Name: assessment of chemical toxicity in adult drosophila melanogaster
Uploaded: 2023-03-24T14:00:00
Duration: 7 min 2 s
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Agradecemos à nossa equipe pela ajuda com os testes e otimização deste protocolo: Ameya Belamkar, Marilyn Clark, Alexander Fitt, Emma Rose Gallant, Ethan Golditch, Matthew Lowe, Morgan Marsh, Kyle McClung, Andy Puga, Darcy Rose, Cameron Stockbridge e Noelle Zolman. Agradecemos também aos nossos colegas do Grupo de Toxicologia de Precisão, particularmente aos nossos colegas do Grupo de Exposição, por ajudarem a identificar os objetivos do protocolo.
Este projeto recebeu financiamento do programa de Investigação e Inovação Horizonte 2020 da União Europeia ao abrigo do Acordo de Subvenção n.º 965406. O trabalho apresentado nesta publicação foi realizado como parte do Cluster ASPIS. Esta produção reflete apenas a opinião dos autores, e a União Europeia não pode ser responsabilizada por qualquer uso que possa ser feito das informações nele contidas. Esta publicação também foi possível com o apoio do Indiana Clinical and Translational Sciences Institute, que é financiado em parte pelo Prêmio Número UL1TR002529 dos Institutos Nacionais de Saúde, National Center for Advancing Translational Sciences, Clinical and Translational Sciences Award. O conteúdo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa necessariamente a opinião oficial do National Institutes of Health. Partes deste projeto foram apoiadas por fundos da Universidade de Indiana concedidos ao JRS e ao consórcio PhyloTox. JMH e EMP foram apoiados pelo NIH P40OD018537 de premiação para o Bloomington Drosophila Stock Center.

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Não há conflitos de interesse a divulgar.

A mosca-das-frutas Drosophila melanogaster está emergindo como um poderoso sistema para NAMs16,18,19,21. Aproveitando os recursos genéticos incomparáveis disponíveis para a comunidade de moscas, combinados com os recentes avanços em genômica e metabolômica, os estudos de segurança química usando Drosophila são capazes de identificar rapidamente os mecanismos moleculares pelos quais compostos individuais interferem no metabolismo, fisiologia e sinalização celular (por exemplo, ver39). Este protocolo de baixo custo é projetado para definir rapidamente curvas dose-resposta e, posteriormente, gerar amostras para análise de RNA-seq e metabolômica. Além disso, este protocolo flexível pode ser adaptado para uso com qualquer genótipo e pode acomodar muitas classes de produtos químicos.
Um aspecto notável desse protocolo é a escolha do alimento líquido utilizado na exposição química, que é baseado em estudo anterior, mas difere do meio sólido utilizado pela maioria dos estudos toxicológicos de Drosophila 18,22. Este meio líquido específico foi selecionado para refletir o conteúdo nutricional do meio BDSC sólido padrão que as moscas também são alimentadas neste protocolo, para garantir que as moscas recebam nutrição consistente. A simplicidade dos meios de alimentação líquida tem muitas vantagens. O meio líquido é mais fácil de manusear do que os alimentos sólidos, que precisam ser fundidos e ressolidificados ou reconstituídos a partir de pó. O meio líquido também aumenta o rendimento do sistema, garante uma distribuição uniforme de produtos químicos por todo o meio de alimentação e diminui o tempo gasto trabalhando com compostos perigosos. Além disso, o meio não requer soluções para ser aquecido, o que facilita o teste de compostos voláteis de teste. Finalmente, devido aos relativamente poucos componentes incluídos na solução alimentar, as reações colaterais indesejáveis são minimizadas entre o produto químico de teste e outros componentes da dieta. A levedura utilizada no alimento também é inativa, limitando ainda mais a reatividade do meio de alimentação. No entanto, observe que o método não é adequado para testar a toxicidade do desenvolvimento ou larval.
Alguns dos materiais usados no protocolo podem ser substituídos, como o uso de frascos de mosca de vidro em vez de polipropileno. No entanto, os materiais utilizados foram selecionados para serem inertes e descartáveis para evitar reações químicas indesejadas entre reagentes e exposições químicas que poderiam resultar da limpeza de vidraria.
O uso de alimentos líquidos requer um veículo para entrega de alimentos. O papel de filtro acetato de celulose foi selecionado para esse fim devido à sua flexibilidade e natureza inerte28. Outros pesquisadores utilizaram protocolos semelhantes, porém com outros veículos, como lenços umedecidos ou filtro de fibra de vidro29,30. O papel de filtro acetato de celulose atendeu a essas necessidades porque é um veículo inerte que pode ser cortado na forma ideal para encaixá-lo no fundo dos frascos de mosca sem grandes lacunas entre o papel e a parede do frasco, evitando a morte devido a moscas ficarem presas na mídia ou no próprio veículo.
Uma limitação importante deste sistema é que a concentração máxima testável de um produto químico está ligada à solubilidade do produto químico. Compostos não solúveis em água requerem um solvente adicional, o que pode levar a efeitos adicionais ou sinérgicos com a substância química de interesse. Isso também pode criar situações em que não é possível preparar soluções estoque suficientemente concentradas para atingir o desfecho desejado em todos os organismos, limitando a análise dos dados resultantes31. Para resolver isso, produtos químicos com baixa solubilidade em água podem ser testados adicionando até 0,5% de dimetilsulfóxido à solução alimentar. Outros solventes também podem ser usados, mas pesquisas adicionais são necessárias para cada solvente de interesse para determinar a concentração máxima aceitável de solvente dentro da solução para maximizar a solubilidade enquanto minimiza os efeitos do solvente no organismo.
A extensa caracterização da resposta olfativa em Drosophila descreveu como as moscas evitam o consumo de compostos tóxicos40,41, levando à redução da alimentação nos meios tratados. O ensaio do corante azul aborda esse fenômeno, permitindo aos pesquisadores rastrear eficientemente o comportamento alimentar das moscas alimentadas com cada concentração de produto químico experimental42,43,44. A presença ou ausência de azul no trato gastrointestinal da mosca indica se a mosca tem comido o meio contendo tóxico. Embora existam métodos mais sofisticados de avaliação dos comportamentos alimentares das moscas, como o Fly Liquid-Food Interaction Counter45, esse método qualitativo é mais adequado para triagem de maior rendimento.
Um aspecto notável deste protocolo é que ele foi otimizado para um período de exposição de 48 h sem a necessidade de transferir moscas ou adicionar líquido adicional ao frasco de exposição. O uso de uma câmara de umidade e a colocação das câmaras em uma incubadora mantida em alta umidade evitaram que o papel de filtro contendo o meio de alimentação secasse durante esse período. O protocolo pode ser adaptado para períodos de exposição mais longos, mas o método deve ser ajustado para garantir que o papel de filtro não fique seco e cause alterações significativas na concentração da solução ou letalidade devido à dessecação.
Finalmente, uma característica importante deste protocolo é que ele pode acomodar prontamente variantes genéticas, o que permite que os pesquisadores utilizem a vasta gama de ferramentas genéticas para Drosophila para expandir esses estudos preliminares em organismos selvagens para entender melhor os mecanismos de ação química in vivo. Nesse sentido, o protocolo descrito acima poderia ser facilmente modificado para complementar um protocolo JoVE previamente descrito por Peterson e Long que permite a análise toxicológica de moscas capturadas na natureza18.
Devido à grande variedade de estudos prévios sobre a toxicidade do arsenito de sódio em Drosophila 32,33,34,35,36, moscas Oregon-R foram tratadas com este composto para demonstrar a eficácia do nosso sistema. Os machos exibiram uma DL 50 de 0,65 mM, e as fêmeas exibiram uma DL50 de 0,90 mM. Isso se alinha com estudos anteriores de Drosophila adulta tratada com arsenito de sódio. Por exemplo, Goldstein e Babich37 encontraram que 50% das moscas (sexos mistos) morreram após 7 dias de exposição a NaAsO0,5 mM 2. Embora esta seja uma dose ligeiramente menor do que a observada atualmente, as diferenças entre seus métodos e esse método (incluindo o uso de meios de exposição sólidos, uma escala de tempo mais longa e sexos mistos) provavelmente explicam essa diferença. É importante ressaltar que ambos os métodos resultaram em valores globais de DL50 semelhantes.
Observações de experimentos usando este protocolo podem ser usadas para encontrar alvos genéticos e moleculares para estudos comportamentais ou mecanísticos subsequentes. O método de exposição também pode ser usado para tratar Drosophila para amostragem para metabolômica e proteômica, tornando este protocolo bem adequado para o crescente campo da toxicologia de precisão (modelado a partir do campo da medicina de precisão46). Nesse sentido, moscas expostas podem ser coletadas após a etapa 8 para posterior análise genômica e metabolômica. As amostras coletadas na etapa 8 podem então ser processadas, conforme descrito por Li e Tennessen47, começando com a etapa 3.
Em última análise, os dados adquiridos a partir dos experimentos descritos acima, bem como quaisquer dados metabolômicos e proteômicos subsequentes, seriam idealmente usados em comparações entre espécies. Como observado anteriormente26, tais estudos entre espécies são poderosos e capazes de determinar como substâncias químicas individuais interferem em vias biológicas conservadas. Assim, o protocolo descrito acima pode ser usado para encontrar semelhanças evolutivas em resposta a tóxicos individuais em todos os filos e ajudar a informar a regulamentação de segurança química.

Os seres humanos estão constantemente expostos a produtos químicos de uma variedade de fontes, incluindo ar1, alimentos2, água3,4, medicamentos5, agentes de limpeza6, produtos de higiene pessoal 7, produtos químicos industriais 7 e materiais de construção 7. Além disso, milhares de novos produtos químicos são introduzidos todos os anos8, muitos dos quais não são devidamente examinados para a saúde e a segurança ambiental. Essa falta de testes de segurança química adequados decorre, em parte, de uma dependência excessiva de modelos de mamíferos, como camundongos e ratos. Embora esses modelos de roedores sejam informativos, os testes de segurança química nesses sistemas são caros, demorados e muitas vezes causam níveis inaceitáveis de sofrimento ao animal de teste9.
Os encargos financeiros e éticos associados aos testes de segurança química em mamíferos, bem como a natureza demorada dos estudos com mamíferos, são os principais fatores que contribuem para a escassez de dados em torno de novos produtos químicos. Para resolver essa questão, a Agência de Proteção Ambiental dos EUA (EPA), a Agência Europeia de Produtos Químicos (ECHA), a Health Canada e outras agências estão implementando medidas que incorporam novas metodologias de abordagem (NAMs) nos marcos regulatórios10, colocando assim a política norte-americana e europeia em linha com os objetivos internacionais de substituir, reduzir e refinar o uso de animais (o princípio dos 3R)11, 12,13,14. Os NAMs englobam uma variedade de ensaios baseados principalmente em modelos in vitro e in silico que fornecem uma compreensão mecanicista da toxicidade química em vez de observar a adversidade infligida às espécies de teste de mamíferos, aumentando assim a taxa de geração de dados para avaliação de risco químico enquanto ainda produzem resultados de alta fidelidade15. No entanto, esses métodos ainda não estão comprovados para salvaguardar contra a toxicidade sistêmica, incluindo a interrupção de processos biológicos vitais envolvendo comunicação interórgãos e sinalização endócrina. Além disso, eles não podem explicar a bioacumulação de produtos químicos dentro de tecidos específicos, a capacidade de compostos individuais serem absorvidos e secretados, e a interação entre comportamento e exposição química.
Devido às limitações dos modelos in vitro e computacionais, o uso bem-sucedido de NAMs para reduzir ou substituir modelos de mamíferos também deve incluir modelos in vivo de invertebrados, como a mosca-da-fruta, Drosophila melanogaster. Estudos prévios na mosca demonstraram que este organismo é adequado para o estudo das vias genéticas conservadas que protegem as células animais contra moléculas tóxicas 16,17,18,19,20,21,22. Além disso, a mosca apresenta notável similaridade genética com humanos, incluindo homólogos funcionais a mais de 65% das doenças humanas 23,24,25 e uma conservação ainda maior de importantes vias funcionais 26. Essas características, combinadas com seu ciclo de vida relativamente curto, baixo custo de manutenção e respostas comportamentais facilmente observáveis, tornam a Drosophila adequada para uso como modelo toxicológico27,28,29,30. Além disso, as moscas têm rendimento muito maior do que os modelos de roedores e capturam efeitos sobre o metabolismo, fisiologia e sinalização hormonal que não são prontamente detectáveis por outros NAMs não organismais9.
O protocolo aqui descrito representa uma estrutura para testar os efeitos da exposição química em adultos de Drosophila. O método é projetado para ser eficiente, barato e reprodutível, ao mesmo tempo em que minimiza o tempo que os pesquisadores devem estar em contato com o produto químico de teste e acomoda a coleta de amostras para metabolômica e outras abordagens ômicas. O protocolo é otimizado para testar um único produto químico por experimento, mas pode facilmente acomodar outros parâmetros experimentais, como solventes variados ou combinações de produtos químicos.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 inch flower lever action craft punch</td>
			<td>Bira Craft</td>
			<td>HCP-115-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Centrifuge Tubes&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-666</td>
			<td>High-Performance Centrifuge Tubes with Flat or Plug Caps, Polypropylene, 15 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 ml Tubes&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16466-044</td>
			<td>Micro Centrifuge Tube with Flat Screw-Cap, conical bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml Tubes&#160;</td>
			<td>VWR&#160;</td>
			<td>60818-576</td>
			<td>Culture Tubes, Plastic, with Dual-Position Caps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge Tubes&#160;</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>430290</td>
			<td>50 mL polypropylene centrifuge tubes, conical bottom with plug seal cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchmark Dose Software version 3.2</td>
			<td>U.S. Environmental Protection Agency</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cardboard trays</td>
			<td>Genesee Scientific flystuff</td>
			<td>32-122</td>
			<td>trays and dividers for narrow vials&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 gas pads</td>
			<td>Genesee Scientific flystuff</td>
			<td>59-114</td>
			<td>FlyStuff flypad, CO2 anesthetizing apparatus&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Combitips advanced, 50 mL</td>
			<td>Eppendorf&#160;</td>
			<td>0030089693</td>
			<td>Combitips&#160;advanced, Biopur, 50&#160;mL, light gray, colorless tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton balls</td>
			<td>Genesee Scientific flystuff</td>
			<td>51-101</td>
			<td>Cotton balls, large, fits narrow vials&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delicate task wipes</td>
			<td>Kimtech</td>
			<td>34155</td>
			<td>Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipes, 1 Ply / 8.2&#34; x 4.39&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila Vial Plugs, Cellulose Acetate (aka, Flugs)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89168-888</td>
			<td>Wide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FD&#38;C Blue No. 1</td>
			<td>Spectrum Chemical</td>
			<td>FD110</td>
			<td>CAS number 3844-45-9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flies&#160;</td>
			<td>BDSC</td>
			<td>Stock #2057&#160;</td>
			<td>OregonR wildtype&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gloves (nitrile)</td>
			<td>Kimtech</td>
			<td>55082/55081/55083</td>
			<td>Kimtech purple nitrile exam gloves, 5.9 mil, ambidextrous 9.5&#34;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grade 1 CHR cellulose chromatography paper</td>
			<td>Cytvia</td>
			<td>3001-917</td>
			<td>Sheet, 46 x 57 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mesh for humidity chamber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multipette / Repeater (X) stream&#160;</td>
			<td>Eppendorf&#160;</td>
			<td>022460811</td>
			<td>Repeater Xstream&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic grate</td>
			<td>Plaskolite</td>
			<td>18469 (from lowes)</td>
			<td>Plaskolite 24 in x 48 in 7.85 sq ft louvered ceiling light panels, cut down to fit in rubbermaid tubs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic trays for glass vials</td>
			<td>Genesee Scientific flystuff</td>
			<td>59-207</td>
			<td>Narrow fly vial reload tray&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene Drosophila Vial</td>
			<td>VWR</td>
			<td>75813-156</td>
			<td>Wide (28.5 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubbermaid tubs</td>
			<td>Rubbermaid</td>
			<td>3769017 (from Lowes)</td>
			<td>Rubbermaid Roughneck Tote 10 gallon 18&#34; L x 12&#34; W x 8 1/2&#34; H</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose ultra pure</td>
			<td>MP Biomedicals, Inc.</td>
			<td>821721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube racks for wide-mouthed tubes</td>
			<td>Thermo scientific&#160;</td>
			<td>5970-0230</td>
			<td>Nalgene Unwire Test tube racks, for 30 mm tubes&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Purification System</td>
			<td>Millipore Milli-Q</td>
			<td>ZMQ560F01</td>
			<td>Millipore Milli-Q Biocel Water Purifier&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>451120050</td>
			<td>CAS number 84604-16-0</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of chemical toxicity in adult drosophila melanogaster

As indústrias humanas geram centenas de milhares de produtos químicos, muitos dos quais não foram adequadamente estudados quanto à segurança ambiental ou aos efeitos na saúde humana. Esse déficit de informações de segurança química é exacerbado pelos métodos de teste atuais em mamíferos, que são caros, trabalhosos e demorados. Recentemente, cientistas e reguladores têm trabalhado para desenvolver novas metodologias de abordagem (NAMs) para testes de segurança química que são mais baratos, mais rápidos e reduzem o sofrimento animal. Um dos principais NAMs a surgir é o uso de organismos invertebrados como substitutos de modelos de mamíferos para elucidar modos químicos conservados de ação em espécies distantemente relacionadas, incluindo humanos. Para avançar nesses esforços, descrevemos aqui um método que utiliza a mosca-da-fruta, Drosophila melanogaster, para avaliar a segurança química. O protocolo descreve um procedimento simples, rápido e de baixo custo para medir a viabilidade e o comportamento alimentar de moscas adultas expostas. Além disso, o protocolo pode ser facilmente adaptado para gerar amostras para abordagens genômicas e metabolômicas. Em geral, o protocolo representa um passo importante no estabelecimento da Drosophila como um modelo padrão para uso em toxicologia de precisão.

A mosca tem servido de modelo em estudos para determinação da toxicidade do arsenito de sódio (NaAsO2)35,36,37,38. Para demonstrar a eficácia do protocolo, moscas machos e fêmeas foram expostos ao NaAsO2, com o objetivo de comparar esses resultados com estudos anteriores. Usando a metodologia descrita acima, machos e fêmeas adultos de Oregon-R (BDSC stock #2057) foram expostos a uma faixa de concentrações de NaAsO 2 (0, 0,01, 0,02, 0,1, 0,2, 1 e2 mM) e pontuados para letalidade 48 h após o início da exposição (Figura 1A,B).
O objetivo desta análise inicial foi identificar a faixa aproximada de concentrações que permitisse uma caracterização mais precisa da toxicidade do NaAsO2. Nos experimentos subsequentes, foram selecionadas concentrações (0, 0,2, 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5 e 5 mM) que definiram com maior precisão a curva dose-resposta NaAsO2 (Figura 1C,D). Note-se que a análise resultante examinou várias concentrações que induziram 100% de letalidade. Os dados foram analisados utilizando-se o software de dose de referência da Agência de Proteção Ambiental, versão 3.2.0.125. Os dados foram modelados como "dicotômicos" e o modelo de Hill Dicotômico foi utilizado para análises subsequentes. Com base nesse modelo, as DL10, DL25 e DL 50 finais de moscas machos alimentadas com NaAsO2 foram 0,30 mM,0,50 mM e 0,65 mM, respectivamente. Para as moscas fêmeas, esses valores foram ligeiramente maiores, com DL10 de 0,30 mM, DL25 de 0,65 mM e DL50 de 0,90 mM. De modo geral, os valores obtidos por esse método são semelhantes aos previamente relatados para toxicidade por arsênio em Drosophila melanogaster35,36,37,38, validando a metodologia.
Além das seis repetições usadas para calcular a curva dose-resposta, moscas machos e fêmeas também foram alimentadas com soluções de exposição ao NaAsO2 que continham 1% de FD&C blue, que é facilmente visível no trato digestivo usando microscopia de luz. Com base na presença de corante azul no intestino de moscas alimentadas com NaAsO 2, moscas machos e fêmeas continuaram a se alimentar 24 h após o início da exposição química, independentemente da concentração de NaAsO 2 presente no meio líquido (Figura 2). Entretanto, observou-se que o alimento ingerido era ocasionalmente regurgitado em doses superiores a 0,2 mM para fêmeas e 0,5 mM para machos (Figura 2). Esses achados sugerem que a regurgitação pode ter um papel fundamental na resposta de Drosophila ao envenenamento por arsênico.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65029/65029fig01.jpg"> Figura 1: Curvas dose-resposta para Drosophila machos e fêmeas tratados com NaAsO2 por 48 h. Todos os gráficos mostram as proporções estimadas de moscas mortas em cada concentração de NaAsO2 testada com base no modelo Dicotômico Hill. (A,B) Uma ampla faixa de concentrações de NaAsO2 foi testada para aproximar a dose em que cada sexo de mosca começa a morrer. (A) mostra os dados masculinos e (B) mostra os dados femininos. N = 4 frascos para injetáveis, com 20 moscas por frasco. (C,D) Uma faixa mais estreita de concentrações de NaAsO2 foi testada para determinar doses precisas nas quais 10%, 25% e 50% de cada sexo de moscas morreram. Essas doses são indicadas à direita de cada gráfico. (C) mostra os dados masculinos e (D) mostra os dados femininos. N = 6 frascos para injetáveis, com 20 moscas por frasco. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65029/65029fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65029/65029fig02.jpg"> Figura 2: Resultados representativos do ensaio de corante azul de Drosophila machos e fêmeas tratados com NaAsO2 por 24 h. Micrografias mostram moscas alimentadas com concentrações crescentes de NaAsO2. A linha (A) mostra moscas machos, e a linha (B) mostra moscas fêmeas, com a concentração de NaAsO2 aumentando da esquerda para a direita. O abdome mostra uma pequena quantidade de azul perto do tórax em baixas concentrações, indicando que o meio de exposição entrou no intestino. Em concentrações mais elevadas, o corante azul começa a se acumular ao redor da boca, sugerindo que o meio de exposição está sendo regurgitado. A barra de escala é de 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65029/65029fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Assessment of Chemical Toxicity in Adult Drosophila Melanogaster

Este protocolo descreve um método eficiente e de baixo custo que utiliza meios líquidos para avaliar os efeitos de tóxicos químicos na viabilidade de adultos de Drosophila melanogaster.

Avaliação da toxicidade química em adultos de Drosophila melanogaster

Human industries generate hundreds of thousands of chemicals, many of which have not been adequately studied for environmental safety or effects on human ...

O protocolo representa um passo importante para o estabelecimento da drosófila como um modelo padrão para testes de segurança química e para o desenvolvimento de novas metodologias de abordagem comumente chamadas de NAMs. O protocolo descreve um método eficiente e de baixo custo que utiliza meios líquidos para avaliar os efeitos de um produto químico tóxico na viabilidade de adultos de drosophila melanogaster. Comece empilhando quatro folhas de papel cromatógrafo de celulose grau um e cortando-as em tiras de duas polegadas de largura.Perfure inserções de papel de filtro em forma de flor usando um perfurador de papel de 1,5 polegadas contendo um corante em forma de flor. Empurre a pilha de papel de filtro para o fundo de um frasco de polipropileno de 28,5 milímetros de diâmetro usando uma cavilha de madeira não envernizada de 22 por 220 milímetros. Certifique-se de que a pilha está bem localizada na parte inferior do frasco para injetáveis.Guarde os frascos preparados em bandejas de plástico ou cartão e coloque as bandejas em sacos plásticos grandes até o uso. Abra o frasco para injetáveis de vidro que contém as moscas, coloque-o na boca do frasco de plástico preparado e transfira as moscas combinadas com sexo para o frasco para injetáveis de fome batendo o fundo do frasco para injetáveis de plástico contra uma bancada. Feche o frasco para injetáveis de plástico com um tampão de acetato de celulose ou flug e registe as moscas perdidas nesta transferência.Marque os frascos de fome contendo moscas fêmeas com uma listra. Para evitar misturas acidentais, deixe os frascos com moscas de correio sem marcação. Prepare a câmara de umidade para exposição noturna colocando seis toalhas de papel padrão na parte inferior.Em seguida, molhe as toalhas de papel com 100 mililitros de água e coloque a grade de plástico sobre as toalhas molhadas para garantir que os frascos não entrem em contato com as toalhas de papel saturadas. Depois de colocar as bandejas de frascos para injetáveis de fome em uma posição horizontal dentro da câmara de umidade, transfira a câmara de umidade para uma incubadora de 25 graus Celsius para incubação durante a noite. Para preparar os frascos de exposição química, transfira quatro frascos de moscas fêmeas famintas contendo 20 moscas por frasco para quatro frascos de exposição de cada concentração química.Rotule estes frascos como femininos. Prepare frascos para injetáveis de exposição química contendo corante azul transferindo um frasco para injetáveis de moscas fêmeas famintas para um frasco para injetáveis de exposição azul para cada concentração química. Rotule este frasco para injetáveis como feminino.Registre o número de moscas presentes em cada frasco após a transferência e anote o número que morreu ou escapou. Normalmente, todas as 20 moscas devem sobreviver durante a noite à fome e à transferência. Coloque os frascos de exposição horizontalmente em uma câmara de umidade recém-preparada antes de colocar a câmara em uma incubadora de 25 graus Celsius com aproximadamente 60% de umidade e um ciclo de 12 a 12 horas de luz é escuro.Examinar os frascos para injetáveis de exposição 24 e 48 horas após o início da exposição química. Conte e registre as moscas mortas em cada frasco em cada ponto de tempo. Para determinar se as moscas expostas consumiram o meio de exposição azul nos frascos de exposição azul após 24 horas da exposição química, examine as paredes dos frascos para verificar as indicações de fezes azuis que aparecem como pequenos pontos na lateral do frasco para injetáveis de exposição e do flug.Em seguida, anestesiar as moscas usando dióxido de carbono antes de examinar os abdômen para a presença de corante azul. Examine as moscas em busca de comportamentos alimentares anormais, como regurgitação, distensão da cultura e quebra da função da barreira intestinal. Uma vez feito, descarte todos os frascos contaminados, papel de filtro, plugues e moscas nos recipientes apropriados para resíduos químicos.Se as moscas vivas permanecerem nos frascos para injetáveis, congele os frascos para injetáveis antes de os descartar no recipiente de resíduos adequado. A eficácia do protocolo foi determinada pela exposição de órgãos adultos ou moscas machos e fêmeas à faixa de concentrações de arsonita sódica de zero a dois milimolares para pontuar a letalidade após 48 horas de exposição. Em experimentos subsequentes, foram selecionadas concentrações de zero a cinco milimolares que definissem com maior precisão a curva dose-resposta do arsonito de sódio.Com base nesse modelo, a dose letal final, ou DL 10, DL 25 e DL 50 de moscas machos alimentadas com incenita sódica foi de 0,30 milimolar, 0,50 milimolar e 0,65 milimolar, respectivamente. Esses valores foram ligeiramente maiores para moscas fêmeas com DL 10 de 0,30 milimolar, DL 25 de 0,65 milimolar e DL 50 de 0,90 milimolar. Nos machos e fêmeas alimentados com soluções de arsonita sódica contendo 1%F D e C blue, o alimento ingerido foi ocasionalmente regurgitado em doses acima de 0,2 milimolar para fêmeas e 0,5 milimolar para machos, sugerindo que a regurgitação poderia desempenhar o papel fundamental na resposta da escória à intoxicação por arsênio.Seguindo este protocolo de exposição, as moscas podem ser facilmente coletadas para análises posteriores, incluindo estudos genômicos e metabolômicos. Este protocolo é o primeiro passo para estabelecer a mosca-das-frutas drosophila melanogaster como um modelo genético comum para a realização de estudos em larga escala de toxicologia de precisão.

Research

JoVE Journal

Biology

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