanti nella definizione di Drosophila come modello standard per l'uso nella tossicologia di precisione.

La mosca è servita a lungo come modello negli studi per determinare la tossicità dell'arsenito di sodio (NaAsO2)35,36,37,38. Per dimostrare l'efficacia del protocollo, moscerini maschi e femmine sono stati esposti a NaAsO2, con l'obiettivo di confrontare questi risultati con studi precedenti. Utilizzando la metodologia sopra descritta, maschi e femmine adulti Oregon-R (BDSC stock #2057) sono stati esposti a una gamma di concentrazioni di NaAsO 2 (0, 0,01, 0,02, 0,1, 0,2, 1 e2 mM) e hanno ottenuto un punteggio per la letalità 48 ore dopo l'inizio dell'esposizione (Figura 1A, B).
Lo scopo di questa analisi iniziale era quello di identificare l'intervallo approssimativo di concentrazioni che avrebbe permesso una caratterizzazione più precisa della tossicità di NaAsO2. Negli esperimenti successivi, sono state selezionate concentrazioni (0, 0,2, 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5 e 5 mM) che hanno definito più precisamente la curva dose-risposta NaAsO2 (Figura 1C, D). Si noti che l'analisi risultante ha esaminato diverse concentrazioni che hanno indotto il 100% di letalità. I dati sono stati analizzati utilizzando il software Benchmark Dose Software dell'Environmental Protection Agency, disponibile al pubblico, versione 3.2.0.125. I dati sono stati modellati come "dicotomici" e il modello di Hill dicotomico è stato utilizzato per analisi successive. Sulla base di questo modello, i LD 10, LD25 e LD50 finali dei moscerini maschi alimentati con NaAsO2 erano rispettivamente 0,30 mM, 0,50 mM e 0,65 mM. Per le mosche femmine, questi valori erano leggermente più alti, con un LD10 di 0,30 mM, un LD25 di 0,65 mM e un LD50 di 0,90 mM. Nel complesso, i valori ottenuti con questo metodo sono simili a quelli precedentemente riportati per la tossicità da arsenico nella Drosophila melanogaster35,36,37,38, convalidando così la metodologia.
Oltre alle sei repliche utilizzate per calcolare la curva dose-risposta, i moscerini maschi e femmine sono stati alimentati anche con soluzioni di esposizione a NaAsO2 contenenti l'1% di blu FD & C, che è facilmente visibile nel tratto digestivo utilizzando la microscopia ottica. Sulla base della presenza di colorante blu all'interno dell'intestino delle mosche alimentate con NaAsO 2, sia i moscerini maschi che le femmine hanno continuato a nutrirsi 24 ore dopo l'inizio dell'esposizione chimica, indipendentemente dalla concentrazione di NaAsO 2 presente all'interno dei mezzi liquidi (Figura 2). Tuttavia, è stato osservato che il cibo ingerito veniva occasionalmente rigurgitato a dosi superiori a 0,2 mM per le femmine e 0,5 mM per i maschi (Figura 2). Questi risultati suggeriscono che il rigurgito potrebbe svolgere un ruolo chiave nella risposta della Drosophila all'avvelenamento da arsenico.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65029/65029fig01.jpg"> Figura 1: Curve dose-risposta per Drosophila maschio e femmina trattati con NaAsO2 per 48 ore. Tutti i grafici mostrano le proporzioni stimate di mosche morte ad ogni concentrazione di NaAsO2 testata sulla base del modello di Dichotomous Hill. (A,B) È stata testata un'ampia gamma di concentrazioni di NaAsO2 per approssimare la dose alla quale ogni sesso di mosca inizia a morire. (A) mostra i dati maschili e (B) mostra i dati femminili. N = 4 flaconcini, con 20 mosche per flaconcino. (C,D) È stata testata una gamma più ristretta di concentrazioni di NaAsO2 per determinare dosi precise alle quali sono morti il 10%, il 25% e il 50% di ciascun sesso di mosche. Queste dosi sono indicate a destra di ciascun grafico. (C) mostra i dati maschili e (D) mostra i dati femminili. N = 6 flaconcini, con 20 mosche per flaconcino. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65029/65029fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65029/65029fig02.jpg"> Figura 2: Risultati rappresentativi del test del colorante blu di Drosophila maschile e femminile trattati con NaAsO2 per 24 ore. Le micrografie mostrano mosche alimentate con concentrazioni crescenti di NaAsO2. La riga (A) mostra mosche maschili, e la riga (B) mostra mosche femmine, con la concentrazione di NaAsO2 che aumenta da sinistra a destra. L'addome mostra una piccola quantità di blu vicino al torace a basse concentrazioni, indicando che i mezzi di esposizione sono entrati nell'intestino. A concentrazioni più elevate, il colorante blu inizia ad accumularsi intorno alla bocca, suggerendo che i mezzi di esposizione vengono rigurgitati. La barra della scala è di 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65029/65029fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Assessment of Chemical Toxicity in Adult Drosophila Melanogaster

Questo protocollo descrive un metodo efficiente ed economico che utilizza mezzi liquidi per valutare gli effetti delle sostanze chimiche tossiche sulla vitalità della Drosophila melanogaster adulta.

Valutazione della tossicità chimica nella Drosophila melanogaster adulta

Human industries generate hundreds of thousands of chemicals, many of which have not been adequately studied for environmental safety or effects on human ...

Il protocollo rappresenta un passo importante per stabilire la drosophila come modello standard per i test di sicurezza chimica e per lo sviluppo di nuove metodologie di approccio comunemente chiamate NAM. Il protocollo descrive un metodo efficiente e poco costoso che utilizza mezzi liquidi per valutare gli effetti di una sostanza chimica tossica sulla vitalità della drosophila melanogaster adulta. Inizia impilando quattro fogli di carta cromatografica di cellulosa di grado uno e tagliandoli in strisce larghe due pollici.Perforare gli inserti di carta da filtro a forma di fiore utilizzando un punzone di carta da 1,5 pollici contenente un colorante a forma di fiore. Spingere la pila di carta da filtro sul fondo di una fiala di polipropilene di 28,5 millimetri di diametro utilizzando un tassello di legno non verniciato da 22 x 220 millimetri. Assicurarsi che la pila sia posizionata saldamente nella parte inferiore del flaconcino.Conservare i flaconcini preparati in vassoi di plastica o cartone e posizionare i vassoi in grandi sacchetti di plastica fino all'uso. Aprire il flaconcino di vetro contenente le mosche, posizionarlo sulla bocca del flaconcino di plastica preparato e trasferire le mosche abbinate al sesso ordinato alla fiala di fame picchiettando il fondo della fiala di plastica contro un banco. Chiudere la fiala di plastica con un tappo di acetato di cellulosa o un colpo di fortuna e registrare eventuali mosche perse in questo trasferimento.Segna le fiale di fame contenenti mosche femmine con una striscia. Per evitare la miscelazione accidentale, lasciare i flaconcini con le mosche postali non contrassegnate. Preparare la camera di umidità per l'esposizione notturna posizionando sei tovaglioli di carta standard sul fondo.Quindi immergere i tovaglioli di carta con 100 millilitri di acqua e posizionare la griglia di plastica sopra gli asciugamani bagnati per assicurarsi che le fiale non entrino in contatto con gli asciugamani di carta saturi. Dopo aver posizionato i vassoi delle fiale di fame in posizione orizzontale all'interno della camera di umidità, trasferire la camera di umidità in un'incubatrice a 25 gradi Celsius per l'incubazione notturna. Per preparare i flaconcini di esposizione chimica, trasferire quattro flaconcini di moscerini femmina affamati contenenti 20 moscerini per flaconcino a quattro flaconcini di esposizione di ciascuna concentrazione chimica.Etichettare questi flaconcini come femminili. Preparare flaconcini di esposizione chimica contenenti colorante blu trasferendo una fiala di mosche femmine affamate in una fiala di esposizione blu per ogni concentrazione chimica. Etichettare questo flaconcino come femmina.Registrare il numero di mosche presenti in ogni fiala dopo il trasferimento e annotare il numero di mosche morte o fuggite. Normalmente, tutte e 20 le mosche dovrebbero sopravvivere durante la notte alla fame e al trasferimento. Posizionare i flaconcini di esposizione orizzontalmente in una camera di umidità appena preparata prima di posizionare la camera in un'incubatrice a 25 gradi Celsius con circa il 60% di umidità e un ciclo di luce da 12 a 12 ore è al buio.Esaminare i flaconcini di esposizione 24 e 48 ore dopo l'inizio dell'esposizione chimica. Contare e registrare le mosche morte in ogni fiala in ogni punto temporale. Per determinare se le mosche esposte hanno consumato i mezzi di esposizione blu nelle fiale di esposizione blu dopo 24 ore dall'esposizione chimica, esaminare le pareti del flaconcino per le indicazioni di feci blu che appaiono come piccoli punti sul lato della fiala di esposizione e del flug.Quindi, anestetizzare le mosche usando anidride carbonica prima di esaminare gli addomi per la presenza di colorante blu. Esaminare le mosche per comportamenti alimentari anormali come rigurgito, distensione delle colture e rottura della funzione di barriera intestinale. Una volta fatto, gettare tutte le fiale contaminate, la carta da filtro, i tappi e le mosche negli appositi contenitori di rifiuti chimici.Se le mosche vive rimangono nelle fiale, congelare le fiale prima di gettarle nell'apposito contenitore dei rifiuti. L'efficacia del protocollo è stata determinata esponendo organi adulti o moscerini maschi e femmine all'intervallo di concentrazioni di arsonite di sodio da zero a due millimolari per segnare la letalità dopo 48 ore di esposizione. Negli esperimenti successivi, sono state selezionate da zero a cinque concentrazioni millimolari che hanno definito più precisamente la curva di risposta alla dose di arsonite di sodio.Sulla base di questo modello, la dose letale finale, o LD 10, LD 25 e LD 50 di moscerini maschi alimentati con incendio di sodio erano rispettivamente 0,30 millimolari, 0,50 millimolari e 0,65 millimolari. Questi valori erano leggermente più alti per le mosche femmine con una LD 10 di 0,30 millimolare, una LD 25 di 0,65 millimolare e una LD 50 di 0,90 millimolare. Nei moscerini maschi e femmine alimentati con soluzioni di arsonite di sodio contenenti blu 1% F e C, il cibo ingerito è stato occasionalmente rigurgitato a dosi superiori a 0,2 millimolari per le femmine e 0,5 millimolari per i maschi, suggerendo che il rigurgito potrebbe svolgere il ruolo chiave nella risposta della filia delle scorie all'avvelenamento da arsenico.Seguendo questo protocollo di esposizione, le mosche possono essere facilmente raccolte per ulteriori analisi, compresi studi genomici e metabolomici. Questo protocollo è il primo passo per stabilire il moscerino della frutta Drosophila melanogaster come modello genetico comune per condurre studi su larga scala di tossicologia di precisione.

Research

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