Name: establishment, maintenance, differentiation, genetic manipulation, and transplantation of mouse and human lacrimal gland organoids
Uploaded: 2023-02-03T14:15:00
Duration: 10 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Establishment, Maintenance, Differentiation, Genetic Manipulation, and Transplantation of Mouse and Human Lacrimal Gland Organoids at JoVE.com

Vi takker Yorick Post for den indledende udvikling af protokollen. Dette arbejde blev delvist støttet af en pris fra Cancer Research UK Grand Challenge (C6307/A29058) og Mark Foundation for Cancer Research til SPECIFICANCER-teamet.

<ol>
	<li>Garg, A., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lacrimal+gland+development:+From+signaling+interactions+to+regenerative+medicine.">Lacrimal gland development: From signaling interactions to regenerative medicine.</a> Developmental Dynamics. 246 (12), 970-980 (2017).</li><li>Selinger, D. S., Selinger, R. C., Reed, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resistance+to+infection+of+the+external+eye:+The+role+of+tears.">Resistance to infection of the external eye: The role of tears.</a> Survey of Ophthalmology. 24 (1), 33-38 (1979).</li><li>Messmer, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathophysiology,+diagnosis,+and+treatment+of+dry+eye+disease.">The pathophysiology, diagnosis, and treatment of dry eye disease.</a> Deutsches Arzteblatt International. 112 (5), 71-81 (2015).</li><li>Massie, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+lacrimal+gland+spheroids+for+lacrimal+gland+tissue+regeneration.">Development of lacrimal gland spheroids for lacrimal gland tissue regeneration.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (4), 2001-2009 (2018).</li><li>Tiwari, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+human+lacrimal+gland+cultures+with+secretory+function.">Establishing human lacrimal gland cultures with secretory function.</a> PloS One. 7 (1), 29458 (2012).</li><li>Nguyen, D. H., Beuerman, R. W., Halbert, C. L., Ma, Q., Sun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+immortalized+rabbit+lacrimal+gland+epithelial+cells.">Characterization of immortalized rabbit lacrimal gland epithelial cells.</a> In Vitro Cellular &amp; Developmental Biology. Animal. 35 (4), 198-204 (1999).</li><li>Bannier-H&#233;laou&#235;t, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+human+lacrimal+gland+using+organoids+and+single-cell+sequencing.">Exploring the human lacrimal gland using organoids and single-cell sequencing.</a> Cell Stem Cell. 28 (7), 1221-1232 (2021).</li><li>Hayashi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+3D+lacrimal+gland+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells.">Generation of 3D lacrimal gland organoids from human pluripotent stem cells.</a> Nature. 605 (7908), 126-131 (2022).</li><li>Jeong, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+functional+epithelial+organoids+from+human+lacrimal+glands.">Establishment of functional epithelial organoids from human lacrimal glands.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 12 (1), 247 (2021).</li><li>Hofer, M., Lutolf, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+organoids.">Engineering organoids.</a> Nature Reviews Materials. 6 (5), 402-420 (2021).</li><li>Meyenberg, M., Ferreira da Silva, J., Loizou, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+specific+DNA+repair+outcomes+shape+the+landscape+of+genome+editing.">Tissue specific DNA repair outcomes shape the landscape of genome editing.</a> Frontiers in Genetics. 12, 728520 (2021).</li><li>Geurts, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-based+adenine+editors+correct+nonsense+mutations+in+a+cystic+fibrosis+organoid+biobank.">CRISPR-based adenine editors correct nonsense mutations in a cystic fibrosis organoid biobank.</a> Cell Stem Cell. 26 (4), 503-510 (2020).</li><li>Overmyer, K. A., Thonusin, C., Qi, N. R., Burant, C. F., Evans, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+anesthesia+and+euthanasia+on+metabolomics+of+mammalian+tissues:+Studies+in+a+C57BL/6J+mouse+model.">Impact of anesthesia and euthanasia on metabolomics of mammalian tissues: Studies in a C57BL/6J mouse model.</a> PLoS One. 10 (2), 0117232 (2015).</li><li>Driehuis, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+mucosal+organoids+as+a+potential+platform+for+personalized+cancer+therapy.">Oral mucosal organoids as a potential platform for personalized cancer therapy.</a> Cancer Discovery. 9 (7), 852-871 (2019).</li><li>Froger, A., Hall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+plasmid+DNA+into+E.+coli+using+the+heat+shock+method.">Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method.</a> Journal of Visualized Experiments. (6), e253 (2007).</li><li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li><li>Lian, J., Meng, X., Zhang, X., Hu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+genetic+manipulation+of+murine+hepatocyte+organoids.">Establishment and genetic manipulation of murine hepatocyte organoids.</a> Journal of Visualized Experiments. (180), e62438 (2022).</li><li>L&#245;hmussaar, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+organoids+model+cervical+tissue+dynamics+and+viral+oncogenesis+in+cervical+cancer.">Patient-derived organoids model cervical tissue dynamics and viral oncogenesis in cervical cancer.</a> Cell Stem Cell. 28 (8), 1380-1396 (2021).</li><li>Bloh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deconvolution+of+complex+DNA+repair+(DECODR):+Establishing+a+novel+deconvolution+algorithm+for+comprehensive+analysis+of+CRISPR-edited+Sanger+sequencing+data.">Deconvolution of complex DNA repair (DECODR): Establishing a novel deconvolution algorithm for comprehensive analysis of CRISPR-edited Sanger sequencing data.</a> The CRISPR Journal. 4 (1), 120-131 (2021).</li><li>Latta, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiology+of+aniridia-associated+keratopathy:+Developmental+aspects+and+unanswered+questions.">Pathophysiology of aniridia-associated keratopathy: Developmental aspects and unanswered questions.</a> The Ocular Surface. 22, 245-266 (2021).</li><li>Veernala, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lacrimal+gland+regeneration:+The+unmet+challenges+and+promise+for+dry+eye+therapy.">Lacrimal gland regeneration: The unmet challenges and promise for dry eye therapy.</a> The Ocular Surface. 25, 129-141 (2022).</li><li>Hayashi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+3D+lacrimal+gland+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells.">Generation of 3D lacrimal gland organoids from human pluripotent stem cells.</a> Nature. 605 (7908), 126-131 (2022).</li></ol>

Hans Clevers er leder af Pharma Research and Early Development hos Roche, Basel, og har flere patenter relateret til organoidteknologi.

Denne protokol beskriver etablering og anvendelse af lacrimalkirtelorganoider til funktionelle assays, mutationsmodellering og transplantation. Ved etablering af mus- og humane lacrimalkirtelorganoider er vævsdissociation afgørende. Hvis vævet ikke fordøjes tilstrækkeligt, vil organoidudbyttet være lavt. Hvis vævet er overfordøjet, vil cellerne dø og ikke vokse ud som organoider. Hvert væv skal fordøjes med et specifikt enzym i et bestemt tidsrum for at sikre optimal organoid udvækst14,17,18. Lacrimalkirtlen er et ret blødt væv, hvor en kollagenasefordøjelse på 5-10 min kombineret med pipetteringsbaseret mekanisk dissociation er tilstrækkelig til at isolere små stykker væv. Hvis enkeltceller skal opnås til applikationer såsom enkeltcelle RNA-sekventering, kan dissociationen udføres i længere tid, indtil enkeltcellestadiet er nået, men dissociation bør stoppes, så snart enkeltceller opnås for at begrænse ethvert fald i levedygtigheden. Da vævsdissociation er så afgørende, er overfordøjelse den mest sandsynlige årsag til svigt i lacrimalkirtelorganoidetablering.
Den passende vedligeholdelse af lacrimalkirtelorganoider er vigtig for deres anvendelse. Langsigtet vedligeholdelse er et kendetegn ved voksne stamcelleafledte lacrimalkirtelorganoider sammenlignet med inducerede pluripotente stamcelleafledte organoider 7,17. For at opnå langvarig vedligeholdelse skal der udføres regelmæssig organoidopdeling og mediumændringer. Uden dette begynder organoider at differentiere og udvikle nedsat stamcellepotentiale, hvilket hæmmer deres langsigtede vedligeholdelse7. På dette trin igen kan overfordøjelse dræbe stamcellerne og forringe organoid vedligeholdelse. Til regelmæssig vedligeholdelse er organoid dissociation i enkeltceller ikke påkrævet. For at generere klonale knock-out organoide linjer er det imidlertid afgørende at begynde med enkeltceller. Hvis ikke, vil organoiderne bestå af en mosaik af celler med forskellige genetiske baggrunde, hvilket gør det umuligt at analysere effekten af en enkelt, defineret mutation. Her beskriver vi brugen af en C- > T-baseeditor til at generere stopkodoner. Denne genomeditor er afhængig af tilstedeværelsen af arginin-, glutamin- eller tryptophankodoner inden for 12-18 baser fra en NGG PAM. Når disse betingelser ikke er opfyldt ved design af et gRNA, kan konventionelle Cas9- eller C->-baseeditorer med alternative PAM'er anvendes 7,18. Imidlertid introducerer konventionel Cas9 dobbeltstrengede brud, der resulterer i indels ved reparation11. Da begge alleler kan have forskellige indels, kræver klongenotypning yderligere forsigtighed. Dekonvolution af de indførte modifikationer bør udføres for at sikre, at begge alleler indeholder indels uden for rammen, og dermed at organoidkloner slås ud for det gen, der er målrettet19. Fordelen ved C- > T-baseeditorer ligger i, at de kan bruges til at modellere punktmutationer, der ikke nødvendigvis resulterer i stopkodoner. For eksempel kan de bruges til at modellere specifikke Pax6-mutationer, der findes hos patienter med aniridi for at studere deres indvirkning på lacrimalkirtelfysiologi20.
Lacrimalkirtlen udskiller den vandige del af tårefilmen1. Tåresekretion kan rekapituleres i humane organoider efter differentiering medieret af vækstfaktortilbagetrækning og NOTCH-hæmning. Under disse forhold gennemgår organoider terminal differentiering og kan ikke opretholdes yderligere. Alligevel kan differentierede lacrimalkirtelorganoider styre udviklingen af tårefremkaldende lægemidler i forbindelse med tørre øjne, potentielt i skærme med høj kapacitet. Riveanalysen præsenteret i denne protokol er den, der i øjeblikket giver den største ændring i organoidstørrelse på kort tid, hvilket gør det lettere at kvantificere i forbindelse med en lægemiddelskærm 7,9,17.
Stamcelleterapi har et stort løfte om regenerering af tårekirtlen ved tørre øjne21. Voksne stamcelleafledte lacrimalkirtelorganoider kan være et kildemateriale til sådanne anvendelser. Protokollen, der præsenteres her, resulterer i human lacrimalkirtelorganoid engraftment, hovedsagelig som cyster. Lav organoid engraftment kan opstå på grund af organoider, der injiceres på det forkerte sted. Træning af injektionsproceduren med et farvestof gør det muligt at spore injektionsstedet og forbedrer i sidste ende injektionsnøjagtigheden. Alternativt kan museepidermis skæres for at have direkte adgang til lacrimalkirtlen, som det gøres hos rotter før22. Denne metode tager længere tid, men kan være mere nøjagtig. På den anden side integrerede organoiderne med den nuværende protokol ikke funktionelt i musens lacrimalkirtel. Lignende resultater er blevet observeret for iPSC-afledt lacrimalkirtelindkapsling22. Transplantationsmetoden kan forbedres yderligere ved at såre tårekirtlen på forhånd, bruge en musemodel med tørre øjne og/eller injicere organoiderne som enkeltceller eller små klumper. Ikke desto mindre kan voksne stamcelleafledte lacrimalkirtelorganoider og det relaterede værktøjssæt danne grundlag for fremtidige anvendelser inden for lacrimalkirtelforskning og regenerativ medicin.

Lacrimalkirtlen er kirtelepitelet, der er ansvarlig for at producere det meste af det vandige lag af tårefilmen1. Det vandige lag af tårefilmen indeholder ikke kun vand til smøring af den okulære overflade, men også et stort repertoire af antimikrobielle komponenter, der beskytter den okulære overflade mod infektioner2. Når lacrimalkirtlen er beskadiget eller betændt, opstår tørre øjne, hvilket resulterer i ubehag for patienterne og i sidste ende kan føre til tab af syn3. I årenes løb har modelsystemer til undersøgelse af lacrimalkirtlen, især den menneskelige kirtel, været begrænset 4,5,6. Dette har bidraget til et videnshul vedrørende tårekirtelfunktion under fysiologiske og patologiske tilstande.
For nylig er der udviklet in vitro-modeller til at studere lacrimalkirtlen i en skål 7,8,9. Disse lacrimalkirtelorganoider stammer fra voksne stamceller dyrket som tredimensionelle strukturer i en ekstracellulær matrix suppleret med en cocktail af vækstfaktorer, der opretholder deres regenerative kapacitet in vitro7. Fordelen ved voksne stamceller (ASC) afledte organoider er, at de kan opretholdes i meget lang tid, mens de rekapitulerer sunde vævsfunktioner. Denne type organoid består udelukkende af epitelceller, i modsætning til inducerede pluripotente stamceller (iPSC)-afledte organoider, som også kan indeholde stromale celler, for eksempel. I modsætning til pluripotente stamcelleorganoider (PSC) er ASC-organoider etableret direkte fra voksent væv og kræver ingen genetiske modifikationer, der skal udvides. ASC-organoider udtrykker voksne egenskaber10.
Denne protokol indeholder en værktøjskasse til at udlede lacrimalkirtelorganoider fra mus og humant primærvæv. Protokollen beskriver, hvordan man yderligere forbedrer organoidernes funktionalitet ved simpel vækstfaktortilbagetrækning, og hvordan man provokerer organoiderne til at udskille tårevæske ved at udføre et hævelsesassay. Denne protokol inkluderer desuden en elektroporationsbaseret transfektionsmetode til genetisk manipulation af museorganoider ved hjælp af CRISPR-afledte baseredaktører. I modsætning til konventionel Cas9 tillader brugen af baseeditorer modifikation af enkeltbaser i genomet uden at generere et dobbeltstrenget brud11,12. Endelig beskrives den ortotopiske transplantation af humane lacrimalkirtelorganoider til immundefekte mus og den efterfølgende histologiske vurdering af engraftmentet. Denne lacrimal kirtel organoid værktøjssæt kan bruges i forskning på lacrimal kirtel regenerering og funktion og til genetisk og inflammatorisk sygdom modellering.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL safe-lock centrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>EP0030 120.094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,3&#8242;-Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrate (DAB)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5637</td>
			<td>CAS: 868272-85-9 , CAUTION, 6 g/L solution can be stored aliquotted at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5x green GoTaq Flexi buffer</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M891A</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A83-01</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2939</td>
			<td>Store at -20 &#176;C, stock at 30 mM, 10000x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12634-010</td>
			<td>store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar plates containing Ampicillin</td>
			<td>Hubrecht Institute</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave VAPOUR-Line lite</td>
			<td>VWR chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>Store at -20 &#176;C, 50x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Micro-Fine insulin needle 1 mL</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>324825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop microscope DMI1</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumine (BSA)</td>
			<td>MP biomedicals</td>
			<td>160069</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BTXpress</td>
			<td>BTX</td>
			<td>MDS450805</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 mice</td>
			<td>Hubrecht Institute</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cassettes</td>
			<td>Klinipath</td>
			<td>410-02S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellBanker 1</td>
			<td>amsbio</td>
			<td>11910</td>
			<td>Cryopreservation medium, adhere to instructions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid monohydrate</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>0088</td>
			<td>CAS: 5949-29-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase I</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C9407</td>
			<td>Aliquots at 20 mg/mL, 20x, store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes 15 mL</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>5618-8271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes 50 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS430828-500EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips 24 mm x 50 mm</td>
			<td>Menzel-Gl&#228;zer</td>
			<td>BB024050S1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex Basement Membrane Extract (BME), Growth Factor Reduced, Type 2 - extracellular matrix</td>
			<td>R&#38;D Systems, Bio-Techne</td>
			<td>3533-001-02</td>
			<td>Store at -20 &#176;C, keep at 4 &#176;C for up to 1 month</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPT</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D5942</td>
			<td>Store at -20 &#176;C, stock at 10 mM, 1000x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium hydrogen phosphate anhydrous</td>
			<td>VWR chemicals</td>
			<td>28026.292</td>
			<td>CAS: 7558-79-4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Di-sodiumhydrogenphosphate dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71643</td>
			<td>CAS:10028-24-7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>17105-041</td>
			<td>Aliquots at 50 U/mL, store at -20 &#176;C until use, 400x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Scalpel Sterile N&#176; 10</td>
			<td>Swann Morton</td>
			<td>3033838</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DM4000 microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTPs 25 mM</td>
			<td>Promega</td>
			<td>U1420</td>
			<td>Mix all 4 nucleotides together, Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dpn1</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate-bufferd Saline (DPBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190144</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Easy strainers 70 &#181;m</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>542170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation cuvette</td>
			<td>Nepagene</td>
			<td>EC002S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EnVision+/HRP mouse</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>K400111-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 100%</td>
			<td>BOOM</td>
			<td>84045206;5000</td>
			<td>CAUTION, Use to prepare other Ethanol dilutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 70%</td>
			<td>BOOM</td>
			<td>84010059.5000</td>
			<td>CAUTION</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 96%</td>
			<td>BOOM</td>
			<td>84050065.5000</td>
			<td>CAUTION</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS FL Auto 2 Cell Imaging System</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Live-imaging brightfield microscrope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF10</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-26</td>
			<td>Store at -20 &#176;C, stock at 100 mg/mL in base medium, 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td>NIH, Fiji developers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution 4%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1.00496</td>
			<td>CAS: 50-00-0, CAUTION</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1099</td>
			<td>Store at -20 &#176;C, stock at 10 mM, 10000x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GoTaq G2 Flexi DNA Polymerase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M7805</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Haematoxylin</td>
			<td>VWR chemicals</td>
			<td>10047105</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td>Store at 4 &#176;C, 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histocore H and C, Tissue embedding machine</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate</td>
			<td>Meidax</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human nucleolar antigen antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab-190710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid 5 N</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10605882</td>
			<td>CAS: 7647-01-0, CAUTION</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxyde 30%</td>
			<td>Chem-lab</td>
			<td>CL00.2308.1000</td>
			<td>CAS: 7722-84-1, CAUTION</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygromycin B-gold</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ant-hg</td>
			<td>Stock at 100 mg/&#181;L, 1000x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygromycin resistance cassette-containing plasmid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Andersson-Rolf et al, Nature Methods, 2017. doi: 10.1038/nmeth.4156</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IsoFlo 100%</td>
			<td>Mecan</td>
			<td>5960501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB medium</td>
			<td>Hubrecht Institute</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 25 mM</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A351H</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome RM2235</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Midiprep DNA isolation kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>K210005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniprep DNA isolation kit</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>K210003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetylcysteine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9165</td>
			<td>Store at -20 &#176;C, stock at 500 mM, 400x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEPA21 electroporator</td>
			<td>Nepagene</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>N0636</td>
			<td>Store at -20 &#176;C, stock at 1M, 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOD Scid Gamma (NSG) mice</td>
			<td>Hubrecht Institute colony</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noggin conditioned medium</td>
			<td>U-Protein Express</td>
			<td>Custom order</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noradrenaline</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A7257</td>
			<td>Store at -20 &#176;C, stock at 100 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Memmert</td>
			<td></td>
			<td>Set at 58 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P20, P200 and P1000 pipettes</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin</td>
			<td>VWR chemicals</td>
			<td>10048502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipettes, glass plugged</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>1150-6973</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pax6_C&#62;T_F: AGACTGTTCCAGGATGGCTG&#160;</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pax6_C&#62;T_R: TCTCCTAGGTACTGGAAGCC&#160;</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCMV_ABEmax_P2A_GFP</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>112101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pertex</td>
			<td>Klinipath</td>
			<td>AM-08010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pFYF1320&#160;</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>47511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ant-pm-1</td>
			<td>1000X, store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prostaglandin E2 (PGE2)</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2296</td>
			<td>Store at -20 &#176;C, stock at 10 mM, 10000x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish, 10 cm</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>633102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B9027S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 high-fidelity DNA polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0491S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuickExtract DNA Extraction Solution</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>QE09050</td>
			<td>Store aliquots at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-spondin 3 conditioned medium</td>
			<td>U-Protein Express</td>
			<td>Custom order</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sgRNA Reverse Primer: TCTGCGCCCATCTGTTGCTT CGGTGTTTCGTCCTTTCCACAAG</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides</td>
			<td>StarFrost</td>
			<td>MBB-0302-55A</td>
			<td>Adhesive, ground</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8.22335.1000</td>
			<td>CAS: 26628-22-8, CAUTION</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium cytrate dihydrate</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>0280</td>
			<td>CAS: 6132-04-3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Forward Primer: &#8220;/5phos/ GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG 
			TTAAAATAAGGC</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Subcloning efficiency competent cells DH5alpha</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18265-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suspension cell culture plates (24-well)</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>662102</td>
			<td>24-well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suspension cell culture plates (12-well)</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>665102</td>
			<td>12-well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAE buffer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>B49</td>
			<td>Stock at 50x, dilute to 1x with ultrapure water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transposase-containing plasmid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Andersson-Rolf et al, Nature Methods, 2017. doi: 10.1038/nmeth.4156</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express Enzyme</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12605-028</td>
			<td>store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U6_Forward primer: GGGCAGGAAGAGGGCCTAT</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Agarose 1000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Tulabo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Klinipath</td>
			<td>4055-9005</td>
			<td>CAS: 1330-20-7, CAUTION</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Abmole Bioscience</td>
			<td>Y-27632 dihydrochloride</td>
			<td>Store at -20 &#176;C, stock at 10 mM, 1000x</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishment, maintenance, differentiation, genetic manipulation, and transplantation of mouse and human lacrimal gland organoids

Lacrimalkirtlen er et vigtigt organ for okulær overfladehomeostase. Ved at producere den vandige del af tårefilmen beskytter den øjet mod udtørringsstress og eksterne fornærmelser. Lidt er kendt om lacrimal kirtel (pato) fysiologi på grund af manglen på tilstrækkelige in vitro modeller. Organoidteknologi har vist sig som en nyttig eksperimentel platform for flere organer. Her deler vi en protokol til etablering og vedligeholdelse af mus- og humane lacrimalkirtelorganoider startende fra lacrimalkirtelbiopsier. Ved at ændre dyrkningsbetingelserne forbedrer vi lacrimalkirtelorganoidfunktionaliteten. Organoid funktionalitet kan undersøges gennem en "grædende" assay, som indebærer at udsætte lacrimalkirtelorganoiderne for udvalgte neurotransmittere for at udløse tårefrigivelse i deres lumen. Vi forklarer, hvordan man afbilder og kvantificerer dette fænomen. For at undersøge rollen af gener af interesse i lacrimalkirtelhomeostase, kan disse genetisk modificeres. Vi beskriver grundigt, hvordan man genetisk modificerer lacrimalkirtelorganoider ved hjælp af baseeditorer - fra guide RNA-design til organoid klongenotypning. Endelig viser vi, hvordan man undersøger det regenerative potentiale af humane lacrimalkirtelorganoider ved ortopisk implantation i musen. Sammen giver dette omfattende værktøjssæt ressourcer til at bruge mus- og humane lacrimalkirtelorganoider til at studere lacrimalkirtel (pato)fysiologi.

Efter dissektionen af musens lacrimalkirtel (figur 2A) genererede den enzymatiske og mekaniske fordøjelse små vævsfragmenter, blandt hvilke acini og kanaler kunne skelnes (figur 2B). De resterende store stykker væv ville destabilisere ECM, hvilket ville reducere den oprindelige organoidudvækst. Musens lacrimalkirtelorganoidafledning var vellykket, når cystiske organoider med ~ 500 μm diameter blev fundet efter ~ 7 dage, det stadium, hvor organoiderne var klar til at blive delt (figur 2C). Selvom den samlede organoidafledning er vellykket, kan nogle organoider begynde at vokse, før de stopper til sidst. Humane lacrimalkirtelorganoider voksede ud som cyster inden for 3-4 dage og nåede fuldvoksen størrelse på 10-14 dage efter vævsisolering (figur 2D). For både mus og mennesker mislykkedes organoidafledning undertiden, hvor ingen eller få organoider voksede ud; Dette var generelt forårsaget af overfordøjelse af vævet. Musens lacrimalkirtelorganoider kunne passeres mindst 40x og de humane organoider mindst 20x. Passaging blev udført hver 7-10 dage i gennemsnit afhængigt af organoidvæksten.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65040/65040fig02.jpg"> Figur 2: Etablering af musens og menneskers tårekirtelorganoider. (A) Fotografier af de forskellige stadier af muselacrimalkirteldissektion. Pilen peger på lacrimalkirtlen under dens beskyttende membran. (B) Brightfield-billeder af muselacrimalkirtelceller lige efter vævsfordøjelse, med indsatser, der viser en acinus og en kanal. (C) Brightfield-billeder af en vellykket og mislykket organoid afledning af muselacrimalkirtelorganoid. (D) Brightfield-billeder af menneskelig organoidvækst i løbet af 14 dage. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65040/65040fig02large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
Lacrimalkirtelorganoiderne indeholder en stor del stamceller, når de dyrkes i ekspansionsmediet. For at øge deres differentieringsniveau opsatte vi en mus og et menneskeligt differentieringsmedium med reduceret vækstfaktorindhold. Efter henholdsvis 5 dage og 7 dage i differentieringsmediet blev musen og humane lacrimalkirtelorganoider tættere (figur 3A-B). Denne morfologiske ændring korrelerede med øgede funktionelle egenskaber. Anvendelse af den cykliske AMP-aktivator forskolin eller neurotransmitteren noradrenalin resulterede i organoid hævelse (dvs. apikal vandsekretion) inden for mindre end 3 timer (figur 3C). Når hævelsen tog længere tid end 3-4 timer, antydede dette, at organoiderne ikke var differentierede nok og / eller ikke udtrykte funktionelle markører, såsom receptorer for neurotransmittere.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65040/65040fig03.jpg"> Figur 3: Differentiering af mus- og humane tårekirtelorganoider og funktionel hævelsesanalyse i humane organoider. (A) Brightfield-billeder af musens tårekirtelorganoider dyrket i ekspansionsmedium i 7 dage og i differentieringsmedium i 5 dage efter 2 dage i ekspansionsmedium. (B) Brightfield-billeder af humane lacrimalkirtelorganoider dyrket i ekspansionsmedium i 11 dage og i differentieringsmedium i 9 dage efter 2 dage i ekspansionsmedium. (C) Brightfield-billeder af differentierede humane lacrimalkirtelorganoider udsat for frisk differentieringsmedium (kontrol), til 1 μM forskolin, og til 100 μM noradrenalin i løbet af 3 timer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65040/65040fig03large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
For at slå Pax6 ud i muselacrimalkirtelorganoider blev et plasmid indeholdende det valgte Pax6-målrettede gRNA genereret ved PCR og ligering (figur 4A). Dette gRNA-holdige plasmid blev elektroporeret sammen med Piggy-Bac-plasmiderne (hygromycinresistenstransposonholdige og transposaseholdige plasmider) og C> T-baseeditoren Cas9 i muselacrimalkirtelorganoider dissocieret i enkeltceller. Efter 3 dage, da organoiderne var kommet sig, blev de udsat for hygromycin for at vælge kloner, der havde inkorporeret hygromycinresistenskassetten. I vellykkede elektroporationer voksede organoider, der var resistente over for hygromycin, ud (figur 4B). De voksende organoide kloner, der var større end ~ 300 μm, blev plukket, ideelt før de begyndte at spontant differentiere (figur 4C). DNA blev ekstraheret fra en del af organoiden, mens resten blev holdt i kultur. PCR-amplifikationen af Pax6-locus, der var målrettet mod gRNA'et, gav et 367 bp-bånd for hver af de valgte kloner (figur 4D). Efter sekventering af det forstærkede locus blev kloner, der var homozygously C > T redigeret (n = 1), bevaret. På den anden side blev kloner, der ikke blev redigeret (n = 4), heterozygt redigeret eller forkert redigeret (n = 1), kasseret (figur 4E). Samlet set blev der ved hjælp af dette gRNA rettet mod Pax6 opnået en homozygot knock-out muselacrimalkirtelklon ud af seks sekventerede. Nogle kloner voksede godt ud, men nogle organoide kloner gik tabt efter plukning eller begyndte at differentiere (figur 4F). Ud af de 10 organoide kloner, der blev valgt, voksede 7 godt ud.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65040/65040fig04.jpg"> Figur 4: Baseredigeringsmedieret knock-out af Pax6 i muselacrimalkirtelorganoider. (A) Sanger-sekventeringsspor af pFYF1320 efter korrekt integration af gRNA'et rettet mod Pax6-locus. (B) Brightfield-billeder af musens tårekirtelorganoider 5 dage efter eksponering for hygromycin efter elektroporation. Organoiderne blev dyrket i museekspansionsmedium. Til venstre er et eksempel på en mislykket elektroporation, hvor ingen klon er resistent over for hygromycin, der vokser ud. Til højre er et eksempel på en vellykket elektroporation, hvor flere hygromycinresistente organoide kloner overlever. (C) Brightfield-billeder af kloner, der skal plukkes, og kloner, der ikke skal plukkes. (D) Agarosegel, der viser amplifikationen af Pax6-locus målrettet med gRNA'et. I grønt fremhæves båndet med den forventede størrelse på 367 bp. (E) Sanger-sekventeringsspor af tre organoidkloner, der var resistente over for hygromycin. Den øverste klon er uredigeret. Den midterste klon er en homozygot C > T-udgave og dermed en homozygot knock-out. Den nederste klon præsenterer to heterozygote punktmutationer og er enten en heterozygot knock-out eller en blandet klon og er blevet forkert redigeret. (F) Brightfield-billeder af de plukkede organoidkloner med forskellige niveauer af udvækst. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65040/65040fig04large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
Endelig blev organoider, der blev delt 3 dage i forvejen (< 100 μm i diameter) anvendt til at udføre human lacrimalkirtel organoid ortotopisk transplantation hos mus. Organoid engraftment blev bekræftet 1 måned efter injektion af organoiderne i musens lacrimalkirtel ved farvning for en humanspecifik markør, det humane nukleolære antigen (figur 5). Fraværet af punktfarvning fra alle sektioner af musens lacrimalkirtel betød mangel på human organoid engraftment.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65040/65040fig05.jpg"> Figur 5: Transplantation af humane lacrimalkirtelorganoider i musens lacrimalkirtel. Farvning af transplanterede muselacrimalkirtler til den humane nukleolære markør til overvågning af engraftment 1 måned efter transplantation. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65040/65040fig05large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
Supplerende tabel 1: Mediets og buffernes sammensætning. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65040/Supplementary%20Table%201.xlsx" target="_blank">Klik her for at downloade denne tabel.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Establishment, Maintenance, Differentiation, Genetic Manipulation, and Transplantation of Mouse and Human Lacrimal Gland Organoids at JoVE.com

Establishment, Maintenance, Differentiation, Genetic Manipulation, and Transplantation of Mouse and Human Lacrimal Gland Organoids

Denne protokol beskriver, hvordan man etablerer, vedligeholder, genetisk modificerer, differentierer, funktionelt karakteriserer og transplanterer lacrimalkirtelorganoider afledt af primært muse- og humant væv.

Etablering, vedligeholdelse, differentiering, genetisk manipulation og transplantation af mus- og humane tårekirtelorganoider

The lacrimal gland is an essential organ for ocular surface homeostasis. By producing the aqueous part of the tear film, it protects the eye from ...

Med lacrimalkirtelorganoider kan man undersøge, hvordan visse gener styrer lacrimalkirtelhomeostase. Derudover kan organoiderne bruges til regenerativ medicin. Den største fordel ved voksen stamcelleafledt lacrimalkirtelorganoidteknologi er, at den tillader vækst og undersøgelse af sunde og ikke-transformerede lacrimalkirtelepitelceller.Disse organoider kan i sidste ende anvendes til behandling af patienter med tørre øjne. Begynd med at forberede det medium og materiale, der kræves til forsøget, efterfulgt af at kombinere alle komponenterne i fordøjelsesmediet før eksperimentet. Forvåd skalpellerne i dette medium for at undgå, at vævsstykker klæber til dem.Hent musens lacrimalkirtelvæv fra mediet, læg det i petriskålen, og hak det ved hjælp af forvædede skalpeller. Når vævsstykkerne er mindre end 0,5 kubikmillimeter, skrab dem af petriskålen med skalpellen og overfør dem til et 15 ml rør, der indeholder fordøjelsesmediet. For en meget lille menneskelig biopsi skal du placere den direkte i fordøjelsesmediet uden hakning.Inkuber 15 ml røret med vævsstykker i op til 15 minutter i et 37 grader Celsius vandbad. I mellemtiden indsnævres en Pasteur-pipettespids i en flamme, og den forvædes i basismediet. For at lette afkoblingsprocessen pipetteres den hakkede blanding op og ned hvert femte minut med den forvædede, indsnævrede Pasteur-pipette.Når mange enkeltceller og små klumper er synlige under mikroskopet, skal du stoppe dissociationen ved at tilføje 10 ml af basismediet. Efter centrifugering ved 400 g i fem minutter fjernes supernatanten, og pelleten resuspenderes i 10 ml basissubstrat for at gentage vask og pellet ned i cellerne. Fjern de store, ufordøjede vævsstykker og resterende kollagenfibre ved at filtrere hakket blanding gennem en 70 mikrometer sil.Drej eluatet ved 400 g i fem minutter. Efter fjernelse af supernatanten resuspenderes cellepelletten i 100 mikroliter kold ekstracellulær matrix eller ECM for en enkelt muselacrimalkirtel og 50 mikroliter kold ECM for en menneskelig biopsi uden at skabe boblerne. Frø op til 100 mikroliter celler pr. Brønd i en 12-brønds ophængningsplade ved hjælp af en P200 for at fremstille ca. 20 mikroliter dråber i brønden.Placer pladen på hovedet i en befugtet inkubator ved 37 grader Celsius i 20 til 30 minutter for at tillade ECM størkning. Når ECM er størknet, tilsættes ca. en milliliter museudvidelsesmedium ved stuetemperatur pr. hul på en 12-brønds plade. Frisk tilberedt en milliliter humant differentieringsmedium indeholdende individuelle komponenter, der inducerer sekretion af lacrimalkirtelorganoiderne.Ved et automatiseret brightfield time-lapse-mikroskop skal du indstille de positioner, der skal afbildes i pladen, tidsintervallet på fem minutter og varigheden på fire timer. Sørg for, at en hel ECM-dråbe er synlig i hver position. Før du begynder at afbilde, skal du fjerne kulturmediet fra brøndene, der skal afbildes, uden at flytte pladen fra mikroskopet og erstatte det med det frisklavede, godt resuspenderede humane differentieringsmedium indeholdende forbindelser, herunder forskolin og noradrenalin.Som en negativ kontrol skal du inkludere en brønd med opdateret differentieringsmedium. Klik på kørselsknappen på mikroskopet, og analyser resultaterne efter fire timer. Efter adskillelse af organoiderne som nævnt i teksten kasseres supernatanten.Resuspender cellerne i 80 mikroliter af elektroporationsbufferen. I et 1,5 ml rør fremstilles de plasmider, der kræves til eksperimentet. Tilsæt plasmiderne til cellerne, og bland godt ved pipettering op og ned.Indstil elektroporatoren med parametrene for poringpuls og overførselspuls. Placer cellerne med plasmiderne i en elektroporationskuvette. Mål straks modstanden, som skal være mellem 0,3 ampere og 0,55 ampere, og elektroporat straks.Når du er færdig, overfør cellerne til et 1,5 ml rør, og tilsæt 400 mikroliter elektroporationsbuffer suppleret med en Rho-kinasehæmmer. Lad cellerne komme sig ved stuetemperatur i 30 minutter. Pellet derefter cellerne ved 500 g i fem minutter.Efter kassering af supernatanten plades cellerne i 200 mikroliter ECM. Efter størkning tilsættes musens ekspansionsmedium. Til organoidpræparation opdeles de humane lacrimalkirtelorganoider ca. tre dage før transplantationsdagen.For at ekstrahere organoiderne fra ECM tilsættes dispase til kulturmediet for at nå en endelig koncentration på 0,125 enheder pr. milliliter, og resuspender ECM-dråberne grundigt for at forstyrre dem ved hjælp af en P1000. Placer pladen tilbage i 37-graders Celsius-inkubatoren i 30 minutter. Resuspender organoiderne i 10 ml basismedium for at vaske enzymet ud.Efter pelletering af cellerne ved 400 g i fem minutter resuspenderes de i 50 mikroliter koldt humant ekspansionsmedium suppleret med 5% ECM. Placer organoidsuspensionen på is, og fortsæt straks til transplantationen. Til ortopisk transplantation hos mus aspireres den organoide suspension i en insulinnål.Når musen sover, skal du hurtigt placere den på sin side med hovedlacrimalkirtlen tilgængelig. Injicer fem mikroliter af organoidsuspensionen direkte gennem huden ind i lacrimalkirtlen. Lad musen komme sig, og vurder tilstedeværelsen af eventuelle transplantationsrelaterede ubehag dagligt, især i øjet.Efter dissektion af musens lacrimalkirtel genererede den enzymatiske og mekaniske fordøjelse små vævsfragmenter, herunder acini og kanalerne. I den vellykkede muselacrimalkirtelorganoidafledning blev cystiske organoider med en diameter på ca. 500 mikrometer fundet efter syv dage. Humane lacrimalkirtelorganoider voksede som cyster inden for tre til fire dage og nåede en fuldvoksen størrelse i 10 til 14 dage efter vævsisolering.Efter henholdsvis fem dage og syv dage i differentieringsmediet blev musen og humane lacrimalkirtelorganoider tættere. Anvendelse af cyklisk AMP-aktivator forskolin eller neurotransmitteren noradrenalin resulterede i organoid hævelse inden for mindre end tre timer. Ved vellykket elektroporation voksede organoider, der var resistente over for hygromycin, ud.De voksende organoide kloner større end 300 mikrometer blev plukket før deres differentiering. PCR-amplifikation af Pax6-locus målrettet mod guide-RNA gav et 367 baseparbånd for alle de udvalgte kloner. En homozygot knockout mus lacrimal kirtel klon ud af seks sekventerede blev opnået ved hjælp af guide RNA rettet mod Pax6.Nogle kloner voksede godt ud, men nogle organoide kloner gik tabt efter plukning eller begyndte at differentiere. Ud af de 10 organoide kloner, der blev valgt, voksede syv godt ud. Organoid engraftment blev bekræftet en måned efter injektion af organoiderne i musens lacrimalkirtel ved farvning for en human-specifik markør, det humane nukleolære antigen.En ting at være opmærksom på er ikke at overfordøje vævet eller organoiderne. Ellers kan cellerne dø, og dette ville reducere organoidetableringshastigheden. Lacrimalkirtelorganoider kan analyseres ved histologi.Ved at gøre det kan man få indsigt i deres cellulære sammensætning.

Research

JoVE Journal

Biology

Generation of Human CD40-activated B cells

CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been identified as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cancer ...

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells  

Human embryonic stem (hES) cells must be monitored and cared for in order to maintain healthy, undifferentiated cultures. At minimum, the cultures must be ...

Isolation and Genetic Manipulation of Adult Cardiac Myocytes for Confocal Imaging

Cardiac myocytes isolated from adult hearts are widely accepted as a model somewhere half way between embryonic and neonatal muscle cells on one side and ...

Genetic Modification and Recombination of Salivary Gland Organ Cultures

Genetisk modifikation og Rekombination af spytkirtel organkulturer

Branching  morphogenesis occurs during the development of many organs, and the embryonic  mouse submandibular gland (SMG) is a classical model for the ...

Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells

Generation of Human cardiomyocytes: En Differentiering Protocol fra Feeder-fri Menneskelige induceret pluripotente stamceller

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is ...

Alternative Cultures for Human Pluripotent Stem Cell Production, Maintenance, and Genetic Analysis

Alternative kulturer til human Pluripotente Stem Cell Produktion, vedligeholdelse og Genetisk analyse

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and ...

Manipulating the Murine Lacrimal Gland

Manipulere Murine tårekirtlen

The lacrimal gland (LG) secretes aqueous tears necessary for maintaining the structure and function of the cornea, a transparent tissue essential for ...

Establishment and Maintenance of Gnotobiotic American Cockroaches (Periplaneta americana)

Establishment and Maintenance of Gnotobiotic American Cockroaches Periplaneta americana

Etablering og vedligeholdelse af gnotobiotiske amerikanske kakerlakker (Periplaneta americana)

Gnotobiotic animals are a powerful tool for the study of controls on microbiome structure and function. Presented here is a protocol for the establishment ...

Establishment and Genetic Manipulation of Murine Hepatocyte Organoids

Etablering og genmanipulation af Murine Hepatocyte organoider

The liver is the largest organ in mammals. It plays an important role in glucose storage, protein secretion, metabolism and detoxification. As the ...

Three-Dimensional, Serum-Free Culture System for Lacrimal Gland Stem Cells

Tredimensionelt, serumfrit kultursystem til stamceller fra lacrimalkirtlen

Lacrimal gland (LG) stem cell-based therapy is a promising strategy for lacrimal gland diseases. However, the lack of a reliable, serum-free culture ...