Name: establishment, maintenance, differentiation, genetic manipulation, and transplantation of mouse and human lacrimal gland organoids
Uploaded: 2023-02-03T14:15:00
Duration: 10 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Establishment, Maintenance, Differentiation, Genetic Manipulation, and Transplantation of Mouse and Human Lacrimal Gland Organoids at JoVE.com

Nous remercions Yorick Post pour le développement initial du protocole. Ce travail a été en partie soutenu par un prix du Cancer Research UK Grand Challenge (C6307/A29058) et de la Mark Foundation for Cancer Research à l’équipe SPECIFICANCER.

<ol>
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Hans Clevers est responsable de la recherche pharmaceutique et du développement précoce chez Roche, Bâle, et détient plusieurs brevets liés à la technologie organoïde.

Ce protocole décrit l’établissement et l’utilisation d’organoïdes de la glande lacrymale pour les essais fonctionnels, la modélisation des mutations et la transplantation. Lors de l’établissement d’organoïdes de la glande lacrymale de souris et d’humains, la dissociation des tissus est cruciale. Si le tissu n’est pas suffisamment digéré, le rendement organoïde sera faible. Si le tissu est trop digéré, les cellules mourront et ne se développeront pas sous forme d’organoïdes. Chaque tissu doit être digéré avec une enzyme spécifique pendant un temps spécifique pour assurer une excroissance organoïde optimale14,17,18. La glande lacrymale est un tissu plutôt mou pour lequel une digestion de collagénase de 5 à 10 min combinée à une dissociation mécanique à base de pipetage est suffisante pour isoler de petits morceaux de tissu. Si des cellules uniques doivent être obtenues pour des applications telles que le séquençage de l’ARN unicellulaire, la dissociation peut être effectuée plus longtemps jusqu’à ce que le stade unicellulaire soit atteint, mais la dissociation doit être arrêtée dès que des cellules uniques sont obtenues pour limiter toute diminution de la viabilité. Comme la dissociation tissulaire est si cruciale, la surdigestion est la raison la plus probable de l’échec de l’établissement organoïde de la glande lacrymale.
L’entretien approprié des organoïdes de la glande lacrymale est important pour leur utilisation. L’entretien à long terme est une caractéristique des organoïdes des glandes lacrymales dérivées de cellules souches adultes, par rapport aux organoïdes induits dérivés de cellules souches pluripotentes 7,17. Pour assurer l’entretien à long terme, un fractionnement régulier des organoïdes et des changements de milieu doivent être effectués. Sans cela, les organoïdes commencent à se différencier et à développer une diminution du potentiel des cellules souches, ce qui entrave leur maintien à long terme7. À cette étape encore, une surdigestion peut tuer les cellules souches et nuire à l’entretien des organoïdes. Pour un entretien régulier, la dissociation organoïde en cellules individuelles n’est pas nécessaire. Cependant, pour générer des lignées organoïdes knock-out clonales, il est essentiel de commencer par des cellules individuelles. Sinon, les organoïdes seront constitués d’une mosaïque de cellules ayant des antécédents génétiques différents, rendant impossible l’analyse de l’effet d’une seule mutation définie. Ici, nous décrivons l’utilisation d’un éditeur de base C > T pour générer des codons stop. Cet éditeur du génome repose sur la présence de codons d’arginine, de glutamine ou de tryptophane dans 12 à 18 bases d’un NGG PAM. Lorsque ces conditions ne sont pas remplies dans la conception d’un ARNg, des éditeurs de base conventionnels Cas9 ou C >T avec des PAM alternatifs peuvent être utilisés 7,18. Cependant, le Cas9 conventionnel introduit des ruptures double brin qui entraînent des indels lors de la réparation11. Comme les deux allèles peuvent abriter des indels différents, le génotypage des clones nécessite une prudence supplémentaire. La déconvolution des modifications introduites doit être effectuée pour s’assurer que les deux allèles contiennent des indels hors cadre et, par conséquent, que les clones organoïdes sont éliminés pour le gène ciblé19. L’avantage des éditeurs de bases C > T réside dans le fait qu’ils peuvent être utilisés pour modéliser des mutations ponctuelles qui n’aboutissent pas nécessairement à des codons stop. Par exemple, ils peuvent être utilisés pour modéliser des mutations spécifiques de Pax6 trouvées chez des patients atteints d’aniridie afin d’étudier leur impact sur la physiologie de la glande lacrymale20.
La glande lacrymale sécrète la partie aqueuse du filmlacrymal 1. La sécrétion lacrymale peut être récapitulée dans les organoïdes humains après différenciation médiée par le retrait du facteur de croissance et l’inhibition de NOTCH. Dans ces conditions, les organoïdes subissent une différenciation terminale et ne peuvent plus être maintenus. Pourtant, les organoïdes différenciés des glandes lacrymales peuvent guider le développement de médicaments induisant des déchirures dans le contexte de la sécheresse oculaire, potentiellement dans les cribles à haut débit. Le test de déchirure présenté dans ce protocole est celui qui donne actuellement le plus grand changement de taille organoïde en peu de temps, ce qui le rend plus facile à quantifier dans le contexte d’un dépistage de drogue 7,9,17.
La thérapie par cellules souches est très prometteuse pour la régénération des glandes lacrymales dans la sécheresse oculaire21. Les organoïdes des glandes lacrymales dérivés de cellules souches adultes pourraient être une matière première pour de telles applications. Le protocole présenté ici aboutit à une greffe organoïde de glande lacrymale humaine, principalement sous forme de kystes. Une faible greffe d’organoïdes peut survenir en raison de l’injection d’organoïdes au mauvais endroit. L’entraînement de la procédure d’injection avec un colorant permet le suivi du site d’injection et, en fin de compte, améliore la précision de l’injection. Alternativement, l’épiderme de souris peut être incisé pour avoir un accès direct à la glande lacrymale, comme chez le rat avant22 ans. Cette méthode prend plus de temps mais peut être plus précise. D’autre part, avec le présent protocole, les organoïdes ne se sont pas intégrés fonctionnellement dans la glande lacrymale de la souris. Des résultats similaires ont été observés pour la greffe de glande lacrymale dérivée de l’iPSC22. La méthode de transplantation pourrait être encore améliorée en blessant la glande lacrymale à l’avance, en utilisant un modèle de souris à œil sec, et / ou en injectant les organoïdes sous forme de cellules uniques ou de petits amas de petits touffes. Néanmoins, les organoïdes des glandes lacrymales dérivés de cellules souches adultes et la boîte à outils connexe peuvent constituer la base d’applications futures dans la recherche sur les glandes lacrymales et la médecine régénérative.

La glande lacrymale est l’épithélium glandulaire responsable de la production de la majeure partie de la couche aqueuse du filmlacrymal 1. La couche aqueuse du film lacrymal contient non seulement de l’eau pour lubrifier la surface oculaire, mais aussi un large répertoire de composants antimicrobiens qui protègent la surface oculaire contre les infections2. Lorsque la glande lacrymale est endommagée ou enflammée, une maladie de l’œil sec se produit, ce qui entraîne une gêne pour les patients et peut éventuellement entraîner une perte de vision3. Au fil des ans, les systèmes modèles pour étudier la glande lacrymale, en particulier la glande humaine, ont été limités 4,5,6. Cela a contribué à combler un manque de connaissances sur la fonction des glandes lacrymales dans des conditions physiologiques et pathologiques.
Récemment, des modèles in vitro ont été développés pour étudier la glande lacrymale dans une boîte 7,8,9. Ces organoïdes des glandes lacrymales sont dérivés de cellules souches adultes cultivées comme structures tridimensionnelles dans une matrice extracellulaire complétée par un cocktail de facteurs de croissance qui soutient leurs capacités de régénération in vitro7. L’avantage des organoïdes dérivés de cellules souches adultes (ASC) est qu’ils peuvent être maintenus très longtemps tout en récapitulant les caractéristiques des tissus sains. Ce type d’organoïde se compose uniquement de cellules épithéliales, contrairement aux organoïdes dérivés de cellules souches pluripotentes induites (CSPi), qui peuvent également contenir des cellules stromales, par exemple. Contrairement aux organoïdes dérivés de cellules souches pluripotentes (CSP), les organoïdes ASC sont établis directement à partir de tissus adultes et ne nécessitent aucune modification génétique pour être développés. Les organoïdes ASC expriment des caractéristiques adultes10.
Ce protocole contient une boîte à outils pour dériver des organoïdes de glande lacrymale à partir de tissus primaires de souris et humains. Le protocole décrit comment améliorer davantage la fonctionnalité des organoïdes par un simple retrait du facteur de croissance et comment provoquer les organoïdes à sécréter du liquide lacrymal en effectuant un test de gonflement. Ce protocole comprend en outre une méthode de transfection basée sur l’électroporation pour modifier génétiquement des organoïdes de souris à l’aide d’éditeurs de base dérivés de CRISPR. Contrairement au Cas9 classique, l’utilisation d’éditeurs de bases permet de modifier des bases simples dans le génome sans générer de cassure double brin11,12. Enfin, la transplantation orthotopique d’organoïdes des glandes lacrymales humaines chez des souris immunodéficientes et l’évaluation histologique ultérieure de la greffe sont décrites. Cette boîte à outils organoïde de la glande lacrymale peut être utilisée dans la recherche sur la régénération et la fonction des glandes lacrymales et pour la modélisation des maladies génétiques et inflammatoires.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL safe-lock centrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>EP0030 120.094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,3&#8242;-Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrate (DAB)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5637</td>
			<td>CAS: 868272-85-9 , CAUTION, 6 g/L solution can be stored aliquotted at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5x green GoTaq Flexi buffer</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M891A</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A83-01</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2939</td>
			<td>Store at -20 &#176;C, stock at 30 mM, 10000x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12634-010</td>
			<td>store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar plates containing Ampicillin</td>
			<td>Hubrecht Institute</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave VAPOUR-Line lite</td>
			<td>VWR chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>Store at -20 &#176;C, 50x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Micro-Fine insulin needle 1 mL</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>324825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop microscope DMI1</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumine (BSA)</td>
			<td>MP biomedicals</td>
			<td>160069</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BTXpress</td>
			<td>BTX</td>
			<td>MDS450805</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 mice</td>
			<td>Hubrecht Institute</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cassettes</td>
			<td>Klinipath</td>
			<td>410-02S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellBanker 1</td>
			<td>amsbio</td>
			<td>11910</td>
			<td>Cryopreservation medium, adhere to instructions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid monohydrate</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>0088</td>
			<td>CAS: 5949-29-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase I</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C9407</td>
			<td>Aliquots at 20 mg/mL, 20x, store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes 15 mL</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>5618-8271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes 50 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS430828-500EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips 24 mm x 50 mm</td>
			<td>Menzel-Gl&#228;zer</td>
			<td>BB024050S1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex Basement Membrane Extract (BME), Growth Factor Reduced, Type 2 - extracellular matrix</td>
			<td>R&#38;D Systems, Bio-Techne</td>
			<td>3533-001-02</td>
			<td>Store at -20 &#176;C, keep at 4 &#176;C for up to 1 month</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPT</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D5942</td>
			<td>Store at -20 &#176;C, stock at 10 mM, 1000x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium hydrogen phosphate anhydrous</td>
			<td>VWR chemicals</td>
			<td>28026.292</td>
			<td>CAS: 7558-79-4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Di-sodiumhydrogenphosphate dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71643</td>
			<td>CAS:10028-24-7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>17105-041</td>
			<td>Aliquots at 50 U/mL, store at -20 &#176;C until use, 400x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Scalpel Sterile N&#176; 10</td>
			<td>Swann Morton</td>
			<td>3033838</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DM4000 microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTPs 25 mM</td>
			<td>Promega</td>
			<td>U1420</td>
			<td>Mix all 4 nucleotides together, Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dpn1</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate-bufferd Saline (DPBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190144</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Easy strainers 70 &#181;m</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>542170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation cuvette</td>
			<td>Nepagene</td>
			<td>EC002S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EnVision+/HRP mouse</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>K400111-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 100%</td>
			<td>BOOM</td>
			<td>84045206;5000</td>
			<td>CAUTION, Use to prepare other Ethanol dilutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 70%</td>
			<td>BOOM</td>
			<td>84010059.5000</td>
			<td>CAUTION</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 96%</td>
			<td>BOOM</td>
			<td>84050065.5000</td>
			<td>CAUTION</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS FL Auto 2 Cell Imaging System</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Live-imaging brightfield microscrope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF10</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-26</td>
			<td>Store at -20 &#176;C, stock at 100 mg/mL in base medium, 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td>NIH, Fiji developers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution 4%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1.00496</td>
			<td>CAS: 50-00-0, CAUTION</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1099</td>
			<td>Store at -20 &#176;C, stock at 10 mM, 10000x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GoTaq G2 Flexi DNA Polymerase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M7805</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Haematoxylin</td>
			<td>VWR chemicals</td>
			<td>10047105</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td>Store at 4 &#176;C, 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histocore H and C, Tissue embedding machine</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate</td>
			<td>Meidax</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human nucleolar antigen antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab-190710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid 5 N</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10605882</td>
			<td>CAS: 7647-01-0, CAUTION</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxyde 30%</td>
			<td>Chem-lab</td>
			<td>CL00.2308.1000</td>
			<td>CAS: 7722-84-1, CAUTION</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygromycin B-gold</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ant-hg</td>
			<td>Stock at 100 mg/&#181;L, 1000x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygromycin resistance cassette-containing plasmid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Andersson-Rolf et al, Nature Methods, 2017. doi: 10.1038/nmeth.4156</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IsoFlo 100%</td>
			<td>Mecan</td>
			<td>5960501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB medium</td>
			<td>Hubrecht Institute</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 25 mM</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A351H</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome RM2235</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Midiprep DNA isolation kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>K210005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniprep DNA isolation kit</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>K210003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetylcysteine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9165</td>
			<td>Store at -20 &#176;C, stock at 500 mM, 400x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEPA21 electroporator</td>
			<td>Nepagene</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>N0636</td>
			<td>Store at -20 &#176;C, stock at 1M, 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOD Scid Gamma (NSG) mice</td>
			<td>Hubrecht Institute colony</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noggin conditioned medium</td>
			<td>U-Protein Express</td>
			<td>Custom order</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noradrenaline</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A7257</td>
			<td>Store at -20 &#176;C, stock at 100 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Memmert</td>
			<td></td>
			<td>Set at 58 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P20, P200 and P1000 pipettes</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin</td>
			<td>VWR chemicals</td>
			<td>10048502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipettes, glass plugged</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>1150-6973</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pax6_C&#62;T_F: AGACTGTTCCAGGATGGCTG&#160;</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pax6_C&#62;T_R: TCTCCTAGGTACTGGAAGCC&#160;</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCMV_ABEmax_P2A_GFP</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>112101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pertex</td>
			<td>Klinipath</td>
			<td>AM-08010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pFYF1320&#160;</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>47511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ant-pm-1</td>
			<td>1000X, store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prostaglandin E2 (PGE2)</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2296</td>
			<td>Store at -20 &#176;C, stock at 10 mM, 10000x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish, 10 cm</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>633102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B9027S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 high-fidelity DNA polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0491S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuickExtract DNA Extraction Solution</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>QE09050</td>
			<td>Store aliquots at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-spondin 3 conditioned medium</td>
			<td>U-Protein Express</td>
			<td>Custom order</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sgRNA Reverse Primer: TCTGCGCCCATCTGTTGCTT CGGTGTTTCGTCCTTTCCACAAG</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides</td>
			<td>StarFrost</td>
			<td>MBB-0302-55A</td>
			<td>Adhesive, ground</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8.22335.1000</td>
			<td>CAS: 26628-22-8, CAUTION</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium cytrate dihydrate</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>0280</td>
			<td>CAS: 6132-04-3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Forward Primer: &#8220;/5phos/ GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG 
			TTAAAATAAGGC</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Subcloning efficiency competent cells DH5alpha</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18265-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suspension cell culture plates (24-well)</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>662102</td>
			<td>24-well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suspension cell culture plates (12-well)</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>665102</td>
			<td>12-well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAE buffer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>B49</td>
			<td>Stock at 50x, dilute to 1x with ultrapure water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transposase-containing plasmid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Andersson-Rolf et al, Nature Methods, 2017. doi: 10.1038/nmeth.4156</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express Enzyme</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12605-028</td>
			<td>store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U6_Forward primer: GGGCAGGAAGAGGGCCTAT</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Agarose 1000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Tulabo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Klinipath</td>
			<td>4055-9005</td>
			<td>CAS: 1330-20-7, CAUTION</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Abmole Bioscience</td>
			<td>Y-27632 dihydrochloride</td>
			<td>Store at -20 &#176;C, stock at 10 mM, 1000x</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishment, maintenance, differentiation, genetic manipulation, and transplantation of mouse and human lacrimal gland organoids

La glande lacrymale est un organe essentiel pour l’homéostasie de la surface oculaire. En produisant la partie aqueuse du film lacrymal, il protège l’œil du stress de dessiccation et des agressions extérieures. On sait peu de choses sur la (physionomie) de la glande lacrymale en raison du manque de modèles in vitro adéquats. La technologie organoïde s’est révélée être une plate-forme expérimentale utile pour plusieurs organes. Ici, nous partageons un protocole pour établir et maintenir les organoïdes des glandes lacrymales de souris et humaines à partir de biopsies de glandes lacrymales. En modifiant les conditions de culture, nous améliorons la fonctionnalité organoïde de la glande lacrymale. La fonctionnalité organoïde peut être sondée par un test « pleurant », qui consiste à exposer les organoïdes de la glande lacrymale à des neurotransmetteurs sélectionnés pour déclencher la libération de larmes dans leur lumière. Nous expliquons comment imager et quantifier ce phénomène. Pour étudier le rôle des gènes d’intérêt dans l’homéostasie des glandes lacrymales, ceux-ci peuvent être génétiquement modifiés. Nous décrivons en détail comment modifier génétiquement les organoïdes des glandes lacrymales à l’aide d’éditeurs de base, de la conception de l’ARN guide au génotypage des clones organoïdes. Enfin, nous montrons comment sonder le potentiel de régénération des organoïdes des glandes lacrymales humaines par implantation orthotopique chez la souris. Ensemble, cet ensemble complet d’outils fournit des ressources pour utiliser les organoïdes des glandes lacrymales de souris et humaines pour étudier la (physionomie) de la glande lacrymale.

Suite à la dissection de la glande lacrymale de la souris (Figure 2A), la digestion enzymatique et mécanique a généré de petits fragments tissulaires, parmi lesquels on a pu distinguer les acini et les canaux (Figure 2B). Les gros morceaux de tissu restants déstabiliseraient l’ECM, ce qui réduirait la croissance organoïde initiale. La dérivation organoïde de la glande lacrymale de souris a été réussie lorsque des organoïdes kystiques de ~500 μm de diamètre ont été trouvés après ~7 jours, stade auquel les organoïdes étaient prêts à être divisés (Figure 2C). Même si la dérivation organoïde globale est réussie, certains organoïdes peuvent commencer à croître avant de s’arrêter éventuellement. Les organoïdes des glandes lacrymales humaines se sont développés sous forme de kystes en 3-4 jours et ont atteint leur taille adulte en 10-14 jours après l’isolement tissulaire (Figure 2D). Pour les souris et les humains, la dérivation organoïde a parfois échoué, avec peu ou pas d’organoïdes en croissance; Cela était généralement causé par une sur-digestion des tissus. Les organoïdes des glandes lacrymales de souris pouvaient être passés au moins 40x et les organoïdes humains au moins 20x. Le passage a été effectué tous les 7 à 10 jours en moyenne, en fonction de la croissance organoïde.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65040/65040fig02.jpg"> Figure 2 : Etablissement des organoïdes des glandes lacrymales de souris et humains. (A) Photographies des différentes étapes de la dissection des glandes lacrymales de la souris. La flèche pointe vers la glande lacrymale sous sa membrane protectrice. (B) Images en fond clair de cellules de glandes lacrymales de souris juste après la digestion des tissus, avec des encarts montrant un acinus et un canal. (C) Images en fond clair d’une dérivation organoïde réussie et infructueuse de glande lacrymale de souris. (D) Images en fond clair de la croissance organoïde humaine sur une période de 14 jours. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65040/65040fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Les organoïdes des glandes lacrymales contiennent une grande proportion de cellules souches lorsqu’ils sont cultivés dans le milieu d’expansion. Pour augmenter leur niveau de différenciation, nous avons mis en place une souris et un milieu de différenciation humain à teneur réduite en facteurs de croissance. Après 5 jours et 7 jours, respectivement, dans le milieu de différenciation, les organoïdes de la souris et de la glande lacrymale humaine sont devenus plus denses (Figure 3A-B). Ce changement morphologique était corrélé à une augmentation des propriétés fonctionnelles. L’application de la forskoline, un activateur cyclique de l’AMP, ou du neurotransmetteur noradrénaline, a entraîné un gonflement organoïde (c.-à-d. sécrétion d’eau apicale) en moins de 3 heures (figure 3C). Lorsque le gonflement a pris plus de 3-4 heures, cela a suggéré que les organoïdes n’étaient pas assez différenciés et / ou n’exprimaient pas de marqueurs fonctionnels, tels que les récepteurs des neurotransmetteurs.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65040/65040fig03.jpg"> Figure 3 : Différenciation des organoïdes des glandes lacrymales de souris et humains et dosage du gonflement fonctionnel dans les organoïdes humains. (A) Images en fond clair d’organoïdes de glandes lacrymales de souris cultivés en milieu d’expansion pendant 7 jours et en milieu de différenciation pendant 5 jours après 2 jours en milieu d’expansion. (B) Images en fond clair d’organoïdes humains de glandes lacrymales cultivés en milieu d’expansion pendant 11 jours et en milieu de différenciation pendant 9 jours après 2 jours en milieu d’expansion. (C) Images en fond clair d’organoïdes humains différenciés de glandes lacrymales exposés à un milieu de différenciation frais (témoin), à 1 μM de forskoline et à 100 μM de noradrénaline pendant 3 h. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65040/65040fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Pour éliminer Pax6 dans les organoïdes des glandes lacrymales de souris, un plasmide contenant l’ARNg ciblant Pax6 choisi a été généré par PCR et ligature (Figure 4A). Ce plasmide contenant de l’ARNg a été électroporé avec les plasmides Piggy-Bac (plasmides contenant des transposons résistants à l’hygromycine et contenant des transposases) et l’éditeur de base C > T Cas9 dans les organoïdes des glandes lacrymales de souris dissociés en cellules individuelles. Après 3 jours, lorsque les organoïdes se sont rétablis, ils ont été exposés à l’hygromycine pour sélectionner des clones qui avaient incorporé la cassette de résistance à l’hygromycine. Dans les électroporations réussies, des organoïdes résistants à l’hygromycine se sont développés (Figure 4B). Les clones organoïdes en croissance qui étaient plus grands que ~300 μm ont été choisis, idéalement avant qu’ils ne commencent à se différencier spontanément (Figure 4C). L’ADN a été extrait d’une partie de l’organoïde tout en gardant le reste en culture. L’amplification par PCR du locus Pax6 ciblé par l’ARNg a donné une bande de 367 pb pour chacun des clones choisis (Figure 4D). Après séquençage du locus amplifié, les clones qui étaient homozygotement édités en C > T (n = 1) ont été conservés. D’autre part, les clones qui n’ont pas été édités (n = 4), édités de manière hétérozygone ou mal édités (n = 1) ont été éliminés (Figure 4E). Dans l’ensemble, en utilisant cet ARNg ciblant Pax6, un clone homozygote de glande lacrymale de souris knock-out sur six séquencés a été obtenu. Certains clones ont bien poussé, mais certains clones organoïdes ont été perdus après la cueillette ou ont commencé à se différencier (Figure 4F). Sur les 10 clones organoïdes choisis, 7 ont bien poussé.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65040/65040fig04.jpg"> Figure 4 : Knock-out de Pax6 médié par l’édition de base dans les organoïdes des glandes lacrymales de souris. (A) Séquençage de Sanger de la trace de pFYF1320 après intégration correcte de l’ARNg ciblant le locus Pax6. (B) Images en fond clair d’organoïdes de glandes lacrymales de souris 5 jours après l’exposition à l’hygromycine après électroporation. Les organoïdes ont été cultivés dans un milieu d’expansion de souris. À gauche, un exemple d’électroporation ratée, sans clone résistant à l’hygromycine. À droite se trouve un exemple d’électroporation réussie, avec plusieurs clones organoïdes résistants à l’hygromycine survivants. (C) Images en fond clair des clones qui devraient être choisis et des clones qui ne devraient pas être choisis. (D) Gel d’agarose montrant l’amplification du locus Pax6 ciblé avec l’ARNg. En vert, la bande de la taille attendue de 367 pb est mise en évidence. E) Trace de séquençage de Sanger de trois clones organoïdes résistants à l’hygromycine. Le clone supérieur n’a pas été modifié. Le clone du milieu est une édition homozygote C > T et, par conséquent, un knock-out homozygote. Le clone inférieur présente deux mutations ponctuelles hétérozygotes et est soit un knock-out hétérozygote, soit un clone mixte et a été mal édité. (F) Images en fond clair des clones organoïdes choisis avec différents niveaux d’excroissance. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65040/65040fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Enfin, pour effectuer une transplantation orthotopique organoïde de glande lacrymale humaine chez la souris, des organoïdes divisés 3 jours à l’avance (< 100 μm de diamètre) ont été utilisés. La greffe d’organoïdes a été confirmée 1 mois après l’injection des organoïdes dans la glande lacrymale de la souris par coloration pour un marqueur spécifique à l’homme, l’antigène nucléolaire humain (Figure 5). L’absence de coloration ponctuée de toutes les sections de la glande lacrymale de la souris signifiait un manque de greffe organoïde humaine.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65040/65040fig05.jpg"> Figure 5 : Transplantation d’organoïdes des glandes lacrymales humaines dans la glande lacrymale de la souris. Coloration des glandes lacrymales de souris transplantées pour le marqueur nucléolaire humain afin de surveiller la greffe 1 mois après la transplantation. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65040/65040fig05large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Tableau supplémentaire 1 : Composition des milieux et des tampons. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65040/Supplementary%20Table%201.xlsx" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.</a>

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Establishment, Maintenance, Differentiation, Genetic Manipulation, and Transplantation of Mouse and Human Lacrimal Gland Organoids

Ce protocole décrit comment établir, maintenir, modifier génétiquement, différencier, caractériser fonctionnellement et transplanter des organoïdes des glandes lacrymales dérivés de tissus primaires de souris et humains.

Établissement, entretien, différenciation, manipulation génétique et transplantation d’organoïdes lacrymaux et humains

The lacrimal gland is an essential organ for ocular surface homeostasis. By producing the aqueous part of the tear film, it protects the eye from ...

Avec les organoïdes des glandes lacrymales, on peut examiner comment certains gènes contrôlent l’homéostasie des glandes lacrymales. De plus, les organoïdes peuvent être utilisés pour la médecine régénérative. Le principal avantage de la technologie organoïde des glandes lacrymales dérivées de cellules souches adultes est qu’elle permet la croissance et l’étude de cellules épithéliales saines et non transformées de glandes lacrymales.Ces organoïdes pourraient éventuellement être utilisés pour traiter les patients atteints de sécheresse oculaire. Commencez par préparer le milieu et le matériel requis pour l’expérience, puis combinez tous les composants du milieu de digestion avant l’expérience. Pré-mouiller les scalpels dans ce milieu pour éviter que des morceaux de tissu ne s’y collent.Récupérez le tissu lacrymal de la souris dans le milieu, placez-le dans la boîte de Petri et hachez-le à l’aide de scalpels pré-mouillés. Une fois que les morceaux de tissu sont inférieurs à 0,5 millimètre cube, grattez-les de la boîte de Petri avec le scalpel et transférez-les dans un tube de 15 millilitres contenant le milieu de digestion. Pour une très petite biopsie humaine, placez-la directement dans le milieu digestif sans hacher.Incuber le tube de 15 millilitres contenant des morceaux de tissu jusqu’à 15 minutes dans un bain-marie de 37 degrés Celsius. Pendant ce temps, réduisez l’embout d’une pipette Pasteur dans une flamme et pré-mouillez-la dans le milieu de base. Pour faciliter le processus de dissociation, pipeter le mélange haché de haut en bas toutes les cinq minutes avec la pipette Pasteur pré-mouillée et rétrécie.Lorsque de nombreuses cellules individuelles et de petits amas sont visibles au microscope, arrêtez la dissociation en ajoutant 10 millilitres du milieu de base. Après avoir tourné à 400 g pendant cinq minutes, retirez le surnageant et remettez le granulé en suspension dans 10 millilitres du milieu de base pour répéter le lavage et le granulé dans les cellules. Retirez les gros morceaux de tissu non digérés et les fibres de collagène restantes en filtrant le mélange haché à travers une passoire de 70 micromètres.Faire tourner l’éluat à 400g pendant cinq minutes. Après avoir retiré le surnageant, remettre en suspension la pastille cellulaire dans 100 microlitres de matrice extracellulaire froide, ou ECM, pour une seule glande lacrymale de souris et 50 microlitres d’ECM froide pour une biopsie humaine, sans créer les bulles. Ensemencer jusqu’à 100 microlitres de cellules par puits d’une plaque de suspension de 12 puits à l’aide d’un P200 pour fabriquer des gouttelettes d’environ 20 microlitres dans le puits.Placez la plaque à l’envers dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius pendant 20 à 30 minutes pour permettre la solidification de l’ECM. Une fois l’ECM solidifié, ajoutez environ un millilitre de milieu d’expansion souris à température ambiante par puits d’une plaque de 12 puits. Préparez fraîchement un millilitre de milieu de différenciation humain contenant des composants individuels qui induisent la sécrétion par les organoïdes de la glande lacrymale.À l’aide d’un microscope accéléré à fond clair automatisé, définissez les positions à imager dans la plaque, l’intervalle de temps de cinq minutes et la durée de quatre heures. Assurez-vous qu’une gouttelette ECM entière est visible à chaque position. Avant de commencer à imager, retirez le milieu de culture des puits à imager sans déplacer la plaque du microscope et remplacez-le par le milieu de différenciation humain fraîchement préparé et bien remis en suspension contenant des composés, y compris la forskoline et la noradrénaline.Comme témoin négatif, inclure un puits avec un milieu de différenciation rafraîchi. Cliquez sur le bouton Exécuter du microscope et analysez les résultats après quatre heures. Après avoir dissocié les organoïdes comme mentionné dans le texte, jeter le surnageant.Remettez les cellules en suspension dans 80 microlitres du tampon d’électroporation. Dans un tube de 1,5 millilitre, préparez les plasmides nécessaires à l’expérience. Ajouter les plasmides aux cellules, et bien mélanger en pipetant de haut en bas.Configurez l’électroporateur avec les paramètres d’impulsion de pores et d’impulsion de transfert. Placer les cellules avec les plasmides dans une cuvette d’électroporation. Mesurez immédiatement la résistance, qui doit être comprise entre 0,3 ampère et 0,55 ampère, et électroportez immédiatement.Une fois cela fait, transférez les cellules dans un tube de 1,5 millilitre et ajoutez 400 microlitres de tampon d’électroporation complété par un inhibiteur de la rho-kinase. Laissez les cellules récupérer à température ambiante pendant 30 minutes. Ensuite, pelletez les cellules à 500g pendant cinq minutes.Après avoir jeté le surnageant, plaquez les cellules dans 200 microlitres d’ECM. Après solidification, ajouter le milieu d’expansion de la souris. Pour la préparation organoïde, diviser les organoïdes de la glande lacrymale humaine environ trois jours avant le jour de la transplantation.Pour extraire les organoïdes de l’ECM, ajoutez de la dispase au milieu de culture pour atteindre une concentration finale de 0,125 unité par millilitre, et remettez soigneusement en suspension les gouttelettes ECM pour les perturber à l’aide d’un P1000. Replacez l’assiette dans l’incubateur à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Remettez les organoïdes en suspension dans 10 millilitres de milieu basique pour éliminer l’enzyme.Après avoir granulé les cellules à 400g pendant cinq minutes, les remettre en suspension dans 50 microlitres de milieu d’expansion humain froid complété par 5% ECM. Placez la suspension organoïde sur de la glace et procédez immédiatement à la transplantation. Pour la transplantation orthotopique chez la souris, aspirer la suspension organoïde dans une aiguille à insuline.Lorsque la souris est endormie, placez-la rapidement sur le côté avec la glande lacrymale principale accessible. Injectez cinq microlitres de la suspension organoïde directement à travers la peau dans la glande lacrymale. Laissez la souris récupérer et évaluez quotidiennement la présence de tout inconfort lié à la transplantation, en particulier dans l’œil.Suite à la dissection de la glande lacrymale de la souris, la digestion enzymatique et mécanique a généré de petits fragments de tissus, y compris les acini et les canaux. Dans la dérivation réussie des organoïdes de la glande lacrymale de souris, des organoïdes kystiques d’environ 500 micromètres de diamètre ont été trouvés après sept jours. Les organoïdes des glandes lacrymales humaines se sont développés sous forme de kystes en trois à quatre jours et ont atteint une taille adulte en 10 à 14 jours après l’isolement tissulaire.Après cinq jours et sept jours, respectivement, dans le milieu de différenciation, les organoïdes de la glande lacrymale humaine et de la souris sont devenus plus denses. L’application de l’activateur cyclique de l’AMP forskoline ou du neurotransmetteur noradrénaline a entraîné un gonflement organoïde en moins de trois heures. Lors d’une électroporation réussie, des organoïdes résistants à l’hygromycine se sont développés.Les clones organoïdes en croissance de plus de 300 micromètres ont été choisis avant leur différenciation. L’amplification par PCR du locus Pax6 ciblé par l’ARN guide a donné une bande de paires de bases 367 pour tous les clones sélectionnés. Un clone homozygote de glande lacrymale de souris knock-out sur six séquencés a été obtenu en utilisant l’ARN guide ciblant Pax6.Certains clones ont bien poussé, mais certains clones organoïdes ont été perdus après la cueillette ou ont commencé à se différencier. Sur les 10 clones organoïdes choisis, sept ont bien poussé. La greffe d’organoïdes a été confirmée un mois après l’injection des organoïdes dans la glande lacrymale de la souris par coloration pour un marqueur spécifique à l’homme, l’antigène nucléolaire humain.Une chose à laquelle il faut faire attention est de ne pas trop digérer les tissus, ni les organoïdes. Sinon, les cellules pourraient mourir, ce qui réduirait le taux d’établissement organoïde. Les organoïdes des glandes lacrymales peuvent être analysés par histologie.Ce faisant, on peut avoir un aperçu de leur composition cellulaire.

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Establishment and Genetic Manipulation of Murine Hepatocyte Organoids

Établissement et manipulation génétique d’organoïdes d’hépatocytes murins

The liver is the largest organ in mammals. It plays an important role in glucose storage, protein secretion, metabolism and detoxification. As the ...

Three-Dimensional, Serum-Free Culture System for Lacrimal Gland Stem Cells

Système de culture tridimensionnel sans sérum pour cellules souches de la glande lacrymale

Lacrimal gland (LG) stem cell-based therapy is a promising strategy for lacrimal gland diseases. However, the lack of a reliable, serum-free culture ...