Name: establishment, maintenance, differentiation, genetic manipulation, and transplantation of mouse and human lacrimal gland organoids
Uploaded: 2023-02-03T14:15:00
Duration: 10 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Establishment, Maintenance, Differentiation, Genetic Manipulation, and Transplantation of Mouse and Human Lacrimal Gland Organoids at JoVE.com

Wij danken Yorick Post voor de eerste ontwikkeling van het protocol. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door een prijs van de Cancer Research UK Grand Challenge (C6307/A29058) en de Mark Foundation for Cancer Research aan het SPECIFICANCER-team.

<ol>
	<li>Garg, A., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lacrimal+gland+development:+From+signaling+interactions+to+regenerative+medicine.">Lacrimal gland development: From signaling interactions to regenerative medicine.</a> Developmental Dynamics. 246 (12), 970-980 (2017).</li><li>Selinger, D. S., Selinger, R. C., Reed, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resistance+to+infection+of+the+external+eye:+The+role+of+tears.">Resistance to infection of the external eye: The role of tears.</a> Survey of Ophthalmology. 24 (1), 33-38 (1979).</li><li>Messmer, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathophysiology,+diagnosis,+and+treatment+of+dry+eye+disease.">The pathophysiology, diagnosis, and treatment of dry eye disease.</a> Deutsches Arzteblatt International. 112 (5), 71-81 (2015).</li><li>Massie, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+lacrimal+gland+spheroids+for+lacrimal+gland+tissue+regeneration.">Development of lacrimal gland spheroids for lacrimal gland tissue regeneration.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (4), 2001-2009 (2018).</li><li>Tiwari, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+human+lacrimal+gland+cultures+with+secretory+function.">Establishing human lacrimal gland cultures with secretory function.</a> PloS One. 7 (1), 29458 (2012).</li><li>Nguyen, D. H., Beuerman, R. W., Halbert, C. L., Ma, Q., Sun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+immortalized+rabbit+lacrimal+gland+epithelial+cells.">Characterization of immortalized rabbit lacrimal gland epithelial cells.</a> In Vitro Cellular &amp; Developmental Biology. Animal. 35 (4), 198-204 (1999).</li><li>Bannier-H&#233;laou&#235;t, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+human+lacrimal+gland+using+organoids+and+single-cell+sequencing.">Exploring the human lacrimal gland using organoids and single-cell sequencing.</a> Cell Stem Cell. 28 (7), 1221-1232 (2021).</li><li>Hayashi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+3D+lacrimal+gland+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells.">Generation of 3D lacrimal gland organoids from human pluripotent stem cells.</a> Nature. 605 (7908), 126-131 (2022).</li><li>Jeong, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+functional+epithelial+organoids+from+human+lacrimal+glands.">Establishment of functional epithelial organoids from human lacrimal glands.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 12 (1), 247 (2021).</li><li>Hofer, M., Lutolf, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+organoids.">Engineering organoids.</a> Nature Reviews Materials. 6 (5), 402-420 (2021).</li><li>Meyenberg, M., Ferreira da Silva, J., Loizou, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+specific+DNA+repair+outcomes+shape+the+landscape+of+genome+editing.">Tissue specific DNA repair outcomes shape the landscape of genome editing.</a> Frontiers in Genetics. 12, 728520 (2021).</li><li>Geurts, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-based+adenine+editors+correct+nonsense+mutations+in+a+cystic+fibrosis+organoid+biobank.">CRISPR-based adenine editors correct nonsense mutations in a cystic fibrosis organoid biobank.</a> Cell Stem Cell. 26 (4), 503-510 (2020).</li><li>Overmyer, K. A., Thonusin, C., Qi, N. R., Burant, C. F., Evans, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+anesthesia+and+euthanasia+on+metabolomics+of+mammalian+tissues:+Studies+in+a+C57BL/6J+mouse+model.">Impact of anesthesia and euthanasia on metabolomics of mammalian tissues: Studies in a C57BL/6J mouse model.</a> PLoS One. 10 (2), 0117232 (2015).</li><li>Driehuis, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+mucosal+organoids+as+a+potential+platform+for+personalized+cancer+therapy.">Oral mucosal organoids as a potential platform for personalized cancer therapy.</a> Cancer Discovery. 9 (7), 852-871 (2019).</li><li>Froger, A., Hall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+plasmid+DNA+into+E.+coli+using+the+heat+shock+method.">Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method.</a> Journal of Visualized Experiments. (6), e253 (2007).</li><li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li><li>Lian, J., Meng, X., Zhang, X., Hu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+genetic+manipulation+of+murine+hepatocyte+organoids.">Establishment and genetic manipulation of murine hepatocyte organoids.</a> Journal of Visualized Experiments. (180), e62438 (2022).</li><li>L&#245;hmussaar, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+organoids+model+cervical+tissue+dynamics+and+viral+oncogenesis+in+cervical+cancer.">Patient-derived organoids model cervical tissue dynamics and viral oncogenesis in cervical cancer.</a> Cell Stem Cell. 28 (8), 1380-1396 (2021).</li><li>Bloh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deconvolution+of+complex+DNA+repair+(DECODR):+Establishing+a+novel+deconvolution+algorithm+for+comprehensive+analysis+of+CRISPR-edited+Sanger+sequencing+data.">Deconvolution of complex DNA repair (DECODR): Establishing a novel deconvolution algorithm for comprehensive analysis of CRISPR-edited Sanger sequencing data.</a> The CRISPR Journal. 4 (1), 120-131 (2021).</li><li>Latta, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiology+of+aniridia-associated+keratopathy:+Developmental+aspects+and+unanswered+questions.">Pathophysiology of aniridia-associated keratopathy: Developmental aspects and unanswered questions.</a> The Ocular Surface. 22, 245-266 (2021).</li><li>Veernala, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lacrimal+gland+regeneration:+The+unmet+challenges+and+promise+for+dry+eye+therapy.">Lacrimal gland regeneration: The unmet challenges and promise for dry eye therapy.</a> The Ocular Surface. 25, 129-141 (2022).</li><li>Hayashi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+3D+lacrimal+gland+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells.">Generation of 3D lacrimal gland organoids from human pluripotent stem cells.</a> Nature. 605 (7908), 126-131 (2022).</li></ol>

Hans Clevers is hoofd van Pharma Research and Early Development bij Roche, Basel, en heeft verschillende patenten met betrekking tot organoïde technologie.

Dit protocol beschrijft de oprichting en het gebruik van traanklierorganoïden voor functionele assays, mutatiemodellering en transplantatie. Bij het vaststellen van muis- en menselijke traanklierorganoïden is weefseldissociatie cruciaal. Als het weefsel niet voldoende wordt verteerd, zal de organoïdeopbrengst laag zijn. Als het weefsel oververteerd is, zullen de cellen afsterven en niet uitgroeien als organoïden. Elk weefsel moet gedurende een bepaalde tijd worden verteerd met een specifiek enzym om een optimale uitgroei van organoïdente garanderen 14,17,18. De traanklier is een vrij zacht weefsel waarvoor een collagenasevertering van 5-10 min in combinatie met op pipetteren gebaseerde mechanische dissociatie voldoende is om kleine stukjes weefsel te isoleren. Als afzonderlijke cellen moeten worden verkregen voor toepassingen zoals eencellige RNA-sequencing, kan de dissociatie langer worden uitgevoerd totdat het eencellige stadium is bereikt, maar de dissociatie moet worden gestopt zodra afzonderlijke cellen worden verkregen om een afname van de levensvatbaarheid te beperken. Omdat weefseldissociatie zo cruciaal is, is oververtering de meest waarschijnlijke reden voor het falen van de vorming van traanklierorganoïden.
Het juiste onderhoud van traanklierorganoïden is belangrijk voor hun gebruik. Langdurig onderhoud is een kenmerk van volwassen stamcel-afgeleide traanklierorganoïden, vergeleken met geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide organoïden 7,17. Om langdurig onderhoud te bereiken, moeten regelmatige organoïde splitsing en mediumveranderingen worden uitgevoerd. Zonder dit beginnen organoïden te differentiëren en ontwikkelen ze een verminderd stamcelpotentieel, wat hun onderhoud op lange termijn belemmert7. Bij deze stap kan oververtering de stamcellen doden en het onderhoud van organoïden schaden. Voor regelmatig onderhoud is organoïde dissociatie in afzonderlijke cellen niet vereist. Om klonale knock-out organoïde lijnen te genereren, is het echter van cruciaal belang om te beginnen met enkele cellen. Zo niet, dan zullen de organoïden bestaan uit een mozaïek van cellen met verschillende genetische achtergronden, waardoor het analyseren van het effect van een enkele, gedefinieerde mutatie onmogelijk wordt. Hier beschrijven we het gebruik van een C > T-basiseditor om stopcodons te genereren. Deze genoomeditor vertrouwt op de aanwezigheid van arginine, glutamine of tryptofaancodons binnen 12-18 basen van een NGG PAM. Wanneer bij het ontwerpen van een gRNA niet aan deze voorwaarden wordt voldaan, kunnen conventionele Cas9- of C >T-base-editors met alternatieve PAMs worden gebruikt 7,18. Conventionele Cas9 introduceert echter dubbelstrengs breuken die resulteren in indels bij reparatie11. Omdat beide allelen verschillende inzinkingen kunnen bevatten, vereist kloongenotypering extra voorzichtigheid. Deconvolutie van de aangebrachte modificaties moet worden uitgevoerd om ervoor te zorgen dat beide allelen out-of-frame indels bevatten en dat de organoïde klonen dus worden uitgeschakeld voor het gen dat op19 is gericht. Het voordeel van C > T base editors ligt in het feit dat ze kunnen worden gebruikt om puntmutaties te modelleren die niet noodzakelijkerwijs resulteren in stopcodons. Ze kunnen bijvoorbeeld worden gebruikt om specifieke Pax6-mutaties te modelleren die worden aangetroffen bij patiënten met aniridie om hun impact op de traanklierfysiologiete bestuderen 20.
De traanklier scheidt het waterige deel van de traanfilmaf 1. Traansecretie kan worden samengevat in menselijke organoïden na differentiatie gemedieerd door groeifactorontwenning en NOTCH-remming. Onder deze omstandigheden ondergaan organoïden terminale differentiatie en kunnen ze niet verder worden onderhouden. Toch kunnen gedifferentieerde traanklierorganoïden de ontwikkeling van scheurende geneesmiddelen begeleiden in de context van droge ogen, mogelijk in schermen met een hoge doorvoer. De scheurtest die in dit protocol wordt gepresenteerd, is degene die momenteel de grootste verandering in organoïdegrootte in korte tijd geeft, wat het gemakkelijker maakt om te kwantificeren in de context van een medicijnscreening 7,9,17.
Stamceltherapie is veelbelovend voor traanklierregeneratie bij droge ogen21. Volwassen stamcel-afgeleide traanklierorganoïden kunnen een bronmateriaal zijn voor dergelijke toepassingen. Het hier gepresenteerde protocol resulteert in menselijke traanklier organoïde engraftment, meestal als cysten. Lage organoïde engraftment kan ontstaan doordat organoïden op de verkeerde plaats worden geïnjecteerd. Het trainen van de injectieprocedure met een kleurstof maakt het volgen van de injectieplaats mogelijk en verbetert uiteindelijk de injectienauwkeurigheid. Als alternatief kan de epidermis van de muis worden ingesneden om directe toegang te hebben tot de traanklier, zoals bij ratten vóór22 uur. Deze methode duurt langer, maar kan nauwkeuriger zijn. Aan de andere kant, met het huidige protocol, integreerden de organoïden niet functioneel in de traanklier van de muis. Vergelijkbare resultaten zijn waargenomen voor iPSC-afgeleide traankliertransplantatie22. De transplantatiemethode kan verder worden verbeterd door de traanklier van tevoren te verwonden, een muismodel met droge ogen te gebruiken en / of de organoïden als enkele cellen of kleine klonten te injecteren. Niettemin kunnen volwassen stamcel-afgeleide traanklierorganoïden en de bijbehorende toolkit de basis vormen voor toekomstige toepassingen in traanklieronderzoek en regeneratieve geneeskunde.

De traanklier is het klierepitheel dat verantwoordelijk is voor de productie van het grootste deel van de waterige laag van de traanfilm1. De waterige laag van de traanfilm bevat niet alleen water om het oculaire oppervlak te smeren, maar ook een groot repertoire van antimicrobiële componenten die het oculaire oppervlak beschermen tegen infecties2. Wanneer de traanklier beschadigd of ontstoken is, treedt droge ogen op, wat resulteert in ongemak voor patiënten en uiteindelijk kan leiden tot verlies van gezichtsvermogen3. In de loop der jaren zijn modelsystemen om de traanklier te bestuderen, met name de menselijke klier, beperkt 4,5,6. Dit heeft bijgedragen aan een kenniskloof met betrekking tot de traanklierfunctie onder fysiologische en pathologische omstandigheden.
Onlangs zijn in vitro modellen ontwikkeld om de traanklier in een schaal 7,8,9 te bestuderen. Deze traanklierorganoïden zijn afgeleid van volwassen stamcellen die als driedimensionale structuren zijn gekweekt in een extracellulaire matrix aangevuld met een cocktail van groeifactoren die hun regeneratieve capaciteiten in vitro7 ondersteunen. Het voordeel van volwassen stamcel (ASC) -afgeleide organoïden is dat ze zeer lang kunnen worden gehandhaafd terwijl ze gezonde weefselkenmerken samenvatten. Dit type organoïde bestaat uitsluitend uit epitheelcellen, in tegenstelling tot geïnduceerde pluripotente stamcel (iPSC)-afgeleide organoïden, die bijvoorbeeld ook stromale cellen kunnen bevatten. In tegenstelling tot pluripotente stamcel (PSC)-afgeleide organoïden, worden ASC-organoïden rechtstreeks uit volwassen weefsel gemaakt en vereisen ze geen genetische modificaties om te worden uitgebreid. ASC-organoïden drukken volwassen kenmerkenuit 10.
Dit protocol bevat een gereedschapskist om traanklierorganoïden af te leiden uit primair weefsel van muizen en mensen. Het protocol beschrijft hoe de functionaliteit van de organoïden verder kan worden verbeterd door eenvoudige groeifactorterugtrekking en hoe de organoïden kunnen worden uitgelokt om traanvocht af te scheiden door een zwellingstest uit te voeren. Dit protocol bevat bovendien een op elektroporatie gebaseerde transfectiemethode om muisorganoïden genetisch te manipuleren met behulp van CRISPR-afgeleide basiseditors. In tegenstelling tot conventionele Cas9, maakt het gebruik van base editors de modificatie van enkele basen in het genoom mogelijk zonder een dubbelstrengs breukte genereren 11,12. Ten slotte wordt de orthotopische transplantatie van menselijke traanklierorganoïden in immunodeficiënte muizen en de daaropvolgende histologische beoordeling van de engraftment beschreven. Deze traanklier organoïde toolkit kan worden gebruikt in onderzoek naar traanklierregeneratie en -functie en voor genetische en ontstekingsziektemodellering.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL safe-lock centrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>EP0030 120.094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,3&#8242;-Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrate (DAB)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5637</td>
			<td>CAS: 868272-85-9 , CAUTION, 6 g/L solution can be stored aliquotted at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5x green GoTaq Flexi buffer</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M891A</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A83-01</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2939</td>
			<td>Store at -20 &#176;C, stock at 30 mM, 10000x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12634-010</td>
			<td>store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar plates containing Ampicillin</td>
			<td>Hubrecht Institute</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave VAPOUR-Line lite</td>
			<td>VWR chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>Store at -20 &#176;C, 50x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Micro-Fine insulin needle 1 mL</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>324825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop microscope DMI1</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumine (BSA)</td>
			<td>MP biomedicals</td>
			<td>160069</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BTXpress</td>
			<td>BTX</td>
			<td>MDS450805</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 mice</td>
			<td>Hubrecht Institute</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cassettes</td>
			<td>Klinipath</td>
			<td>410-02S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellBanker 1</td>
			<td>amsbio</td>
			<td>11910</td>
			<td>Cryopreservation medium, adhere to instructions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid monohydrate</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>0088</td>
			<td>CAS: 5949-29-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase I</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C9407</td>
			<td>Aliquots at 20 mg/mL, 20x, store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes 15 mL</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>5618-8271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes 50 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS430828-500EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips 24 mm x 50 mm</td>
			<td>Menzel-Gl&#228;zer</td>
			<td>BB024050S1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex Basement Membrane Extract (BME), Growth Factor Reduced, Type 2 - extracellular matrix</td>
			<td>R&#38;D Systems, Bio-Techne</td>
			<td>3533-001-02</td>
			<td>Store at -20 &#176;C, keep at 4 &#176;C for up to 1 month</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPT</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D5942</td>
			<td>Store at -20 &#176;C, stock at 10 mM, 1000x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium hydrogen phosphate anhydrous</td>
			<td>VWR chemicals</td>
			<td>28026.292</td>
			<td>CAS: 7558-79-4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Di-sodiumhydrogenphosphate dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71643</td>
			<td>CAS:10028-24-7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>17105-041</td>
			<td>Aliquots at 50 U/mL, store at -20 &#176;C until use, 400x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Scalpel Sterile N&#176; 10</td>
			<td>Swann Morton</td>
			<td>3033838</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DM4000 microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTPs 25 mM</td>
			<td>Promega</td>
			<td>U1420</td>
			<td>Mix all 4 nucleotides together, Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dpn1</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate-bufferd Saline (DPBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190144</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Easy strainers 70 &#181;m</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>542170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation cuvette</td>
			<td>Nepagene</td>
			<td>EC002S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EnVision+/HRP mouse</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>K400111-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 100%</td>
			<td>BOOM</td>
			<td>84045206;5000</td>
			<td>CAUTION, Use to prepare other Ethanol dilutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 70%</td>
			<td>BOOM</td>
			<td>84010059.5000</td>
			<td>CAUTION</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 96%</td>
			<td>BOOM</td>
			<td>84050065.5000</td>
			<td>CAUTION</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS FL Auto 2 Cell Imaging System</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Live-imaging brightfield microscrope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF10</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-26</td>
			<td>Store at -20 &#176;C, stock at 100 mg/mL in base medium, 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td>NIH, Fiji developers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution 4%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1.00496</td>
			<td>CAS: 50-00-0, CAUTION</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1099</td>
			<td>Store at -20 &#176;C, stock at 10 mM, 10000x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GoTaq G2 Flexi DNA Polymerase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M7805</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Haematoxylin</td>
			<td>VWR chemicals</td>
			<td>10047105</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td>Store at 4 &#176;C, 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histocore H and C, Tissue embedding machine</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate</td>
			<td>Meidax</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human nucleolar antigen antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab-190710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid 5 N</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10605882</td>
			<td>CAS: 7647-01-0, CAUTION</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxyde 30%</td>
			<td>Chem-lab</td>
			<td>CL00.2308.1000</td>
			<td>CAS: 7722-84-1, CAUTION</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygromycin B-gold</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ant-hg</td>
			<td>Stock at 100 mg/&#181;L, 1000x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygromycin resistance cassette-containing plasmid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Andersson-Rolf et al, Nature Methods, 2017. doi: 10.1038/nmeth.4156</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IsoFlo 100%</td>
			<td>Mecan</td>
			<td>5960501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB medium</td>
			<td>Hubrecht Institute</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 25 mM</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A351H</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome RM2235</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Midiprep DNA isolation kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>K210005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniprep DNA isolation kit</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>K210003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetylcysteine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9165</td>
			<td>Store at -20 &#176;C, stock at 500 mM, 400x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEPA21 electroporator</td>
			<td>Nepagene</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>N0636</td>
			<td>Store at -20 &#176;C, stock at 1M, 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOD Scid Gamma (NSG) mice</td>
			<td>Hubrecht Institute colony</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noggin conditioned medium</td>
			<td>U-Protein Express</td>
			<td>Custom order</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noradrenaline</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A7257</td>
			<td>Store at -20 &#176;C, stock at 100 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Memmert</td>
			<td></td>
			<td>Set at 58 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P20, P200 and P1000 pipettes</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin</td>
			<td>VWR chemicals</td>
			<td>10048502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipettes, glass plugged</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>1150-6973</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pax6_C&#62;T_F: AGACTGTTCCAGGATGGCTG&#160;</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pax6_C&#62;T_R: TCTCCTAGGTACTGGAAGCC&#160;</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCMV_ABEmax_P2A_GFP</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>112101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pertex</td>
			<td>Klinipath</td>
			<td>AM-08010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pFYF1320&#160;</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>47511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ant-pm-1</td>
			<td>1000X, store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prostaglandin E2 (PGE2)</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2296</td>
			<td>Store at -20 &#176;C, stock at 10 mM, 10000x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish, 10 cm</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>633102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B9027S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 high-fidelity DNA polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0491S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuickExtract DNA Extraction Solution</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>QE09050</td>
			<td>Store aliquots at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-spondin 3 conditioned medium</td>
			<td>U-Protein Express</td>
			<td>Custom order</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sgRNA Reverse Primer: TCTGCGCCCATCTGTTGCTT CGGTGTTTCGTCCTTTCCACAAG</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides</td>
			<td>StarFrost</td>
			<td>MBB-0302-55A</td>
			<td>Adhesive, ground</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8.22335.1000</td>
			<td>CAS: 26628-22-8, CAUTION</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium cytrate dihydrate</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>0280</td>
			<td>CAS: 6132-04-3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Forward Primer: &#8220;/5phos/ GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG 
			TTAAAATAAGGC</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Subcloning efficiency competent cells DH5alpha</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18265-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suspension cell culture plates (24-well)</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>662102</td>
			<td>24-well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suspension cell culture plates (12-well)</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>665102</td>
			<td>12-well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAE buffer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>B49</td>
			<td>Stock at 50x, dilute to 1x with ultrapure water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transposase-containing plasmid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Andersson-Rolf et al, Nature Methods, 2017. doi: 10.1038/nmeth.4156</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express Enzyme</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12605-028</td>
			<td>store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U6_Forward primer: GGGCAGGAAGAGGGCCTAT</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Agarose 1000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Tulabo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Klinipath</td>
			<td>4055-9005</td>
			<td>CAS: 1330-20-7, CAUTION</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Abmole Bioscience</td>
			<td>Y-27632 dihydrochloride</td>
			<td>Store at -20 &#176;C, stock at 10 mM, 1000x</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishment, maintenance, differentiation, genetic manipulation, and transplantation of mouse and human lacrimal gland organoids

De traanklier is een essentieel orgaan voor oculaire oppervlaktehomeostase. Door het waterige deel van de traanfilm te produceren, beschermt het het oog tegen uitdrogingsstress en externe beledigingen. Er is weinig bekend over traanklier (patho)fysiologie vanwege het ontbreken van adequate in vitro modellen. Organoïde technologie heeft zich bewezen als een nuttig experimenteel platform voor meerdere organen. Hier delen we een protocol om muis- en menselijke traanklierorganoïden vast te stellen en te onderhouden, beginnend met traanklierbiopten. Door de kweekomstandigheden aan te passen, verbeteren we de organoïde functionaliteit van de traanklier. Organoïde functionaliteit kan worden onderzocht door middel van een "huilende" assay, waarbij de traanklierorganoïden worden blootgesteld aan geselecteerde neurotransmitters om traanafgifte in hun lumen te veroorzaken. We leggen uit hoe je dit fenomeen in beeld kunt brengen en kwantificeren. Om de rol van genen van belang in traanklierhomeostase te onderzoeken, kunnen deze genetisch worden gemodificeerd. We beschrijven grondig hoe traanklierorganoïden genetisch kunnen worden gemodificeerd met behulp van basiseditors - van gids-RNA-ontwerp tot organoïde kloongenotypering. Ten slotte laten we zien hoe we het regeneratieve potentieel van menselijke traanklierorganoïden kunnen onderzoeken door orthotopische implantatie in de muis. Samen biedt deze uitgebreide toolset middelen om maan en menselijke traanklierorganoïden te gebruiken om traanklier (patho) fysiologie te bestuderen.

Na de dissectie van de traanklier van de muis (figuur 2A) genereerde de enzymatische en mechanische spijsvertering kleine weefselfragmenten, waaronder de acini en kanalen konden worden onderscheiden (figuur 2B). De resterende grote stukken weefsel zouden de ECU destabiliseren, wat de initiële uitgroei van organoïden zou verminderen. De organoïde afleiding van de traanklier van de muis was succesvol toen cystische organoïden met een diameter van ~ 500 μm werden gevonden na ~ 7 dagen, het stadium waarin de organoïden klaar waren om te worden gesplitst (figuur 2C). Zelfs als de algehele organoïde afleiding succesvol is, kunnen sommige organoïden beginnen te groeien voordat ze uiteindelijk stoppen. Menselijke traanklierorganoïden groeiden binnen 3-4 dagen uit als cysten en bereikten de volgroeide grootte in 10-14 dagen na weefselisolatie (figuur 2D). Voor zowel muizen als mensen mislukte organoïde afleiding soms, met geen of weinig organoïden die uitgroeiden; Dit werd over het algemeen veroorzaakt door oververtering van het weefsel. De traanklierorganoïden van de muis kunnen minstens 40x worden gepasseerd en de menselijke organoïden minstens 20x. Passaging werd gemiddeld om de 7-10 dagen gedaan, afhankelijk van de organoïde groei.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65040/65040fig02.jpg"> Figuur 2: Oprichting van organoïden van de traanklier van muizen en mensen. (A) Foto's van de verschillende stadia van traanklierdissectie bij muizen. De pijl wijst naar de traanklier onder het beschermende membraan. (B) Brightfield-beelden van traankliercellen van muizen direct na weefselvertering, met inzetstukken die een acinus en een kanaal tonen. (C) Brightfield-beelden van een succesvolle en een mislukte malaanklier organoïde afleiding. (D) Brightfield-beelden van de uitgroei van menselijke organoïden in de loop van 14 dagen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65040/65040fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
De traanklierorganoïden bevatten een groot deel van de stamcellen wanneer ze in het expansiemedium worden gekweekt. Om hun differentiatieniveau te verhogen, hebben we een muis en een menselijk differentiatiemedium met een verlaagd groeifactorgehalte opgezet. Na respectievelijk 5 dagen en 7 dagen werden in het differentiatiemedium de organoïden van de muis en de menselijke traanklier dichter (figuur 3A-B). Deze morfologische verandering correleerde met verhoogde functionele eigenschappen. Het aanbrengen van de cyclische AMP-activator forskoline of de neurotransmitter noradrenaline resulteerde in organoïde zwelling (d.w.z. apicale watersecretie) binnen minder dan 3 uur (figuur 3C). Wanneer de zwelling langer dan 3-4 uur duurde, suggereerde dit dat de organoïden niet voldoende gedifferentieerd waren en/of geen functionele markers tot expressie brachten, zoals receptoren voor neurotransmitters.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65040/65040fig03.jpg"> Figuur 3: Differentiatie van muis en menselijke traanklier organoïden en functionele zwelling assay in menselijke organoïden. (A) Brightfield-beelden van traanklierorganoïden van muizen gekweekt in expansiemedium gedurende 7 dagen en in differentiatiemedium gedurende 5 dagen na 2 dagen in expansiemedium. (B) Brightfield-beelden van menselijke traanklierorganoïden gekweekt in expansiemedium gedurende 11 dagen en in differentiatiemedium gedurende 9 dagen na 2 dagen in expansiemedium. (C) Brightfield-beelden van gedifferentieerde menselijke traanklierorganoïden blootgesteld aan vers differentiatiemedium (controle), aan 1 μM forskolin en aan 100 μM noradrenaline in de loop van 3 uur. Klik <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65040/65040fig03large.jpg" target="_blank">hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Om Pax6 in de traanklierorganoïden van de muis uit te schakelen, werd een plasmide met het gekozen Pax6-gerichte gRNA gegenereerd door PCR en ligatie (figuur 4A). Dit gRNA-bevattende plasmide werd geëlektropoeerd samen met de Piggy-Bac plasmiden (hygromycine resistentie transposon-bevattende en transposase-bevattende plasmiden) en de C > T base editor Cas9 in muis traanklier organoïden gedissocieerd in enkele cellen. Na 3 dagen, toen de organoïden waren hersteld, werden ze blootgesteld aan hygromycine om te selecteren op klonen die de hygromycineresistentiecassette hadden opgenomen. Bij succesvolle elektroporaties groeiden organoïden uit die resistent waren tegen hygromycine (figuur 4B). De groeiende organoïde klonen die groter waren dan ~ 300 μm werden geplukt, idealiter voordat ze spontaan begonnen te differentiëren (figuur 4C). DNA werd geëxtraheerd uit een deel van de organoïde terwijl de rest in cultuur bleef. De PCR-amplificatie van de Pax6-locus waarop het gRNA zich richt, leverde een band van 367 bp op voor elk van de geplukte klonen (figuur 4D). Na sequencing van de versterkte locus werden klonen bewaard die homozygisch C > T bewerkt waren (n = 1). Aan de andere kant werden klonen die niet waren bewerkt (n = 4), heterozygously bewerkt of verkeerd bewerkt (n = 1) weggegooid (figuur 4E). Over het algemeen werd met behulp van dit gRNA gericht op Pax6 één homozygote knock-out muis traanklierkloon van de zes gesequencede verkregen. Sommige klonen groeiden goed uit, maar sommige organoïde klonen gingen verloren na het plukken of begonnen te differentiëren (figuur 4F). Van de 10 geplukte organoïde klonen groeiden er 7 goed uit.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65040/65040fig04.jpg"> Figuur 4: Base editing-gemedieerde knock-out van Pax6 in muis traanklier organoïden. (A) Sanger sequencing spoor van pFYF1320 na correcte integratie van het gRNA gericht op de Pax6 locus. (B) Brightfield-beelden van traanklierorganoïden van muizen 5 dagen na blootstelling aan hygromycine na elektroporatie. De organoïden werden gekweekt in muisexpansiemedium. Aan de linkerkant is een voorbeeld van een mislukte elektroporatie, waarbij geen kloon resistent is tegen hygromycine die uitgroeit. Aan de rechterkant is een voorbeeld van een succesvolle elektroporatie, waarbij verschillende hygromycine-resistente organoïde klonen overleven. (C) Brightfield-afbeeldingen van klonen die moeten worden geplukt en klonen die niet mogen worden geplukt. (D) Agarose-gel die de versterking van de Pax6-locus met het gRNA toont. In het groen is de band van de verwachte grootte van 367 bp gemarkeerd. (E) Sanger sequencing spoor van drie organoïde klonen die resistent waren tegen hygromycine. De bovenste kloon is onbewerkt. De middelste kloon is een homozygote C- > T-editie en dus een homozygote knock-out. De onderste kloon vertoont twee heterozygote puntmutaties en is ofwel een heterozygote knock-out of een gemengde kloon en is verkeerd bewerkt. (F) Brightfield-afbeeldingen van de geplukte organoïde klonen met verschillende niveaus van uitgroei. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65040/65040fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Ten slotte werden voor het uitvoeren van menselijke traanklier organoïde orthotopische transplantatie bij muizen organoïden gebruikt die 3 dagen van tevoren waren gesplitst (< 100 μm in diameter). Organoïde engraftment werd bevestigd 1 maand na het injecteren van de organoïden in de traanklier van de muis door kleuring voor een mensspecifieke marker, het menselijke nucleolaire antigeen (figuur 5). De afwezigheid van punctaatkleuring uit alle delen van de traanklier van de muis duidde op een gebrek aan menselijke organoïde engraftment.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65040/65040fig05.jpg"> Figuur 5: Transplantatie van menselijke traanklierorganoïden in de traanklier van de muis. Kleuring van getransplanteerde traanklieren van muizen voor de menselijke nucleolaire marker om transplantatie 1 maand na transplantatie te controleren. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65040/65040fig05large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Aanvullende tabel 1: Samenstelling van de media en buffers. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65040/Supplementary%20Table%201.xlsx" target="_blank">Klik hier om deze tabel te downloaden.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Establishment, Maintenance, Differentiation, Genetic Manipulation, and Transplantation of Mouse and Human Lacrimal Gland Organoids at JoVE.com

Establishment, Maintenance, Differentiation, Genetic Manipulation, and Transplantation of Mouse and Human Lacrimal Gland Organoids

Dit protocol beschrijft hoe traanklierorganoïden afgeleid van primair muis- en menselijk weefsel kunnen worden vastgesteld, onderhouden, genetisch gemodificeerd, gedifferentieerd, functioneel karakteriseren en transplanteren.

Vestiging, onderhoud, differentiatie, genetische manipulatie en transplantatie van muis en menselijke traanklier organoïden

The lacrimal gland is an essential organ for ocular surface homeostasis. By producing the aqueous part of the tear film, it protects the eye from ...

Met traanklierorganoïden kan men onderzoeken hoe bepaalde genen de homeostase van de traanklier regelen. Bovendien kunnen de organoïden worden gebruikt voor regeneratieve geneeskunde. Het belangrijkste voordeel van volwassen stamcel-afgeleide traanklier organoïde technologie is dat het de groei en studie van gezonde en niet-getransformeerde traanklierepitheelcellen mogelijk maakt.Deze organoïden kunnen uiteindelijk worden gebruikt om patiënten met droge ogen te behandelen. Begin met het voorbereiden van het medium en het materiaal dat nodig is voor het experiment, gevolgd door het combineren van alle componenten van het verteringsmedium vóór het experiment. Maak de scalpels in dit medium voor om te voorkomen dat er stukjes weefsel aan blijven plakken.Haal het traanklierweefsel van de muis uit het medium, plaats het in de petrischaal en hak het fijn met behulp van voorbevochtigde scalpels. Zodra de weefselstukken minder dan 0,5 kubieke millimeter zijn, schraap je ze met het scalpel van de petrischaal en breng je ze over in een buis van 15 milliliter met het verteringsmedium. Voor een zeer kleine menselijke biopsie, plaats het direct in het verteringsmedium zonder gehakt.Incubeer de buis van 15 milliliter met weefselstukjes gedurende maximaal 15 minuten in een waterbad van 37 graden Celsius. Vernauw ondertussen een Pasteur-pipetpunt in een vlam en maak deze voor nat in het basismedium. Om het dissociatieproces te vergemakkelijken, pipetteert u het gehaktmengsel elke vijf minuten op en neer met de voorbevochtigde, versmalde Pasteur-pipet.Wanneer veel enkele cellen en kleine klonten zichtbaar zijn onder de microscoop, stop dan de dissociatie door 10 milliliter van het basismedium toe te voegen. Nadat u gedurende vijf minuten op 400 g hebt gedraaid, verwijdert u het supernatant en resuspenseert u de pellet in 10 milliliter van het basismedium om de was te herhalen en de cellen te pelleteren. Verwijder de grote, onverteerde weefselstukken en resterende collageenvezels door het gehakte mengsel door een zeef van 70 micrometer te filteren.Draai de eluate vijf minuten op 400g. Na het verwijderen van het supernatant, resuspendien de celpellet in 100 microliter koude extracellulaire matrix, of ECM, voor een enkele muis traanklier en 50 microliter koude ECM voor een menselijke biopsie, zonder de bubbels te creëren. Zaai tot 100 microliter cellen per put van een 12-well suspensieplaat met behulp van een P200 om ongeveer 20-microliter druppels in de put te maken.Plaats de plaat ondersteboven in een bevochtigde incubator bij 37 graden Celsius gedurende 20 tot 30 minuten om ECM-stolling mogelijk te maken. Zodra de ECU is gestold, voegt u ongeveer één milliliter muisexpansiemedium op kamertemperatuur toe per put van een 12-putplaat. Maak vers een milliliter menselijk differentiatiemedium bereid dat individuele componenten bevat die secretie door de traanklierorganoïden induceren.Stel met een geautomatiseerde brightfield time-lapse microscoop de posities in die in de plaat moeten worden vastgelegd, het tijdsinterval van vijf minuten en de duur van vier uur. Zorg ervoor dat op elke positie een hele ECM-druppel zichtbaar is. Voordat u begint met het afbeelden, verwijdert u het kweekmedium uit de te fotograferen putten zonder de plaat van de microscoop te verplaatsen en vervangt u deze door het vers bereide, goed geresuspendeerde menselijke differentiatiemedium dat verbindingen bevat, waaronder forskoline en noradrenaline.Neem als negatieve controle een put op met een vernieuwd differentiatiemedium. Klik op de knop Uitvoeren op de microscoop en analyseer de resultaten na vier uur. Na het dissociëren van de organoïden zoals vermeld in de tekst, gooit u het supernatant weg.Resuspendeerde de cellen in 80 microliter van de elektroporatiebuffer. Bereid in een buis van 1,5 milliliter de plasmiden voor die nodig zijn voor het experiment. Voeg de plasmiden toe aan de cellen en meng goed door op en neer te pipetteren.Stel de elektroporator in met de parameters voor poring pulse en transfer pulse. Plaats de cellen met de plasmiden in een elektroporatiecuvet. Meet onmiddellijk de weerstand, die tussen 0,3 ampère en 0,55 ampère moet liggen, en elektroporate onmiddellijk.Als u klaar bent, brengt u de cellen over naar een buis van 1,5 milliliter en voegt u 400 microliter elektroporatiebuffer toe, aangevuld met een Rho-kinaseremmer. Laat de cellen gedurende 30 minuten herstellen bij kamertemperatuur. Pellet vervolgens de cellen gedurende vijf minuten op 500 g.Na het weggooien van het supernatant, plaat de cellen in 200 microliter ECM. Voeg na het stollen het muisexpansiemedium toe. Voor organoïdepreparaat, splits de menselijke traanklierorganoïden ongeveer drie dagen vóór de transplantatiedag.Om de organoïden uit de ECU te extraheren, voegt u dispase toe aan het kweekmedium om een eindconcentratie van 0,125 eenheden per milliliter te bereiken en resuspenseert u de ECM-druppels grondig om ze te verstoren met behulp van een P1000. Plaats de plaat gedurende 30 minuten terug in de incubator van 37 graden Celsius. Resuspendeer de organoïden in 10 milliliter basismedium om het enzym uit te spoelen.Na het pelleteren van de cellen op 400 g gedurende vijf minuten, resuspensie ze in 50 microliter koud menselijk expansiemedium aangevuld met 5% ECM. Plaats de organoïde suspensie op ijs en ga onmiddellijk over tot de transplantatie. Voor orthotopische transplantatie bij muizen, zuig de organoïde suspensie in een insulinenaald.Wanneer de muis slaapt, plaats hem dan snel op zijn zij met de belangrijkste traanklier toegankelijk. Injecteer vijf microliter van de organoïde suspensie rechtstreeks door de huid in de traanklier. Laat de muis herstellen en beoordeel dagelijks de aanwezigheid van transplantatiegerelateerd ongemak, vooral in het oog.Na de dissectie van de traanklier van de muis genereerde de enzymatische en mechanische spijsvertering kleine weefselfragmenten, waaronder de acini en de kanalen. In de succesvolle meristraanklier organoïde afleiding werden cystische organoïden van ongeveer 500 micrometer diameter gevonden na zeven dagen. Menselijke traanklierorganoïden groeiden als cysten binnen drie tot vier dagen en bereikten een volgroeide grootte in 10 tot 14 dagen na weefselisolatie.Na respectievelijk vijf dagen en zeven dagen in het differentiatiemedium werden de organoïden van de muis en de menselijke traanklier dichter. Het aanbrengen van de cyclische AMP-activator forskoline of de neurotransmitter noradrenaline resulteerde in organoïde zwelling binnen minder dan drie uur. Bij succesvolle elektroporatie groeiden organoïden uit die resistent waren tegen hygromycine.De groeiende organoïde klonen groter dan 300 micrometer werden geplukt voordat ze werden gedifferentieerd. PCR-amplificatie van de Pax6-locus gericht door gids-RNA leverde een 367-basenpaarband op voor alle geselecteerde klonen. Eén homozygote knock-out muis traanklier kloon van de zes gesequencede werd verkregen met behulp van het gids-RNA gericht op Pax6.Sommige klonen groeiden goed uit, maar sommige organoïde klonen gingen verloren na het plukken of begonnen te differentiëren. Van de 10 geplukte organoïde klonen groeiden er zeven goed uit. Organoïde engraftment werd bevestigd een maand na het injecteren van de organoïden in de traanklier van de muis door kleuring voor een mensspecifieke marker, het menselijke nucleolaire antigeen.Een ding om op te letten is om het weefsel niet te oververteren, noch de organoïden. Anders zouden de cellen kunnen afsterven, en dit zou de organoïde vestigingssnelheid verminderen. Traanklierorganoïden kunnen worden geanalyseerd door histologie.Door dit te doen, kan men inzicht krijgen in hun cellulaire samenstelling.

Research

JoVE Journal

Biology

Generation of Human CD40-activated B cells

Generatie van de Mens CD40-geactiveerde B-cellen

CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been identified as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cancer ...

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells  

Cultuur en onderhoud van menselijke embryonale stamcellen

Human embryonic stem (hES) cells must be monitored and cared for in order to maintain healthy, undifferentiated cultures. At minimum, the cultures must be ...

Isolation and Genetic Manipulation of Adult Cardiac Myocytes for Confocal Imaging

Isolatie en genetische manipulatie van Adult hartspiercellen voor confocale Imaging

Cardiac myocytes isolated from adult hearts are widely accepted as a model somewhere half way between embryonic and neonatal muscle cells on one side and ...

Genetic Modification and Recombination of Salivary Gland Organ Cultures

Genetische Modificatie en recombinatie van speekselklier Orgel culturen

Branching  morphogenesis occurs during the development of many organs, and the embryonic  mouse submandibular gland (SMG) is a classical model for the ...

Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells

Generatie van Human Cardiomyocytes: Een Differentiatie Protocol van Feeder-vrije Human geïnduceerde pluripotente stamcellen

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is ...

Alternative Cultures for Human Pluripotent Stem Cell Production, Maintenance, and Genetic Analysis

Alternatieve Cultures for Human pluripotente stamcellen zijn Productie, Onderhoud, en genetische analyses

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and ...

Manipulating the Murine Lacrimal Gland

Het manipuleren van de muizen traanklier

The lacrimal gland (LG) secretes aqueous tears necessary for maintaining the structure and function of the cornea, a transparent tissue essential for ...

Establishment and Maintenance of Gnotobiotic American Cockroaches (Periplaneta americana)

Establishment and Maintenance of Gnotobiotic American Cockroaches Periplaneta americana

Oprichting en onderhoud van Gnotobiotische Amerikaanse kakkerlakken (Periplaneta americana)

Gnotobiotic animals are a powerful tool for the study of controls on microbiome structure and function. Presented here is a protocol for the establishment ...

Establishment and Genetic Manipulation of Murine Hepatocyte Organoids

Vaststelling en genetische manipulatie van Murine Hepatocyte Organoïden

The liver is the largest organ in mammals. It plays an important role in glucose storage, protein secretion, metabolism and detoxification. As the ...

Three-Dimensional, Serum-Free Culture System for Lacrimal Gland Stem Cells

Driedimensionaal, serumvrij kweeksysteem voor traanklierstamcellen

Lacrimal gland (LG) stem cell-based therapy is a promising strategy for lacrimal gland diseases. However, the lack of a reliable, serum-free culture ...