Name: establishment, maintenance, differentiation, genetic manipulation, and transplantation of mouse and human lacrimal gland organoids
Uploaded: 2023-02-03T14:15:00
Duration: 10 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Establishment, Maintenance, Differentiation, Genetic Manipulation, and Transplantation of Mouse and Human Lacrimal Gland Organoids at JoVE.com

نشكر يوريك بوست على التطوير الأولي للبروتوكول. تم دعم هذا العمل جزئيا بجائزة من التحدي الكبير لأبحاث السرطان في المملكة المتحدة (C6307 / A29058) ومؤسسة مارك لأبحاث السرطان لفريق SPECIFICANCER.

<ol>
	<li>Garg, A., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lacrimal+gland+development:+From+signaling+interactions+to+regenerative+medicine.">Lacrimal gland development: From signaling interactions to regenerative medicine.</a> Developmental Dynamics. 246 (12), 970-980 (2017).</li><li>Selinger, D. S., Selinger, R. C., Reed, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resistance+to+infection+of+the+external+eye:+The+role+of+tears.">Resistance to infection of the external eye: The role of tears.</a> Survey of Ophthalmology. 24 (1), 33-38 (1979).</li><li>Messmer, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathophysiology,+diagnosis,+and+treatment+of+dry+eye+disease.">The pathophysiology, diagnosis, and treatment of dry eye disease.</a> Deutsches Arzteblatt International. 112 (5), 71-81 (2015).</li><li>Massie, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+lacrimal+gland+spheroids+for+lacrimal+gland+tissue+regeneration.">Development of lacrimal gland spheroids for lacrimal gland tissue regeneration.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (4), 2001-2009 (2018).</li><li>Tiwari, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+human+lacrimal+gland+cultures+with+secretory+function.">Establishing human lacrimal gland cultures with secretory function.</a> PloS One. 7 (1), 29458 (2012).</li><li>Nguyen, D. H., Beuerman, R. W., Halbert, C. L., Ma, Q., Sun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+immortalized+rabbit+lacrimal+gland+epithelial+cells.">Characterization of immortalized rabbit lacrimal gland epithelial cells.</a> In Vitro Cellular &amp; Developmental Biology. Animal. 35 (4), 198-204 (1999).</li><li>Bannier-H&#233;laou&#235;t, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+human+lacrimal+gland+using+organoids+and+single-cell+sequencing.">Exploring the human lacrimal gland using organoids and single-cell sequencing.</a> Cell Stem Cell. 28 (7), 1221-1232 (2021).</li><li>Hayashi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+3D+lacrimal+gland+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells.">Generation of 3D lacrimal gland organoids from human pluripotent stem cells.</a> Nature. 605 (7908), 126-131 (2022).</li><li>Jeong, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+functional+epithelial+organoids+from+human+lacrimal+glands.">Establishment of functional epithelial organoids from human lacrimal glands.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 12 (1), 247 (2021).</li><li>Hofer, M., Lutolf, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+organoids.">Engineering organoids.</a> Nature Reviews Materials. 6 (5), 402-420 (2021).</li><li>Meyenberg, M., Ferreira da Silva, J., Loizou, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+specific+DNA+repair+outcomes+shape+the+landscape+of+genome+editing.">Tissue specific DNA repair outcomes shape the landscape of genome editing.</a> Frontiers in Genetics. 12, 728520 (2021).</li><li>Geurts, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-based+adenine+editors+correct+nonsense+mutations+in+a+cystic+fibrosis+organoid+biobank.">CRISPR-based adenine editors correct nonsense mutations in a cystic fibrosis organoid biobank.</a> Cell Stem Cell. 26 (4), 503-510 (2020).</li><li>Overmyer, K. A., Thonusin, C., Qi, N. R., Burant, C. F., Evans, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+anesthesia+and+euthanasia+on+metabolomics+of+mammalian+tissues:+Studies+in+a+C57BL/6J+mouse+model.">Impact of anesthesia and euthanasia on metabolomics of mammalian tissues: Studies in a C57BL/6J mouse model.</a> PLoS One. 10 (2), 0117232 (2015).</li><li>Driehuis, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+mucosal+organoids+as+a+potential+platform+for+personalized+cancer+therapy.">Oral mucosal organoids as a potential platform for personalized cancer therapy.</a> Cancer Discovery. 9 (7), 852-871 (2019).</li><li>Froger, A., Hall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+plasmid+DNA+into+E.+coli+using+the+heat+shock+method.">Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method.</a> Journal of Visualized Experiments. (6), e253 (2007).</li><li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li><li>Lian, J., Meng, X., Zhang, X., Hu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+genetic+manipulation+of+murine+hepatocyte+organoids.">Establishment and genetic manipulation of murine hepatocyte organoids.</a> Journal of Visualized Experiments. (180), e62438 (2022).</li><li>L&#245;hmussaar, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+organoids+model+cervical+tissue+dynamics+and+viral+oncogenesis+in+cervical+cancer.">Patient-derived organoids model cervical tissue dynamics and viral oncogenesis in cervical cancer.</a> Cell Stem Cell. 28 (8), 1380-1396 (2021).</li><li>Bloh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deconvolution+of+complex+DNA+repair+(DECODR):+Establishing+a+novel+deconvolution+algorithm+for+comprehensive+analysis+of+CRISPR-edited+Sanger+sequencing+data.">Deconvolution of complex DNA repair (DECODR): Establishing a novel deconvolution algorithm for comprehensive analysis of CRISPR-edited Sanger sequencing data.</a> The CRISPR Journal. 4 (1), 120-131 (2021).</li><li>Latta, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiology+of+aniridia-associated+keratopathy:+Developmental+aspects+and+unanswered+questions.">Pathophysiology of aniridia-associated keratopathy: Developmental aspects and unanswered questions.</a> The Ocular Surface. 22, 245-266 (2021).</li><li>Veernala, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lacrimal+gland+regeneration:+The+unmet+challenges+and+promise+for+dry+eye+therapy.">Lacrimal gland regeneration: The unmet challenges and promise for dry eye therapy.</a> The Ocular Surface. 25, 129-141 (2022).</li><li>Hayashi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+3D+lacrimal+gland+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells.">Generation of 3D lacrimal gland organoids from human pluripotent stem cells.</a> Nature. 605 (7908), 126-131 (2022).</li></ol>

هانز كليفرز هو رئيس أبحاث الأدوية والتطوير المبكر في روش ، بازل ، ويحمل العديد من براءات الاختراع المتعلقة بتكنولوجيا المواد العضوية.

يصف هذا البروتوكول إنشاء واستخدام عضويات الغدة الدمعية للمقايسات الوظيفية ونمذجة الطفرات والزرع. عند إنشاء عضويات الغدة الدمعية للفأر والإنسان ، فإن تفكك الأنسجة أمر بالغ الأهمية. إذا لم يتم هضم الأنسجة بشكل كاف ، فسيكون العائد العضوي منخفضا. إذا تم هضم الأنسجة بشكل مفرط ، ستموت الخلايا ولن تنمو كعضويات. يجب هضم كل نسيج بإنزيم معين لفترة محددة لضمان النمو العضوي الأمثل14،17،18. الغدة الدمعية هي نسيج رخو إلى حد ما يكون فيه هضم كولاجيناز من 5-10 دقائق مع التفكك الميكانيكي القائم على السحب كافيا لعزل قطع صغيرة من الأنسجة. إذا كانت هناك حاجة للحصول على خلايا مفردة لتطبيقات مثل تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية ، فيمكن إجراء التفكك لفترة أطول حتى يتم الوصول إلى مرحلة الخلية الواحدة ، ولكن يجب إيقاف التفكك بمجرد الحصول على خلايا مفردة للحد من أي انخفاض في الجدوى. نظرا لأن تفكك الأنسجة أمر بالغ الأهمية ، فإن الإفراط في الهضم هو السبب الأكثر ترجيحا لفشل إنشاء الغدة الدمعية العضوية.
الصيانة المناسبة لعضويات الغدة الدمعية مهمة لاستخدامها. الصيانة طويلة الأجل هي السمة المميزة لعضويات الغدة الدمعية المشتقة من الخلايا الجذعية البالغة ، مقارنة بالكائنات العضوية المشتقة من الخلايا الجذعية المستحثةمتعددة القدرات 7,17. لتحقيق صيانة طويلة الأجل ، يجب إجراء تقسيم عضوي منتظم وتغييرات متوسطة. بدون ذلك ، تبدأ الكائنات العضوية في التمايز وتطوير إمكانات الخلايا الجذعية المنخفضة ، مما يعيق صيانتها على المدى الطويل7. في هذه الخطوة مرة أخرى ، يمكن أن يؤدي الإفراط في الهضم إلى قتل الخلايا الجذعية وإضعاف صيانة المواد العضوية. للصيانة الدورية ، لا يلزم تفكك الأعضاء في خلايا مفردة. ومع ذلك ، لتوليد خطوط عضوية نسيلية بالضربة القاضية ، من الأهمية بمكان البدء بخلايا مفردة. إذا لم يكن الأمر كذلك ، فسوف تتكون الكائنات العضوية من فسيفساء من الخلايا ذات الخلفيات الجينية المختلفة ، مما يجعل تحليل تأثير طفرة واحدة محددة مستحيلا. نصف هنا استخدام محرر قاعدة C > T لتوليد كودونات الإيقاف. يعتمد محرر الجينوم هذا على وجود كودونات الأرجينين أو الجلوتامين أو التربتوفان داخل 12-18 قاعدة من NGG PAM. عندما لا يتم استيفاء هذه الشروط في تصميم gRNA ، يمكن استخدام محرري قاعدة Cas9 أو C >T التقليدية مع PAMs البديلة 7,18. ومع ذلك ، يقدم Cas9 التقليدي فواصل مزدوجة تقطعت بهم السبل تؤدي إلى indels عند الإصلاح11. وبما أن كلا الأليلين قد يحتويان على إندلات مختلفة، فإن التنميط الجيني المستنسخ يتطلب مزيدا من الحذر. يجب إجراء إزالة الالتفاف للتعديلات التي تم إدخالها للتأكد من أن كلا الأليلين يحتويان على إندل خارج الإطار ، وبالتالي ، يتم التخلص من الحيوانات المستنسخة العضوية للجين المستهدف19. تكمن ميزة محررات قاعدة C > T في حقيقة أنه يمكن استخدامها لنمذجة الطفرات النقطية التي لا تؤدي بالضرورة إلى كودونات التوقف. على سبيل المثال ، يمكن استخدامها لنمذجة طفرات Pax6 المحددة الموجودة في المرضى الذين يعانون من الأنيريديا لدراسة تأثيرها على فسيولوجيا الغدة الدمعية20.
تفرز الغدة الدمعية الجزء المائي من الفيلم المسيل للدموع1. يمكن تلخيص إفراز الدموع في الكائنات العضوية البشرية بعد التمايز بوساطة انسحاب عامل النمو وتثبيط NOTCH. في ظل هذه الظروف ، تخضع المواد العضوية للتمايز النهائي ولا يمكن الحفاظ عليها. ومع ذلك ، يمكن أن توجه عضويات الغدة الدمعية المتمايزة تطوير الأدوية التي تحفز التمزق في سياق مرض جفاف العين ، وربما في شاشات عالية الإنتاجية. مقايسة التمزق المقدمة في هذا البروتوكول هي التي تعطي حاليا أكبر تغيير في حجم الأعضاء في فترة زمنية قصيرة ، مما يسهل القياس الكمي في سياق شاشة الدواء7،9،17.
العلاج بالخلايا الجذعية يحمل وعدا كبيرا لتجديد الغدة الدمعية في مرض جفاف العين21. يمكن أن تكون عضويات الغدة الدمعية المشتقة من الخلايا الجذعية البالغة مادة مصدر لمثل هذه التطبيقات. ينتج عن البروتوكول المقدم هنا تطعيم عضوي للغدة الدمعية البشرية ، في الغالب على شكل خراجات. يمكن أن ينشأ النقش العضوي المنخفض بسبب حقن المواد العضوية في الموقع الخطأ. يسمح تدريب إجراء الحقن بصبغة بتتبع موقع الحقن ، وفي النهاية يحسن دقة الحقن. بدلا من ذلك ، يمكن شق بشرة الفأر للوصول المباشر إلى الغدة الدمعية ، كما هو الحال في الفئران قبل22. تستغرق هذه الطريقة وقتا أطول ولكنها قد تكون أكثر دقة. من ناحية أخرى ، مع البروتوكول الحالي ، لم تندمج الكائنات العضوية وظيفيا في الغدة الدمعية للفأر. وقد لوحظت نتائج مماثلة لتطعيم الغدة الدمعيةالمشتقة من iPSC 22. يمكن تحسين طريقة الزرع بشكل أكبر عن طريق جرح الغدة الدمعية مسبقا ، باستخدام نموذج فأر العين الجافة ، و / أو حقن الكائنات العضوية كخلايا مفردة أو كتل صغيرة. ومع ذلك ، يمكن أن تكون عضويات الغدة الدمعية المشتقة من الخلايا الجذعية البالغة ومجموعة الأدوات ذات الصلة أساسا للتطبيقات المستقبلية في أبحاث الغدة الدمعية والطب التجديدي.

الغدة الدمعية هي الظهارة الغدية المسؤولة عن إنتاج معظم الطبقة المائية للفيلم المسيل للدموع1. لا تحتوي الطبقة المائية من الفيلم المسيل للدموع على الماء لتليين سطح العين فحسب ، بل تحتوي أيضا على ذخيرة كبيرة من المكونات المضادة للميكروبات التي تحمي سطح العين من العدوى2. عندما تتلف الغدة الدمعية أو تلتهبها ، يحدث مرض جفاف العين ، مما يؤدي إلى عدم الراحة للمرضى ويمكن أن يؤدي في النهاية إلى فقدان الرؤية3. على مر السنين ، كانت الأنظمة النموذجية لدراسة الغدة الدمعية ، وخاصة الغدة البشرية ، محدودة4،5،6. وقد ساهم ذلك في حدوث فجوة معرفية فيما يتعلق بوظيفة الغدة الدمعية في ظل الظروف الفسيولوجية والمرضية.
في الآونة الأخيرة ، تم تطوير نماذج في المختبر لدراسة الغدة الدمعية في طبق7،8،9. تستمد عضويات الغدة الدمعية هذه من الخلايا الجذعية البالغة التي تزرع كهياكل ثلاثية الأبعاد في مصفوفة خارج الخلية تكملها مجموعة من عوامل النمو التي تحافظ على قدراتها التجديدية في المختبر7. تتمثل ميزة الكائنات العضوية المشتقة من الخلايا الجذعية البالغة (ASC) في أنه يمكن الحفاظ عليها لفترة طويلة جدا مع تلخيص ميزات الأنسجة السليمة. يتكون هذا النوع من الكائنات العضوية فقط من الخلايا الظهارية ، على عكس الكائنات العضوية المشتقة من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSC) ، والتي قد تحتوي أيضا على خلايا انسجة ، على سبيل المثال. على عكس الكائنات العضوية المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات (PSC) ، يتم إنشاء عضويات ASC مباشرة من الأنسجة البالغة ولا تتطلب أي تعديلات وراثية لتوسيعها. تعبر عضويات ASC عن خصائص البالغين10.
يحتوي هذا البروتوكول على صندوق أدوات لاشتقاق عضويات الغدة الدمعية من الفئران والأنسجة الأولية البشرية. يصف البروتوكول كيفية زيادة تعزيز وظائف المواد العضوية عن طريق الانسحاب البسيط لعامل النمو وكيفية إثارة الكائنات العضوية لإفراز السائل المسيل للدموع عن طريق إجراء فحص التورم. يتضمن هذا البروتوكول أيضا طريقة نقل تعتمد على التثقيب الكهربائي لهندسة عضويات الفئران وراثيا باستخدام برامج تحرير القواعد المشتقة من كريسبر. على عكس Cas9 التقليدي ، يسمح استخدام برامج التحرير الأساسية بتعديل القواعد الفردية في الجينوم دون توليد كسر مزدوج تقطعت بهم السبل11,12. أخيرا ، يتم وصف زرع الأعضاء التناسلية للغدة الدمعية البشرية في الفئران التي تعاني من نقص المناعة والتقييم النسيجي اللاحق للتطعيم. يمكن استخدام مجموعة الأدوات العضوية للغدة الدمعية هذه في البحث عن تجديد الغدة الدمعية ووظيفتها ونمذجة الأمراض الوراثية والالتهابية.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL safe-lock centrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>EP0030 120.094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,3&#8242;-Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrate (DAB)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5637</td>
			<td>CAS: 868272-85-9 , CAUTION, 6 g/L solution can be stored aliquotted at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5x green GoTaq Flexi buffer</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M891A</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A83-01</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2939</td>
			<td>Store at -20 &#176;C, stock at 30 mM, 10000x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12634-010</td>
			<td>store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar plates containing Ampicillin</td>
			<td>Hubrecht Institute</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave VAPOUR-Line lite</td>
			<td>VWR chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>Store at -20 &#176;C, 50x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Micro-Fine insulin needle 1 mL</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>324825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop microscope DMI1</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumine (BSA)</td>
			<td>MP biomedicals</td>
			<td>160069</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BTXpress</td>
			<td>BTX</td>
			<td>MDS450805</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 mice</td>
			<td>Hubrecht Institute</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cassettes</td>
			<td>Klinipath</td>
			<td>410-02S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellBanker 1</td>
			<td>amsbio</td>
			<td>11910</td>
			<td>Cryopreservation medium, adhere to instructions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid monohydrate</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>0088</td>
			<td>CAS: 5949-29-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase I</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C9407</td>
			<td>Aliquots at 20 mg/mL, 20x, store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes 15 mL</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>5618-8271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes 50 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS430828-500EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips 24 mm x 50 mm</td>
			<td>Menzel-Gl&#228;zer</td>
			<td>BB024050S1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex Basement Membrane Extract (BME), Growth Factor Reduced, Type 2 - extracellular matrix</td>
			<td>R&#38;D Systems, Bio-Techne</td>
			<td>3533-001-02</td>
			<td>Store at -20 &#176;C, keep at 4 &#176;C for up to 1 month</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPT</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D5942</td>
			<td>Store at -20 &#176;C, stock at 10 mM, 1000x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium hydrogen phosphate anhydrous</td>
			<td>VWR chemicals</td>
			<td>28026.292</td>
			<td>CAS: 7558-79-4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Di-sodiumhydrogenphosphate dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71643</td>
			<td>CAS:10028-24-7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>17105-041</td>
			<td>Aliquots at 50 U/mL, store at -20 &#176;C until use, 400x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Scalpel Sterile N&#176; 10</td>
			<td>Swann Morton</td>
			<td>3033838</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DM4000 microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTPs 25 mM</td>
			<td>Promega</td>
			<td>U1420</td>
			<td>Mix all 4 nucleotides together, Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dpn1</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate-bufferd Saline (DPBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190144</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Easy strainers 70 &#181;m</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>542170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation cuvette</td>
			<td>Nepagene</td>
			<td>EC002S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EnVision+/HRP mouse</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>K400111-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 100%</td>
			<td>BOOM</td>
			<td>84045206;5000</td>
			<td>CAUTION, Use to prepare other Ethanol dilutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 70%</td>
			<td>BOOM</td>
			<td>84010059.5000</td>
			<td>CAUTION</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 96%</td>
			<td>BOOM</td>
			<td>84050065.5000</td>
			<td>CAUTION</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS FL Auto 2 Cell Imaging System</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Live-imaging brightfield microscrope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF10</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-26</td>
			<td>Store at -20 &#176;C, stock at 100 mg/mL in base medium, 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td>NIH, Fiji developers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution 4%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1.00496</td>
			<td>CAS: 50-00-0, CAUTION</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1099</td>
			<td>Store at -20 &#176;C, stock at 10 mM, 10000x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GoTaq G2 Flexi DNA Polymerase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M7805</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Haematoxylin</td>
			<td>VWR chemicals</td>
			<td>10047105</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td>Store at 4 &#176;C, 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histocore H and C, Tissue embedding machine</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate</td>
			<td>Meidax</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human nucleolar antigen antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab-190710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid 5 N</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10605882</td>
			<td>CAS: 7647-01-0, CAUTION</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxyde 30%</td>
			<td>Chem-lab</td>
			<td>CL00.2308.1000</td>
			<td>CAS: 7722-84-1, CAUTION</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygromycin B-gold</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ant-hg</td>
			<td>Stock at 100 mg/&#181;L, 1000x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygromycin resistance cassette-containing plasmid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Andersson-Rolf et al, Nature Methods, 2017. doi: 10.1038/nmeth.4156</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IsoFlo 100%</td>
			<td>Mecan</td>
			<td>5960501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB medium</td>
			<td>Hubrecht Institute</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 25 mM</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A351H</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome RM2235</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Midiprep DNA isolation kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>K210005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniprep DNA isolation kit</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>K210003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetylcysteine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9165</td>
			<td>Store at -20 &#176;C, stock at 500 mM, 400x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEPA21 electroporator</td>
			<td>Nepagene</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>N0636</td>
			<td>Store at -20 &#176;C, stock at 1M, 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOD Scid Gamma (NSG) mice</td>
			<td>Hubrecht Institute colony</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noggin conditioned medium</td>
			<td>U-Protein Express</td>
			<td>Custom order</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noradrenaline</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A7257</td>
			<td>Store at -20 &#176;C, stock at 100 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Memmert</td>
			<td></td>
			<td>Set at 58 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P20, P200 and P1000 pipettes</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin</td>
			<td>VWR chemicals</td>
			<td>10048502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipettes, glass plugged</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>1150-6973</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pax6_C&#62;T_F: AGACTGTTCCAGGATGGCTG&#160;</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pax6_C&#62;T_R: TCTCCTAGGTACTGGAAGCC&#160;</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCMV_ABEmax_P2A_GFP</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>112101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pertex</td>
			<td>Klinipath</td>
			<td>AM-08010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pFYF1320&#160;</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>47511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ant-pm-1</td>
			<td>1000X, store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prostaglandin E2 (PGE2)</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2296</td>
			<td>Store at -20 &#176;C, stock at 10 mM, 10000x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish, 10 cm</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>633102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B9027S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 high-fidelity DNA polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0491S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuickExtract DNA Extraction Solution</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>QE09050</td>
			<td>Store aliquots at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-spondin 3 conditioned medium</td>
			<td>U-Protein Express</td>
			<td>Custom order</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sgRNA Reverse Primer: TCTGCGCCCATCTGTTGCTT CGGTGTTTCGTCCTTTCCACAAG</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides</td>
			<td>StarFrost</td>
			<td>MBB-0302-55A</td>
			<td>Adhesive, ground</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8.22335.1000</td>
			<td>CAS: 26628-22-8, CAUTION</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium cytrate dihydrate</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>0280</td>
			<td>CAS: 6132-04-3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Forward Primer: &#8220;/5phos/ GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG 
			TTAAAATAAGGC</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Subcloning efficiency competent cells DH5alpha</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18265-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suspension cell culture plates (24-well)</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>662102</td>
			<td>24-well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suspension cell culture plates (12-well)</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>665102</td>
			<td>12-well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAE buffer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>B49</td>
			<td>Stock at 50x, dilute to 1x with ultrapure water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transposase-containing plasmid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Andersson-Rolf et al, Nature Methods, 2017. doi: 10.1038/nmeth.4156</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express Enzyme</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12605-028</td>
			<td>store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U6_Forward primer: GGGCAGGAAGAGGGCCTAT</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Agarose 1000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Tulabo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Klinipath</td>
			<td>4055-9005</td>
			<td>CAS: 1330-20-7, CAUTION</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Abmole Bioscience</td>
			<td>Y-27632 dihydrochloride</td>
			<td>Store at -20 &#176;C, stock at 10 mM, 1000x</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishment, maintenance, differentiation, genetic manipulation, and transplantation of mouse and human lacrimal gland organoids

الغدة الدمعية عضو أساسي في الاتزان الداخلي لسطح العين. من خلال إنتاج الجزء المائي من الفيلم المسيل للدموع ، فإنه يحمي العين من إجهاد الجفاف والشتائم الخارجية. لا يعرف سوى القليل عن فسيولوجيا الغدة الدمعية (المرضية) بسبب عدم وجود نماذج كافية في المختبر . أثبتت تقنية Organoid نفسها كمنصة تجريبية مفيدة لأعضاء متعددة. هنا ، نشارك بروتوكولا لإنشاء وصيانة عضويات الفئران والغدة الدمعية البشرية بدءا من خزعات الغدة الدمعية. من خلال تعديل ظروف الاستزراع ، نقوم بتعزيز وظائف الغدة الدمعية العضوية. يمكن فحص وظائف العضوي من خلال فحص "البكاء" ، والذي يتضمن تعريض عضويات الغدة الدمعية لناقلات عصبية مختارة لتحفيز إطلاق الدموع في تجويفها. نفسر كيفية تصوير هذه الظاهرة وقياسها. لدراسة دور الجينات المهمة في الاتزان الداخلي للغدة الدمعية، يمكن تعديلها وراثيا. نحن نصف بدقة كيفية تعديل عضويات الغدة الدمعية وراثيا باستخدام المحررين الأساسيين - من تصميم دليل الحمض النووي الريبي إلى التنميط الجيني للاستنساخ العضوي. أخيرا ، نوضح كيفية التحقيق في الإمكانات التجديدية لعضويات الغدة الدمعية البشرية عن طريق زرع تقويم العظام في الفأر. توفر مجموعة الأدوات الشاملة هذه معا موارد لاستخدام عضويات الفئران والغدد الدمعية البشرية لدراسة فسيولوجيا الغدة الدمعية (المرضية).

بعد تشريح الغدة الدمعية للفأر (الشكل 2 أ) ، ولد الهضم الأنزيمي والميكانيكي شظايا صغيرة من الأنسجة ، من بينها العنيبات والقنوات (الشكل 2 ب). الأجزاء الكبيرة المتبقية من الأنسجة من شأنها أن تزعزع استقرار ECM ، مما يقلل من النمو العضوي الأولي. كان اشتقاق الغدة الدمعية للفأر ناجحا عندما تم العثور على عضويات كيسي بقطر ~ 500 ميكرومتر بعد ~ 7 أيام ، وهي المرحلة التي كانت فيها الكائنات العضوية جاهزة للانقسام (الشكل 2C). حتى لو كان الاشتقاق العضوي الكلي ناجحا ، فقد تبدأ بعض الكائنات العضوية في النمو قبل التوقف في النهاية. نمت عضويات الغدة الدمعية البشرية كأكياس في غضون 3-4 أيام ووصلت إلى الحجم الكامل النمو في 10-14 يوما بعد عزل الأنسجة (الشكل 2 د). بالنسبة لكل من الفئران والبشر ، فشل الاشتقاق العضوي في بعض الأحيان ، مع عدم نمو أو عدد قليل من الكائنات العضوية. كان هذا بشكل عام بسبب الإفراط في هضم الأنسجة. يمكن تمرير عضويات الغدة الدمعية للفأر 40x على الأقل والكائنات العضوية البشرية 20x على الأقل. تم تمرير كل 7-10 أيام في المتوسط ، وهذا يتوقف على النمو العضوي.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65040/65040fig02.jpg"> الشكل 2: تكوين عضويات الفأر والغدة الدمعية البشرية. أ: صور فوتوغرافية للمراحل المختلفة لتشريح الغدة الدمعية للفأر. يشير السهم إلى الغدة الدمعية تحت غشاءها الواقي. (ب) صور برايتفيلد لخلايا الغدة الدمعية للفأر بعد هضم الأنسجة مباشرة، مع وجود أجزاء داخلية توضح العنيب والقناة. (ج) صور برايتفيلد لاشتقاق عضوي ناجح وغير ناجح للغدة الدمعية للفأر. د: صور برايتفيلد لنمو عضوي بشري على مدار 14 يوما. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65040/65040fig02large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
تحتوي عضويات الغدة الدمعية على نسبة كبيرة من الخلايا الجذعية عند زراعتها في وسط التمدد. لزيادة مستوى تمايزها ، قمنا بإعداد ماوس ووسيط تمايز بشري مع محتوى عامل نمو منخفض. بعد 5 أيام و 7 أيام ، على التوالي ، في وسط التمايز ، أصبحت عضويات الفأر والغدة الدمعية البشرية أكثر كثافة (الشكل 3A-B). يرتبط هذا التغيير المورفولوجي بزيادة الخصائص الوظيفية. أدى تطبيق منشط AMP الدوري فورسكولين أو الناقل العصبي بافراز إلى تورم عضوي (أي إفراز الماء القمي) في أقل من 3 ساعات (الشكل 3C). عندما استغرق التورم وقتا أطول من 3-4 ساعات ، يشير ذلك إلى أن المواد العضوية لم تكن متمايزة بما فيه الكفاية و / أو لم تعبر عن علامات وظيفية ، مثل مستقبلات الناقلات العصبية.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65040/65040fig03.jpg"> الشكل 3: تمايز عضويات الفأر والغدة الدمعية البشرية ومقايسة التورم الوظيفي في العضويات البشرية. (أ) صور برايتفيلد لعضويات الغدة الدمعية للفأر المستزرعة في وسط التمدد لمدة 7 أيام وفي وسط التمايز لمدة 5 أيام بعد 2 أيام في وسط التمدد. (ب) صور برايتفيلد لعضويات الغدة الدمعية البشرية المستزرعة في وسط التمدد لمدة 11 يوما وفي وسط التمايز لمدة 9 أيام بعد يومين في وسط التمدد. (ج) صور برايتفيلد لعضويات الغدة الدمعية البشرية المتمايزة المعرضة لوسط تمايز جديد (تحكم) ، إلى 1 ميكرومتر فورسكولين ، و 100 ميكرومتر نورإبينفرين على مدار 3 ساعات. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65040/65040fig03large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.</a>
لضرب Pax6 في عضويات الغدة الدمعية للفأر ، تم إنشاء بلازميد يحتوي على gRNA الذي يستهدف Pax6 المختار بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل والربط (الشكل 4 أ). تم تكريب هذا البلازميد المحتوي على gRNA جنبا إلى جنب مع بلازميدات Piggy-Bac (البلازميدات المحتوية على الترانسبوزون المحتوية على الترانسبوزون والترانسبوزاز) ومحرر قاعدة C > T Cas9 في عضويات الغدة الدمعية للفأر المنفصلة إلى خلايا مفردة. بعد 3 أيام ، عندما تعافت الكائنات العضوية ، تعرضوا للهيجروميسين لاختيار الحيوانات المستنسخة التي تضمنت كاسيت مقاومة الهيجروميسين. في التثقيب الكهربائي الناجح ، نمت المواد العضوية المقاومة للهيجروميسين (الشكل 4 ب). تم اختيار الحيوانات المستنسخة العضوية المتنامية التي كانت أكبر من ~ 300 ميكرومتر ، من الناحية المثالية قبل أن تبدأ في التمايز تلقائيا (الشكل 4C). تم استخراج الحمض النووي من جزء من العضو العضوي مع الحفاظ على الباقي في الثقافة. أسفر تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل لموضع Pax6 المستهدف بواسطة gRNA عن نطاق 367 bp لكل من الحيوانات المستنسخة التي تم اختيارها (الشكل 4D). بعد تسلسل الموضع المضخم ، تم الاحتفاظ بالنسخ المستنسخة التي تم تحريرها بشكل متماثل C > T (n = 1). من ناحية أخرى ، تم تجاهل الحيوانات المستنسخة التي لم يتم تحريرها (n = 4) ، أو تم تحريرها بشكل غير متجانس ، أو تم تحريرها بشكل خاطئ (n = 1) (الشكل 4E). بشكل عام ، باستخدام هذا gRNA الذي يستهدف Pax6 ، تم الحصول على نسخة واحدة من الغدة الدمعية للفأر متماثل الزيجوت من أصل ستة متتابعة. نمت بعض الحيوانات المستنسخة بشكل جيد ، لكن بعض الحيوانات المستنسخة العضوية فقدت بعد قطفها أو بدأت في التمايز (الشكل 4F). من بين 10 استنساخ عضوي تم اختياره ، نمت 7 بشكل جيد.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65040/65040fig04.jpg"> الشكل 4: الضربة القاضية بوساطة تحرير القاعدة ل Pax6 في عضويات الغدة الدمعية للفأر. (أ) تتبع تسلسل سانجر ل pFYF1320 بعد التكامل الصحيح ل gRNA الذي يستهدف موضع Pax6. (ب) صور برايتفيلد لعضويات الغدة الدمعية للفأر بعد 5 أيام من التعرض للهيجروميسين بعد التثقيب الكهربائي. تم استزراع المواد العضوية في وسط تمدد الفئران. على اليسار مثال على فشل التثقيب الكهربائي ، مع عدم وجود استنساخ مقاوم للهيجروميسين ينمو. على اليمين مثال على التثقيب الكهربائي الناجح ، مع بقاء العديد من الحيوانات المستنسخة العضوية المقاومة للهيجروميسين. (ج) صور برايتفيلد للمستنسخات التي يجب قطفها والحيوانات المستنسخة التي لا ينبغي قطفها. (د) هلام الأغاروز يوضح تضخيم موضع Pax6 المستهدف بالحمض النووي الريبوزي الريبوزي (gRNA). باللون الأخضر ، يتم تمييز النطاق بالحجم المتوقع البالغ 367 نقطة أساس. ه: تتبع تسلسل سانجر لثلاث مستنسخات عضوية مقاومة للهيجروميسين. الاستنساخ العلوي غير محرر. الاستنساخ الأوسط هو إصدار C > T متماثل الزيجوت ، وبالتالي ، خروج المغلوب متماثل الزيجوت. يقدم الاستنساخ السفلي طفرتين نقطيتين متغايرة الزيجوت وهو إما خروج المغلوب غير المتجانس أو استنساخ مختلط وقد تم تحريره بشكل خاطئ. (F) صور برايتفيلد للمستنسخات العضوية المنتقاة بمستويات مختلفة من النمو. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65040/65040fig04large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
أخيرا ، لإجراء عملية زرع تقويم الغدة الدمعية البشرية في الفئران ، تم استخدام المواد العضوية التي تم تقسيمها قبل 3 أيام (< 100 ميكرومتر في القطر). تم تأكيد النقش العضوي بعد شهر 1 من حقن المواد العضوية في الغدة الدمعية للفأر عن طريق تلطيخ علامة خاصة بالإنسان ، المستضد النووي البشري (الشكل 5). يشير عدم وجود تلطيخ نقطي من جميع أقسام الغدة الدمعية للفأر إلى نقص النقش العضوي البشري.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65040/65040fig05.jpg"> الشكل 5: زرع عضويات الغدة الدمعية في الإنسان في الغدة الدمعية للفأر. تلطيخ الغدد الدمعية للفأر المزروعة لعلامة النواة البشرية لمراقبة engraftment 1 شهر بعد الزرع. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65040/65040fig05large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
الجدول التكميلي 1: تكوين وسائط الإعلام والمخازن المؤقتة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65040/Supplementary%20Table%201.xlsx" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Establishment, Maintenance, Differentiation, Genetic Manipulation, and Transplantation of Mouse and Human Lacrimal Gland Organoids at JoVE.com

Establishment, Maintenance, Differentiation, Genetic Manipulation, and Transplantation of Mouse and Human Lacrimal Gland Organoids

يصف هذا البروتوكول كيفية إنشاء عضويات الغدة الدمعية المشتقة من الفئران الأولية والأنسجة البشرية وصيانتها وتعديلها وراثيا وتمييزها وظيفيا وتوصيفها وظيفيا.

إنشاء وصيانة وتمايز والتلاعب الجيني وزرع عضويات الغدة الدمعية البشرية والفأر

The lacrimal gland is an essential organ for ocular surface homeostasis. By producing the aqueous part of the tear film, it protects the eye from ...

باستخدام عضويات الغدة الدمعية، يمكن النظر في كيفية تحكم جينات معينة في توازن الغدة الدمعية. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام المواد العضوية للطب التجديدي. الميزة الرئيسية لتقنية الغدة الدمعية العضوية المشتقة من الخلايا الجذعية البالغة هي أنها تسمح بنمو ودراسة الخلايا الظهارية للغدة الدمعية السليمة وغير المحولة.يمكن استخدام هذه المواد العضوية في نهاية المطاف لعلاج المرضى الذين يعانون من مرض جفاف العين. ابدأ بإعداد الوسط والمواد المطلوبة للتجربة ، متبوعا بدمج جميع مكونات وسط الهضم قبل التجربة. بلل المشارط مسبقا في هذه الوسيلة لتجنب التصاق قطع الأنسجة بها.استرجع أنسجة الغدة الدمعية للفأر من الوسط ، وضعها في طبق بتري ، وفرمها باستخدام مشارط مبللة مسبقا. بمجرد أن تصبح قطع الأنسجة أقل من 0.5 ملليمتر مكعب ، اكشطها من طبق بتري بالمشرط ، وانقلها إلى أنبوب سعة 15 ملليلتر يحتوي على وسط الهضم. للحصول على خزعة بشرية صغيرة جدا ، ضعها مباشرة في وسط الهضم دون فرم.احتضن الأنبوب الذي يبلغ سعته 15 ملليلترا والذي يحتوي على قطع مناديل لمدة تصل إلى 15 دقيقة في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية. في غضون ذلك ، قم بتضييق طرف ماصة باستور في اللهب ، وقم بترطيبه مسبقا في الوسط الأساسي. لتسهيل عملية التفكك ، ماصة المزيج المفروم لأعلى ولأسفل كل خمس دقائق باستخدام ماصة باستور الضيقة والمبللة مسبقا.عندما تكون العديد من الخلايا المفردة والكتل الصغيرة مرئية تحت المجهر ، أوقف التفكك بإضافة 10 ملليلتر من الوسط الأساسي. بعد الدوران لأسفل عند 400 جرام لمدة خمس دقائق ، قم بإزالة المادة الطافية ، وأعد تعليق الحبيبات في 10 ملليلتر من الوسط الأساسي لتكرار الغسيل والحبيبات أسفل الخلايا. قم بإزالة قطع الأنسجة الكبيرة غير المهضومة وألياف الكولاجين المتبقية عن طريق تصفية الخليط المفروم من خلال مصفاة 70 ميكرومتر.أدر الشطف على 400 جرام لمدة خمس دقائق. بعد إزالة المادة الطافية ، أعد تعليق حبيبات الخلية في 100 ميكرولتر من المصفوفة الباردة خارج الخلية ، أو ECM ، للغدة الدمعية لفأر واحد و 50 ميكرولترا من ECM البارد لخزعة بشرية ، دون إنشاء الفقاعات. قم بزرع ما يصل إلى 100 ميكرولتر من الخلايا لكل بئر من لوحة تعليق ذات 12 بئرا باستخدام P200 لعمل قطرات 20 ميكرولتر تقريبا في البئر.ضع اللوحة رأسا على عقب في حاضنة مرطبة عند 37 درجة مئوية لمدة 20 إلى 30 دقيقة للسماح بتصلب ECM. بمجرد ترسيخ ECM ، أضف ما يقرب من ملليلتر واحد من وسط تمدد الماوس بدرجة حرارة الغرفة لكل بئر من لوحة 12 بئرا. تحضير ملليلتر واحد من وسط التمايز البشري الذي يحتوي على مكونات فردية تحفز إفراز عضويات الغدة الدمعية.في مجهر برايت فيلد الآلي بفاصل زمني ، قم بإعداد المواضع المراد تصويرها في اللوحة ، والفاصل الزمني لمدة خمس دقائق ، ومدة أربع ساعات. تأكد من أن قطرة ECM كاملة مرئية في كل موضع. قبل البدء في التصوير ، قم بإزالة وسط الاستزراع من الآبار المراد تصويره دون تحريك اللوحة من المجهر ، واستبدله بوسط تمايز بشري معد حديثا ومعاد تعليقه جيدا يحتوي على مركبات ، بما في ذلك فورسكولين ونورادرينالين.كعنصر تحكم سلبي ، قم بتضمين بئر مع وسيط تمايز محدث. انقر فوق زر التشغيل على المجهر ، وقم بتحليل النتائج بعد أربع ساعات. بعد فصل المواد العضوية كما هو مذكور في النص ، تخلص من المادة الطافية.أعد تعليق الخلايا في 80 ميكرولترا من المخزن المؤقت للتثقيب الكهربائي. في أنبوب سعة 1.5 ملليلتر، قم بإعداد البلازميدات اللازمة للتجربة. أضف البلازميدات إلى الخلايا ، واخلطها جيدا عن طريق السحب لأعلى ولأسفل.قم بإعداد جهاز الحفر الكهربائي باستخدام معلمات نبض المسام ونقل النبض. ضع الخلايا مع البلازميدات في كوفيت التثقيب الكهربائي. قم بقياس المقاومة على الفور ، والتي يجب أن تكون بين 0.3 أمبير و 0.55 أمبير ، وقم بالكهرباء على الفور.بمجرد الانتهاء من ذلك ، انقل الخلايا إلى أنبوب سعة 1.5 ملليلتر ، وأضف 400 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتثقيب الكهربائي المكمل بمثبط Rho-kinase. اترك الخلايا تتعافى في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك ، قم بتقطيع الخلايا عند 500 جرام لمدة خمس دقائق.بعد التخلص من المادة الطافية ، قم بطلاء الخلايا في 200 ميكرولتر من ECM. بعد التصلب ، أضف وسيط توسيع الماوس. لإعداد عضوي ، قم بتقسيم عضويات الغدة الدمعية البشرية قبل ثلاثة أيام تقريبا من يوم الزرع.لاستخراج المواد العضوية من ECM ، أضف dispase إلى وسط الاستزراع للوصول إلى تركيز نهائي قدره 0.125 وحدة لكل ملليلتر ، وأعد تعليق قطرات ECM تماما لتعطيلها باستخدام P1000. ضع اللوحة مرة أخرى في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. أعد تعليق المواد العضوية في 10 ملليلتر من الوسط الأساسي لغسل الإنزيم.بعد تكوير الخلايا عند 400 جرام لمدة خمس دقائق ، أعد تعليقها في 50 ميكرولترا من وسط التمدد البشري البارد المكمل ب 5٪ ECM. ضع التعليق العضوي على الجليد ، وانتقل فورا إلى عملية الزرع. لزراعة تقويم العظام في الفئران ، نضح تعليق عضوي في إبرة الأنسولين.عندما يكون الماوس نائما ، ضعه بسرعة على جانبه مع إمكانية الوصول إلى الغدة الدمعية الرئيسية. حقن خمسة ميكرولتر من التعليق العضوي مباشرة من خلال الجلد في الغدة الدمعية. اسمح للفأر بالتعافي ، وقم بتقييم وجود أي إزعاج متعلق بالزرع يوميا ، خاصة في العين.بعد تشريح الغدة الدمعية للفأر ، ولد الهضم الأنزيمي والميكانيكي شظايا الأنسجة الصغيرة ، بما في ذلك العنيبات والقنوات. في الاشتقاق العضوي الناجح للغدة الدمعية للفأر ، تم العثور على عضويات كيسية يبلغ قطرها حوالي 500 ميكرومتر بعد سبعة أيام. نمت عضويات الغدة الدمعية البشرية كأكياس في غضون ثلاثة إلى أربعة أيام ووصلت إلى حجم كامل النمو في غضون 10 إلى 14 يوما بعد عزل الأنسجة.بعد خمسة أيام وسبعة أيام ، على التوالي ، في وسط التمايز ، أصبحت عضويات الفأر والغدة الدمعية البشرية أكثر كثافة. أدى تطبيق منشط AMP الدوري فورسكولين أو الناقل العصبي بافراز إلى تورم عضوي في أقل من ثلاث ساعات. في التثقيب الكهربائي الناجح ، نمت المواد العضوية المقاومة للهيجروميسين.تم اختيار الحيوانات المستنسخة العضوية المتنامية التي يزيد حجمها عن 300 ميكرومتر قبل تمايزها. أسفر تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل لموضع Pax6 المستهدف بواسطة الحمض النووي الريبي الموجه عن نطاق زوج أساسي 367 لجميع الحيوانات المستنسخة المختارة. تم الحصول على نسخة واحدة من الغدة الدمعية للفأر الضربة القاضية متماثلة الزيجوت من أصل ستة متسلسلة باستخدام الحمض النووي الريبي الموجه الذي يستهدف Pax6.نمت بعض الحيوانات المستنسخة بشكل جيد ، لكن بعض الحيوانات المستنسخة العضوية فقدت بعد قطفها أو بدأت في التمايز. من بين 10 مستنسخات عضوية تم اختيارها ، نمت سبعة بشكل جيد. تم تأكيد النقش العضوي بعد شهر واحد من حقن المواد العضوية في الغدة الدمعية للفأر عن طريق تلطيخ علامة خاصة بالإنسان ، المستضد النووي البشري.شيء واحد يجب الانتباه إليه هو عدم الإفراط في هضم الأنسجة ، ولا المواد العضوية. خلاف ذلك ، قد تموت الخلايا ، وهذا من شأنه أن يقلل من معدل تكوين العضوية. يمكن تحليل عضويات الغدة الدمعية عن طريق الأنسجة.من خلال القيام بذلك ، يمكن للمرء الحصول على نظرة ثاقبة في تكوينها الخلوي.

Research

JoVE Journal

Biology

Generation of Human CD40-activated B cells

جيل من الخلايا البشرية باء تنشيط CD40

CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been identified as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cancer ...

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells  

الثقافة والمحافظة على الخلايا الجذعية الجنينية البشرية

Human embryonic stem (hES) cells must be monitored and cared for in order to maintain healthy, undifferentiated cultures. At minimum, the cultures must be ...

Isolation and Genetic Manipulation of Adult Cardiac Myocytes for Confocal Imaging

العزلة والتلاعب الجيني لأمراض القلب للبالغين Myocytes التصوير متحد البؤر

Cardiac myocytes isolated from adult hearts are widely accepted as a model somewhere half way between embryonic and neonatal muscle cells on one side and ...

Genetic Modification and Recombination of Salivary Gland Organ Cultures

تعديل وإعادة التركيب الوراثي للاللعابية الثقافات الجهاز الغدة

Branching  morphogenesis occurs during the development of many organs, and the embryonic  mouse submandibular gland (SMG) is a classical model for the ...

Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells

جيل من العضلية الإنسان: البروتوكول التمايز من خالية من الطاعم المستحثة الخلايا الجذعية المحفزة الإنسان

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is ...

Alternative Cultures for Human Pluripotent Stem Cell Production, Maintenance, and Genetic Analysis

الثقافات البديلة لافرة القوة البشرية الجذعية إنتاج الخلية، الصيانة، والتحليل الوراثي

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and ...

Manipulating the Murine Lacrimal Gland

التلاعب في الغدة الدمعية الفئران

The lacrimal gland (LG) secretes aqueous tears necessary for maintaining the structure and function of the cornea, a transparent tissue essential for ...

Establishment and Maintenance of Gnotobiotic American Cockroaches (Periplaneta americana)

Establishment and Maintenance of Gnotobiotic American Cockroaches Periplaneta americana

إنشاء وصيانة الصراصير الأمريكية الغنوتوبيوتية (Periplaneta americana)

Gnotobiotic animals are a powerful tool for the study of controls on microbiome structure and function. Presented here is a protocol for the establishment ...

Establishment and Genetic Manipulation of Murine Hepatocyte Organoids

إنشاء والتلاعب الجيني من الأورجانويدات مورين الكبدية

The liver is the largest organ in mammals. It plays an important role in glucose storage, protein secretion, metabolism and detoxification. As the ...

Three-Dimensional, Serum-Free Culture System for Lacrimal Gland Stem Cells

نظام استزراع ثلاثي الأبعاد خال من المصل للخلايا الجذعية للغدة الدمعية

Lacrimal gland (LG) stem cell-based therapy is a promising strategy for lacrimal gland diseases. However, the lack of a reliable, serum-free culture ...