Name: establishment, maintenance, differentiation, genetic manipulation, and transplantation of mouse and human lacrimal gland organoids
Uploaded: 2023-02-03T14:15:00
Duration: 10 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Establishment, Maintenance, Differentiation, Genetic Manipulation, and Transplantation of Mouse and Human Lacrimal Gland Organoids at JoVE.com

我们感谢Yorick Post对协议的初步开发。这项工作部分得到了英国癌症研究大挑战赛（C6307 / A29058）和马克癌症研究基金会对SPECIFICANCER团队的奖励的支持。

<ol>
	<li>Garg, A., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lacrimal+gland+development:+From+signaling+interactions+to+regenerative+medicine.">Lacrimal gland development: From signaling interactions to regenerative medicine.</a> Developmental Dynamics. 246 (12), 970-980 (2017).</li><li>Selinger, D. S., Selinger, R. C., Reed, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resistance+to+infection+of+the+external+eye:+The+role+of+tears.">Resistance to infection of the external eye: The role of tears.</a> Survey of Ophthalmology. 24 (1), 33-38 (1979).</li><li>Messmer, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathophysiology,+diagnosis,+and+treatment+of+dry+eye+disease.">The pathophysiology, diagnosis, and treatment of dry eye disease.</a> Deutsches Arzteblatt International. 112 (5), 71-81 (2015).</li><li>Massie, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+lacrimal+gland+spheroids+for+lacrimal+gland+tissue+regeneration.">Development of lacrimal gland spheroids for lacrimal gland tissue regeneration.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (4), 2001-2009 (2018).</li><li>Tiwari, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+human+lacrimal+gland+cultures+with+secretory+function.">Establishing human lacrimal gland cultures with secretory function.</a> PloS One. 7 (1), 29458 (2012).</li><li>Nguyen, D. H., Beuerman, R. W., Halbert, C. L., Ma, Q., Sun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+immortalized+rabbit+lacrimal+gland+epithelial+cells.">Characterization of immortalized rabbit lacrimal gland epithelial cells.</a> In Vitro Cellular &amp; Developmental Biology. Animal. 35 (4), 198-204 (1999).</li><li>Bannier-H&#233;laou&#235;t, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+human+lacrimal+gland+using+organoids+and+single-cell+sequencing.">Exploring the human lacrimal gland using organoids and single-cell sequencing.</a> Cell Stem Cell. 28 (7), 1221-1232 (2021).</li><li>Hayashi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+3D+lacrimal+gland+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells.">Generation of 3D lacrimal gland organoids from human pluripotent stem cells.</a> Nature. 605 (7908), 126-131 (2022).</li><li>Jeong, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+functional+epithelial+organoids+from+human+lacrimal+glands.">Establishment of functional epithelial organoids from human lacrimal glands.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 12 (1), 247 (2021).</li><li>Hofer, M., Lutolf, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+organoids.">Engineering organoids.</a> Nature Reviews Materials. 6 (5), 402-420 (2021).</li><li>Meyenberg, M., Ferreira da Silva, J., Loizou, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+specific+DNA+repair+outcomes+shape+the+landscape+of+genome+editing.">Tissue specific DNA repair outcomes shape the landscape of genome editing.</a> Frontiers in Genetics. 12, 728520 (2021).</li><li>Geurts, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-based+adenine+editors+correct+nonsense+mutations+in+a+cystic+fibrosis+organoid+biobank.">CRISPR-based adenine editors correct nonsense mutations in a cystic fibrosis organoid biobank.</a> Cell Stem Cell. 26 (4), 503-510 (2020).</li><li>Overmyer, K. A., Thonusin, C., Qi, N. R., Burant, C. F., Evans, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+anesthesia+and+euthanasia+on+metabolomics+of+mammalian+tissues:+Studies+in+a+C57BL/6J+mouse+model.">Impact of anesthesia and euthanasia on metabolomics of mammalian tissues: Studies in a C57BL/6J mouse model.</a> PLoS One. 10 (2), 0117232 (2015).</li><li>Driehuis, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+mucosal+organoids+as+a+potential+platform+for+personalized+cancer+therapy.">Oral mucosal organoids as a potential platform for personalized cancer therapy.</a> Cancer Discovery. 9 (7), 852-871 (2019).</li><li>Froger, A., Hall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+plasmid+DNA+into+E.+coli+using+the+heat+shock+method.">Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method.</a> Journal of Visualized Experiments. (6), e253 (2007).</li><li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li><li>Lian, J., Meng, X., Zhang, X., Hu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+genetic+manipulation+of+murine+hepatocyte+organoids.">Establishment and genetic manipulation of murine hepatocyte organoids.</a> Journal of Visualized Experiments. (180), e62438 (2022).</li><li>L&#245;hmussaar, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+organoids+model+cervical+tissue+dynamics+and+viral+oncogenesis+in+cervical+cancer.">Patient-derived organoids model cervical tissue dynamics and viral oncogenesis in cervical cancer.</a> Cell Stem Cell. 28 (8), 1380-1396 (2021).</li><li>Bloh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deconvolution+of+complex+DNA+repair+(DECODR):+Establishing+a+novel+deconvolution+algorithm+for+comprehensive+analysis+of+CRISPR-edited+Sanger+sequencing+data.">Deconvolution of complex DNA repair (DECODR): Establishing a novel deconvolution algorithm for comprehensive analysis of CRISPR-edited Sanger sequencing data.</a> The CRISPR Journal. 4 (1), 120-131 (2021).</li><li>Latta, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiology+of+aniridia-associated+keratopathy:+Developmental+aspects+and+unanswered+questions.">Pathophysiology of aniridia-associated keratopathy: Developmental aspects and unanswered questions.</a> The Ocular Surface. 22, 245-266 (2021).</li><li>Veernala, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lacrimal+gland+regeneration:+The+unmet+challenges+and+promise+for+dry+eye+therapy.">Lacrimal gland regeneration: The unmet challenges and promise for dry eye therapy.</a> The Ocular Surface. 25, 129-141 (2022).</li><li>Hayashi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+3D+lacrimal+gland+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells.">Generation of 3D lacrimal gland organoids from human pluripotent stem cells.</a> Nature. 605 (7908), 126-131 (2022).</li></ol>

Hans Clevers是巴塞尔罗氏制药研究和早期开发负责人，拥有多项与类器官技术相关的专利。

该协议描述了泪腺类器官的建立和使用，用于功能测定，突变建模和移植。在建立小鼠和人泪腺类器官时，组织解离至关重要。如果组织没有被充分消化，类器官产量就会很低。如果组织被过度消化，细胞就会死亡，不会以类器官的形式生长出来。每个组织应用特定酶消化特定时间，以确保最佳的类器官生长14，17，18。泪腺是一种相当柔软的组织，5-10分钟的胶原酶消化结合基于移液的机械解离足以分离小块组织。如果需要获得单细胞用于单细胞RNA测序等应用，解离可以进行更长时间，直到达到单细胞阶段，但一旦获得单细胞，应立即停止解离，以限制活力的任何降低。由于组织解离至关重要，过度消化是泪腺类器官建立失败的最可能原因。
泪腺类器官的适当维护对其使用很重要。与诱导多能干细胞衍生类器官相比，长期维持是成体干细胞来源的泪腺类器官的标志7，17。为了实现长期维持，应定期进行类器官分裂和培养基更换。没有这一点，类器官开始分化并发展出降低的干细胞潜力，这阻碍了它们的长期维持7。在这一步，过度消化会杀死干细胞并损害类器官的维持。对于定期维护，不需要将类器官解离成单个细胞。然而，要产生克隆敲除类器官系，从单细胞开始至关重要。如果没有，类器官将由具有不同遗传背景的细胞马赛克组成，使得分析单个定义的突变的影响变得不可能。在这里，我们描述了使用 C > T 碱基编辑器来生成终止密码子。该基因组编辑器依赖于NGG PAM的12-18个碱基内精氨酸，谷氨酰胺或色氨酸密码子的存在。当在设计gRNA时不满足这些条件时，可以使用具有替代PAM的常规Cas9或C >T碱基编辑器7，18。然而，传统的Cas9引入了双链断裂，导致修复时产生插入缺失11。由于两个等位基因可能携带不同的插入缺失，克隆基因分型需要格外小心。应执行引入修饰的反卷积，以确保两个等位基因都包含帧外插入缺失，因此，类器官克隆针对靶向基因19进行敲除。C > T 碱基编辑器的优势在于它们可用于模拟不一定导致终止密码子的点突变。例如，它们可用于模拟在无虹膜患者中发现的特定Pax6突变，以研究它们对泪腺生理学的影响20。
泪腺分泌泪膜的水部分1。在生长因子撤出和NOTCH抑制介导的分化后，泪液分泌可以在人类器官中重现。在这些条件下，类器官经历末端分化，无法进一步维持。然而，分化的泪腺类器官可以指导干眼症背景下催泪药物的开发，可能在高通量筛查中。该协议中提出的撕裂测定是目前在短时间内类器官大小变化最大的测定，这使得在药物筛选的背景下更容易量化7，9，17。
干细胞疗法在干眼症中泪腺再生方面具有巨大前景21。成体干细胞衍生的泪腺类器官可以作为此类应用的源材料。这里介绍的方案导致人泪腺类器官植入，主要是囊肿。由于类器官被注射到错误的部位，可能会出现类器官植入率低。用染料训练注射过程可以跟踪注射部位，并最终提高注射精度。或者，可以切开小鼠表皮以直接进入泪腺，就像在22岁之前的大鼠所做的那样。此方法需要更长的时间，但可能更准确。另一方面，使用本协议，类器官在功能上没有整合到小鼠泪腺中。对于 iPSC 衍生的泪腺植入术也观察到了类似的结果22.通过提前损伤泪腺，使用干眼小鼠模型和/或将类器官作为单细胞或小团块注射，可以进一步改进移植方法。然而，成体干细胞来源的泪腺类器官和相关工具包可以成为未来在泪腺研究和再生医学中应用的基础。

泪腺是负责产生泪膜大部分水层的腺上皮1。泪膜的水层不仅含有润滑眼表的水，还含有大量抗菌成分，可保护眼表免受感染2。当泪腺受损或发炎时，会发生干眼症，这会导致患者不适，并最终导致视力丧失3。多年来，研究泪腺，特别是人类腺体的模型系统一直受到限制4，5，6。这导致了关于生理和病理条件下泪腺功能的知识差距。
最近，已经开发了体外模型来研究培养皿中的泪腺7，8，9。这些泪腺类器官来源于在细胞外基质中以三维结构生长的成体干细胞，并辅以生长因子混合物，以维持其在体外的再生能力7。成体干细胞（ASC）衍生类器官的优点是它们可以维持很长时间，同时概括健康的组织特征。这种类型的类器官仅由上皮细胞组成，这与诱导多能干细胞（iPSC）衍生的类器官不同，后者也可能含有基质细胞。与多能干细胞（PSC）衍生的类器官不同，ASC类器官直接从成人组织建立，不需要任何遗传修饰即可扩增。ASC类器官表达成人特征10.
该协议包含一个工具箱，用于从小鼠和人类原代组织中提取泪腺类器官。该协议描述了如何通过简单的生长因子提取来进一步增强类器官的功能，以及如何通过进行肿胀测定来激发类器官分泌泪液。该协议还包括一种基于电穿孔的转染方法，用于使用CRISPR衍生的碱基编辑器对小鼠类器官进行基因工程。与传统的Cas9不同，使用碱基编辑器允许修饰基因组中的单个碱基，而不会产生双链断裂11，12。最后，描述了将人泪腺类器官原位移植到免疫缺陷小鼠中以及随后对植入物的组织学评估。该泪腺类器官工具包可用于泪腺再生和功能研究以及遗传和炎症疾病建模。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL safe-lock centrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>EP0030 120.094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,3&#8242;-Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrate (DAB)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5637</td>
			<td>CAS: 868272-85-9 , CAUTION, 6 g/L solution can be stored aliquotted at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5x green GoTaq Flexi buffer</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M891A</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A83-01</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2939</td>
			<td>Store at -20 &#176;C, stock at 30 mM, 10000x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12634-010</td>
			<td>store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar plates containing Ampicillin</td>
			<td>Hubrecht Institute</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave VAPOUR-Line lite</td>
			<td>VWR chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>Store at -20 &#176;C, 50x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Micro-Fine insulin needle 1 mL</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>324825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop microscope DMI1</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumine (BSA)</td>
			<td>MP biomedicals</td>
			<td>160069</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BTXpress</td>
			<td>BTX</td>
			<td>MDS450805</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 mice</td>
			<td>Hubrecht Institute</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cassettes</td>
			<td>Klinipath</td>
			<td>410-02S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellBanker 1</td>
			<td>amsbio</td>
			<td>11910</td>
			<td>Cryopreservation medium, adhere to instructions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid monohydrate</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>0088</td>
			<td>CAS: 5949-29-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase I</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C9407</td>
			<td>Aliquots at 20 mg/mL, 20x, store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes 15 mL</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>5618-8271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes 50 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS430828-500EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips 24 mm x 50 mm</td>
			<td>Menzel-Gl&#228;zer</td>
			<td>BB024050S1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex Basement Membrane Extract (BME), Growth Factor Reduced, Type 2 - extracellular matrix</td>
			<td>R&#38;D Systems, Bio-Techne</td>
			<td>3533-001-02</td>
			<td>Store at -20 &#176;C, keep at 4 &#176;C for up to 1 month</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPT</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D5942</td>
			<td>Store at -20 &#176;C, stock at 10 mM, 1000x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium hydrogen phosphate anhydrous</td>
			<td>VWR chemicals</td>
			<td>28026.292</td>
			<td>CAS: 7558-79-4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Di-sodiumhydrogenphosphate dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71643</td>
			<td>CAS:10028-24-7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>17105-041</td>
			<td>Aliquots at 50 U/mL, store at -20 &#176;C until use, 400x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Scalpel Sterile N&#176; 10</td>
			<td>Swann Morton</td>
			<td>3033838</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DM4000 microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTPs 25 mM</td>
			<td>Promega</td>
			<td>U1420</td>
			<td>Mix all 4 nucleotides together, Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dpn1</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate-bufferd Saline (DPBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190144</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Easy strainers 70 &#181;m</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>542170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation cuvette</td>
			<td>Nepagene</td>
			<td>EC002S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EnVision+/HRP mouse</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>K400111-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 100%</td>
			<td>BOOM</td>
			<td>84045206;5000</td>
			<td>CAUTION, Use to prepare other Ethanol dilutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 70%</td>
			<td>BOOM</td>
			<td>84010059.5000</td>
			<td>CAUTION</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 96%</td>
			<td>BOOM</td>
			<td>84050065.5000</td>
			<td>CAUTION</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS FL Auto 2 Cell Imaging System</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Live-imaging brightfield microscrope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF10</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-26</td>
			<td>Store at -20 &#176;C, stock at 100 mg/mL in base medium, 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td>NIH, Fiji developers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution 4%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1.00496</td>
			<td>CAS: 50-00-0, CAUTION</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1099</td>
			<td>Store at -20 &#176;C, stock at 10 mM, 10000x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GoTaq G2 Flexi DNA Polymerase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M7805</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Haematoxylin</td>
			<td>VWR chemicals</td>
			<td>10047105</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td>Store at 4 &#176;C, 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histocore H and C, Tissue embedding machine</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate</td>
			<td>Meidax</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human nucleolar antigen antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab-190710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid 5 N</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10605882</td>
			<td>CAS: 7647-01-0, CAUTION</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxyde 30%</td>
			<td>Chem-lab</td>
			<td>CL00.2308.1000</td>
			<td>CAS: 7722-84-1, CAUTION</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygromycin B-gold</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ant-hg</td>
			<td>Stock at 100 mg/&#181;L, 1000x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygromycin resistance cassette-containing plasmid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Andersson-Rolf et al, Nature Methods, 2017. doi: 10.1038/nmeth.4156</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IsoFlo 100%</td>
			<td>Mecan</td>
			<td>5960501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB medium</td>
			<td>Hubrecht Institute</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 25 mM</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A351H</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome RM2235</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Midiprep DNA isolation kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>K210005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniprep DNA isolation kit</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>K210003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetylcysteine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9165</td>
			<td>Store at -20 &#176;C, stock at 500 mM, 400x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEPA21 electroporator</td>
			<td>Nepagene</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>N0636</td>
			<td>Store at -20 &#176;C, stock at 1M, 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOD Scid Gamma (NSG) mice</td>
			<td>Hubrecht Institute colony</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noggin conditioned medium</td>
			<td>U-Protein Express</td>
			<td>Custom order</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noradrenaline</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A7257</td>
			<td>Store at -20 &#176;C, stock at 100 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Memmert</td>
			<td></td>
			<td>Set at 58 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P20, P200 and P1000 pipettes</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin</td>
			<td>VWR chemicals</td>
			<td>10048502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipettes, glass plugged</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>1150-6973</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pax6_C&#62;T_F: AGACTGTTCCAGGATGGCTG&#160;</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pax6_C&#62;T_R: TCTCCTAGGTACTGGAAGCC&#160;</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCMV_ABEmax_P2A_GFP</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>112101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pertex</td>
			<td>Klinipath</td>
			<td>AM-08010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pFYF1320&#160;</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>47511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ant-pm-1</td>
			<td>1000X, store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prostaglandin E2 (PGE2)</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2296</td>
			<td>Store at -20 &#176;C, stock at 10 mM, 10000x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish, 10 cm</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>633102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B9027S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 high-fidelity DNA polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0491S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuickExtract DNA Extraction Solution</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>QE09050</td>
			<td>Store aliquots at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-spondin 3 conditioned medium</td>
			<td>U-Protein Express</td>
			<td>Custom order</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sgRNA Reverse Primer: TCTGCGCCCATCTGTTGCTT CGGTGTTTCGTCCTTTCCACAAG</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides</td>
			<td>StarFrost</td>
			<td>MBB-0302-55A</td>
			<td>Adhesive, ground</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8.22335.1000</td>
			<td>CAS: 26628-22-8, CAUTION</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium cytrate dihydrate</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>0280</td>
			<td>CAS: 6132-04-3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Forward Primer: &#8220;/5phos/ GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG 
			TTAAAATAAGGC</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Subcloning efficiency competent cells DH5alpha</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18265-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suspension cell culture plates (24-well)</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>662102</td>
			<td>24-well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suspension cell culture plates (12-well)</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>665102</td>
			<td>12-well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAE buffer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>B49</td>
			<td>Stock at 50x, dilute to 1x with ultrapure water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transposase-containing plasmid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Andersson-Rolf et al, Nature Methods, 2017. doi: 10.1038/nmeth.4156</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express Enzyme</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12605-028</td>
			<td>store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U6_Forward primer: GGGCAGGAAGAGGGCCTAT</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Agarose 1000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Tulabo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Klinipath</td>
			<td>4055-9005</td>
			<td>CAS: 1330-20-7, CAUTION</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Abmole Bioscience</td>
			<td>Y-27632 dihydrochloride</td>
			<td>Store at -20 &#176;C, stock at 10 mM, 1000x</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishment, maintenance, differentiation, genetic manipulation, and transplantation of mouse and human lacrimal gland organoids

泪腺是眼表稳态的重要器官。通过产生泪膜的水性部分，它可以保护眼睛免受干燥应力和外部侮辱。由于缺乏足够的 体外 模型，对泪腺（病理）生理学知之甚少。类器官技术已被证明是多个器官的有用实验平台。在这里，我们分享了一个从泪腺活检开始建立和维护小鼠和人泪腺类器官的方案。通过改变培养条件，我们增强了泪腺类器官的功能。类器官功能可以通过“哭泣”测定来探测，该测定涉及将泪腺类器官暴露于选定的神经递质以触发其腔中的泪液释放。我们解释了如何对这种现象进行成像和量化。为了研究感兴趣的基因在泪腺稳态中的作用，这些基因可以进行基因改造。我们彻底描述了如何使用碱基编辑器对泪腺类器官进行基因修饰 - 从指南RNA设计到类器官克隆基因分型。最后，我们展示了如何通过原位植入小鼠来探测人泪腺类器官的再生潜力。总之，这个全面的工具集提供了使用小鼠和人类泪腺类器官来研究泪腺（病理）生理学的资源。

在解剖小鼠泪腺（图2A）后，酶和机械消化产生小组织碎片，其中可以区分腺泡和导管（图2B）。剩余的大块组织会破坏ECM的稳定性，从而减少最初的类器官生长。当在~7天后发现~500μm直径的囊性类器官时，小鼠泪腺类器官衍生成功，这是类器官准备分裂的阶段（图2C）。即使整个类器官衍生成功，一些类器官也可能在最终停止之前开始生长。人泪腺类器官在3-4天内生长为囊肿，并在组织分离后10-14天内达到完全生长的大小（图2D）。对于小鼠和人类来说，类器官的衍生有时会失败，没有或很少有类器官生长出来;这通常是由组织的过度消化引起的。小鼠泪腺类器官可以传代至少40倍，人类类器官至少传代20倍。传代平均每7-10天进行一次，具体取决于类器官的生长。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65040/65040fig02.jpg"> 图2：小鼠和人类泪腺类器官的建立。 （A）小鼠泪腺解剖不同阶段的照片。箭头指向其保护膜下的泪腺。（B）组织消化后小鼠泪腺细胞的明场图像，插图显示腺泡和导管。（C）成功和不成功的小鼠泪腺类器官衍生的明场图像。（D）14天内人类类器官生长的明场图像。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65040/65040fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的大图。</a>
泪腺类器官在扩增培养基中培养时含有大比例的干细胞。为了提高它们的分化水平，我们建立了生长因子含量降低的小鼠和人类分化培养基。分别在分化培养基中5天和7天后，小鼠和人泪腺类器官变得更致密（图3A-B）。这种形态变化与功能特性的增加相关。应用环AMP激活剂佛司可林或神经递质去甲肾上腺素导致类器官肿胀（即，顶端水分泌）在不到3小时内（图3C）。当肿胀时间超过3-4小时时，这表明类器官没有足够分化和/或没有表达功能标志物，例如神经递质的受体。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65040/65040fig03.jpg"> 图3：小鼠和人泪腺类器官的分化和人类器官的功能肿胀测定。 （A）小鼠泪腺类器官在扩增培养基中培养7天，在分化培养基中培养2天后培养5天的明场图像。（B）在扩增培养基中培养11天的人泪腺类器官的明场图像，在扩展培养基中培养2天后在分化培养基中培养9天。（C） 分化人泪腺类器官暴露于新鲜分化培养基（对照）、1 μM 佛司可林和 100 μM 去甲肾上腺素的明场图像 3 小时。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65040/65040fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的大图。</a>
为了敲除小鼠泪腺类器官中的Pax6，通过PCR和连接生成含有所选Pax6靶向gRNA的质粒（图4A）。该含gRNA的质粒与Piggy-Bac质粒（含潮霉素抗性转座子和含转座酶的质粒）和C> T碱基编辑器Cas9一起在小鼠泪腺类器官中解离成单细胞。3天后，当类器官恢复时，它们暴露于潮霉素以选择包含潮霉素抗性盒的克隆。在成功的电穿孔中，生长出对潮霉素具有抗性的类器官（图4B）。挑选大于~300μm的生长类器官克隆，理想情况下在它们开始自发分化之前（图4C）。从部分类器官中提取DNA，同时将其余部分保留在培养物中。gRNA靶向的Pax6位点的PCR扩增为每个选择的克隆产生367 bp条带（图4D）。对扩增的位点进行测序后，保留纯合C>T编辑（n = 1）的克隆。另一方面，未编辑（n = 4），杂合编辑或错误编辑（n = 1）的克隆被丢弃（图4E）。总体而言，使用这种靶向Pax6的gRNA，获得了六个测序的纯合敲除小鼠泪腺克隆。一些克隆生长良好，但一些类器官克隆在采摘后丢失或开始分化（图4F）。在挑选的10个类器官克隆中，有7个生长良好。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65040/65040fig04.jpg"> 图 4：小鼠泪腺类器官中碱基编辑介导的 Pax6 敲除。 （A）靶向Pax6位点的gRNA正确整合后pFYF1320的Sanger测序痕迹。（B）电穿孔后暴露于潮霉素5天后小鼠泪腺类器官的明场图像。将类器官在小鼠扩增培养基中培养。左边是一个电穿孔失败的例子，没有对潮霉素有抗性的克隆生长出来。右边是一个成功的电穿孔的例子，有几个耐湿霉素的类器官克隆幸存下来。（C）应选取的克隆和不应选取的克隆的明场图像。（D）琼脂糖凝胶显示gRNA靶向Pax6位点的扩增。绿色表示预期大小为 367 bp 的波段突出显示。（E）对三个对潮霉素耐药的类器官克隆进行Sanger测序。顶部克隆未编辑。中间克隆是纯合C>T版，因此是纯合基因敲除。底部克隆呈现两个杂合点突变，要么是杂合敲除，要么是混合克隆，并且被错误地编辑了。（F）具有不同生长水平的采摘类器官克隆的明场图像。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65040/65040fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的大图。</a>
最后，为了在小鼠中进行人泪腺类器官原位移植，使用提前3天分裂的类器官（直径<100μm）。在将类器官注射到小鼠泪腺中1个月后，通过染色人类特异性标记物人核仁抗原，确认了类器官植入（图5）。小鼠泪腺所有部分没有点状染色表明缺乏人类类器官植入。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65040/65040fig05.jpg"> 图5：将人泪腺类器官移植到小鼠泪腺中。 移植小鼠泪腺染色以检测人核仁标志物，以监测移植后1个月的植入情况。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65040/65040fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的大图。</a>
补充表1：培养基和缓冲液的组成。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65040/Supplementary%20Table%201.xlsx" target="_blank">请按此下载此表格。</a>

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Establishment, Maintenance, Differentiation, Genetic Manipulation, and Transplantation of Mouse and Human Lacrimal Gland Organoids

该协议描述了如何建立，维持，基因修饰，分化，功能表征和移植源自原代小鼠和人体组织的泪腺类器官。

小鼠和人泪腺类器官的建立、维持、分化、遗传操作和移植

The lacrimal gland is an essential organ for ocular surface homeostasis. By producing the aqueous part of the tear film, it protects the eye from ...

使用泪腺类器官，人们可以研究某些基因如何控制泪腺稳态。此外，类器官可用于再生医学。成体干细胞衍生的泪腺类器官技术的主要优点是它允许健康和未转化的泪腺上皮细胞的生长和研究。这些类器官最终可用于治疗干眼症患者。首先准备实验所需的培养基和材料，然后在实验前结合消化培养基的所有成分。在这种培养基中预先润湿手术刀，以避免组织碎片粘在上面。从培养基中取出小鼠泪腺组织，将其放入培养皿中，并使用预先润湿的手术刀将其切碎。一旦组织块小于0.5立方毫米，用手术刀将它们从培养皿上刮下来，然后将它们转移到含有消化培养基的15毫升管中。对于非常小的人活检，将其直接放入消化培养基中，不要切碎。将具有组织碎片的 15 毫升管在 37 摄氏度的水浴中孵育长达 15 分钟。同时，在火焰中缩小巴斯德移液器吸头，并在基础培养基中预润湿。为了便于解离过程，使用预先润湿的窄巴斯德移液管每五分钟上下移液一次切碎的混合物。当在显微镜下可见许多单细胞和小团块时，通过加入10毫升碱基来停止解离。以400g旋转5分钟后，除去上清液，将沉淀重悬于10毫升碱基中，重复洗涤并沉淀细胞。通过 70 微米过滤器过滤切碎的混合物来去除大的、未消化的组织碎片和剩余的胶原纤维。以 400g 离心洗脱液五分钟。除去上清液后，将细胞沉淀重悬于100微升冷细胞外基质或ECM中，用于单个小鼠泪腺和50微升冷ECM用于人活检，而不会产生气泡。使用 P100 在 12 孔悬浮板的每孔中接种多达 200 微升细胞，以在孔中产生约 20 微升液滴。将板倒置在 37 摄氏度的加湿培养箱中 20 至 30 分钟，以使 ECM 固化。一旦ECM固化，每孔12孔板加入约1毫升室温小鼠扩增培养基。新鲜制备一毫升人分化培养基，其中含有诱导泪腺类器官分泌的单个成分。在自动明场延时显微镜下，设置要在板中成像的位置，时间间隔为五分钟，持续时间为四小时。确保每个位置都可以看到整个 ECM 液滴。在开始成像之前，从要成像的孔中取出培养基，而无需将板从显微镜上移开，并用新鲜制备的，重悬良好的人分化培养基代替含有化合物，包括佛司可林和去甲肾上腺素。作为阴性对照，包括具有更新分化培养基的孔。单击显微镜上的运行按钮，并在四小时后分析结果。如文中提到解离类器官后，弃去上清液。将细胞重悬于80微升电穿孔缓冲液中。在1.5毫升管中，制备实验所需的质粒。将质粒添加到细胞中，并通过上下移液充分混合。使用穿孔脉冲和传输脉冲的参数设置电穿孔器。将带有质粒的细胞放入电穿孔比色皿中。立即测量电阻，电阻应在 0.3 安培到 0.55 安培之间，并立即电穿孔。完成后，将细胞转移到1.5毫升管中，并加入400微升电穿孔缓冲液，并补充有Rho激酶抑制剂。让细胞在室温下恢复30分钟。接下来，将细胞沉淀在 500 克中五分钟。弃去上清液后，将细胞接种在200微升ECM中。凝固后，加入鼠标膨胀介质。对于类器官制备，在移植日前约三天拆分人泪腺类器官。要从ECM中提取类器官，将分散酶添加到培养基中以达到每毫升0.125单位的最终浓度，并使用P1000彻底重悬ECM液滴以破坏它们。将板放回 37 摄氏度的培养箱中 30 分钟。将类器官重悬于10毫升碱基中以洗掉酶。将细胞沉淀在400g下五分钟后，将它们重悬于补充有5%ECM的50微升冷人扩增培养基中。将类器官悬浮液放在冰上，然后立即进行移植。对于小鼠的原位移植，在胰岛素针中吸出类器官悬浮液。当鼠标睡着时，快速将其侧放，主泪腺可触及。将五微升类器官悬浮液直接通过皮肤注入泪腺。让小鼠恢复，并每天评估是否存在任何与移植相关的不适，尤其是在眼睛中。在解剖小鼠泪腺后，酶和机械消化产生小的组织碎片，包括腺泡和导管。在成功的小鼠泪腺类器官衍生中，7天后发现了直径约500微米的囊性类器官。人泪腺类器官在三到四天内生长为囊肿，并在组织分离后10到14天内达到完全生长的大小。分别在分化培养基中五天和七天后，小鼠和人泪腺类器官变得更加致密。应用环AMP激活剂佛司可林或神经递质去甲肾上腺素导致类器官肿胀不到三小时.在成功的电穿孔中，生长出对潮霉素有抗性的类器官。生长中的大于300微米的类器官克隆在分化之前被挑选出来。通过引导RNA靶向的Pax6位点的PCR扩增为所有选定的克隆产生了367个碱基对条带。使用靶向Pax6的引导RNA获得六个测序的纯合敲除小鼠泪腺克隆中的一个。一些克隆生长良好，但一些类器官克隆在采摘后丢失或开始分化。在挑选的10个类器官克隆中，有7个生长良好。在将类器官注射到小鼠泪腺一个月后，通过染色人类特异性标记物（人核仁抗原）确认了类器官植入。需要注意的一件事是不要过度消化组织，也不要过度消化类器官。否则，细胞可能会死亡，这将降低类器官的建立率。泪腺类器官可以通过组织学进行分析。通过这样做，人们可以深入了解它们的细胞组成。

Research

JoVE Journal

Biology

Generation of Human CD40-activated B cells

人CD40激活的B细胞的生成

CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been identified as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cancer ...

科研

生物学

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells  

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Human embryonic stem (hES) cells must be monitored and cared for in order to maintain healthy, undifferentiated cultures. At minimum, the cultures must be ...

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成人的心肌细胞的分离和遗传操作共聚焦成像

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Genetic Modification and Recombination of Salivary Gland Organ Cultures

基因改造和重组唾液的腺体器官培养

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Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells

人类心肌细胞的生成：从馈线人类诱导多能干细胞的分化协议

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is ...

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另类文化的人多能干细胞的生产，维护和遗传分析

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and ...

Manipulating the Murine Lacrimal Gland

操纵小鼠泪腺

The lacrimal gland (LG) secretes aqueous tears necessary for maintaining the structure and function of the cornea, a transparent tissue essential for ...

Establishment and Maintenance of Gnotobiotic American Cockroaches (Periplaneta americana)

Establishment and Maintenance of Gnotobiotic American Cockroaches Periplaneta americana

建立和维护侏罗育美国蟑螂 （佩里普拉内塔美洲）

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Establishment and Genetic Manipulation of Murine Hepatocyte Organoids

小鼠肝细胞类器官的建立与遗传操作

The liver is the largest organ in mammals. It plays an important role in glucose storage, protein secretion, metabolism and detoxification. As the ...

Three-Dimensional, Serum-Free Culture System for Lacrimal Gland Stem Cells

用于泪腺干细胞的三维无血清培养系统

Lacrimal gland (LG) stem cell-based therapy is a promising strategy for lacrimal gland diseases. However, the lack of a reliable, serum-free culture ...