Name: establishment, maintenance, differentiation, genetic manipulation, and transplantation of mouse and human lacrimal gland organoids
Uploaded: 2023-02-03T14:15:00
Duration: 10 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Establishment, Maintenance, Differentiation, Genetic Manipulation, and Transplantation of Mouse and Human Lacrimal Gland Organoids at JoVE.com

אנו מודים ליוריק פוסט על הפיתוח הראשוני של הפרוטוקול. עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי פרס של האתגר הגדול של חקר הסרטן בבריטניה (C6307/A29058) וקרן מארק לחקר הסרטן לצוות SPECIFICANCER.

<ol>
	<li>Garg, A., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lacrimal+gland+development:+From+signaling+interactions+to+regenerative+medicine.">Lacrimal gland development: From signaling interactions to regenerative medicine.</a> Developmental Dynamics. 246 (12), 970-980 (2017).</li><li>Selinger, D. S., Selinger, R. C., Reed, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resistance+to+infection+of+the+external+eye:+The+role+of+tears.">Resistance to infection of the external eye: The role of tears.</a> Survey of Ophthalmology. 24 (1), 33-38 (1979).</li><li>Messmer, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathophysiology,+diagnosis,+and+treatment+of+dry+eye+disease.">The pathophysiology, diagnosis, and treatment of dry eye disease.</a> Deutsches Arzteblatt International. 112 (5), 71-81 (2015).</li><li>Massie, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+lacrimal+gland+spheroids+for+lacrimal+gland+tissue+regeneration.">Development of lacrimal gland spheroids for lacrimal gland tissue regeneration.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (4), 2001-2009 (2018).</li><li>Tiwari, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+human+lacrimal+gland+cultures+with+secretory+function.">Establishing human lacrimal gland cultures with secretory function.</a> PloS One. 7 (1), 29458 (2012).</li><li>Nguyen, D. H., Beuerman, R. W., Halbert, C. L., Ma, Q., Sun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+immortalized+rabbit+lacrimal+gland+epithelial+cells.">Characterization of immortalized rabbit lacrimal gland epithelial cells.</a> In Vitro Cellular &amp; Developmental Biology. Animal. 35 (4), 198-204 (1999).</li><li>Bannier-H&#233;laou&#235;t, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+human+lacrimal+gland+using+organoids+and+single-cell+sequencing.">Exploring the human lacrimal gland using organoids and single-cell sequencing.</a> Cell Stem Cell. 28 (7), 1221-1232 (2021).</li><li>Hayashi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+3D+lacrimal+gland+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells.">Generation of 3D lacrimal gland organoids from human pluripotent stem cells.</a> Nature. 605 (7908), 126-131 (2022).</li><li>Jeong, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+functional+epithelial+organoids+from+human+lacrimal+glands.">Establishment of functional epithelial organoids from human lacrimal glands.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 12 (1), 247 (2021).</li><li>Hofer, M., Lutolf, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+organoids.">Engineering organoids.</a> Nature Reviews Materials. 6 (5), 402-420 (2021).</li><li>Meyenberg, M., Ferreira da Silva, J., Loizou, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+specific+DNA+repair+outcomes+shape+the+landscape+of+genome+editing.">Tissue specific DNA repair outcomes shape the landscape of genome editing.</a> Frontiers in Genetics. 12, 728520 (2021).</li><li>Geurts, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-based+adenine+editors+correct+nonsense+mutations+in+a+cystic+fibrosis+organoid+biobank.">CRISPR-based adenine editors correct nonsense mutations in a cystic fibrosis organoid biobank.</a> Cell Stem Cell. 26 (4), 503-510 (2020).</li><li>Overmyer, K. A., Thonusin, C., Qi, N. R., Burant, C. F., Evans, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+anesthesia+and+euthanasia+on+metabolomics+of+mammalian+tissues:+Studies+in+a+C57BL/6J+mouse+model.">Impact of anesthesia and euthanasia on metabolomics of mammalian tissues: Studies in a C57BL/6J mouse model.</a> PLoS One. 10 (2), 0117232 (2015).</li><li>Driehuis, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+mucosal+organoids+as+a+potential+platform+for+personalized+cancer+therapy.">Oral mucosal organoids as a potential platform for personalized cancer therapy.</a> Cancer Discovery. 9 (7), 852-871 (2019).</li><li>Froger, A., Hall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+plasmid+DNA+into+E.+coli+using+the+heat+shock+method.">Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method.</a> Journal of Visualized Experiments. (6), e253 (2007).</li><li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li><li>Lian, J., Meng, X., Zhang, X., Hu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+genetic+manipulation+of+murine+hepatocyte+organoids.">Establishment and genetic manipulation of murine hepatocyte organoids.</a> Journal of Visualized Experiments. (180), e62438 (2022).</li><li>L&#245;hmussaar, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+organoids+model+cervical+tissue+dynamics+and+viral+oncogenesis+in+cervical+cancer.">Patient-derived organoids model cervical tissue dynamics and viral oncogenesis in cervical cancer.</a> Cell Stem Cell. 28 (8), 1380-1396 (2021).</li><li>Bloh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deconvolution+of+complex+DNA+repair+(DECODR):+Establishing+a+novel+deconvolution+algorithm+for+comprehensive+analysis+of+CRISPR-edited+Sanger+sequencing+data.">Deconvolution of complex DNA repair (DECODR): Establishing a novel deconvolution algorithm for comprehensive analysis of CRISPR-edited Sanger sequencing data.</a> The CRISPR Journal. 4 (1), 120-131 (2021).</li><li>Latta, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiology+of+aniridia-associated+keratopathy:+Developmental+aspects+and+unanswered+questions.">Pathophysiology of aniridia-associated keratopathy: Developmental aspects and unanswered questions.</a> The Ocular Surface. 22, 245-266 (2021).</li><li>Veernala, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lacrimal+gland+regeneration:+The+unmet+challenges+and+promise+for+dry+eye+therapy.">Lacrimal gland regeneration: The unmet challenges and promise for dry eye therapy.</a> The Ocular Surface. 25, 129-141 (2022).</li><li>Hayashi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+3D+lacrimal+gland+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells.">Generation of 3D lacrimal gland organoids from human pluripotent stem cells.</a> Nature. 605 (7908), 126-131 (2022).</li></ol>

הנס קלברס הוא ראש מחקר פארמה ופיתוח מוקדם ברוש, בזל, ומחזיק במספר פטנטים הקשורים לטכנולוגיית אורגנואידים.

פרוטוקול זה מתאר את ההקמה והשימוש באורגנואידים של בלוטת הדמעות לבדיקות תפקודיות, מידול מוטציות והשתלות. בעת הקמת אורגנואידים של עכבר ובלוטת הדמעות האנושית, דיסוציאציה של רקמות היא קריטית. אם הרקמה אינה מתעכלת מספיק, תפוקת האורגנואידים תהיה נמוכה. אם הרקמה מתעכלת יתר על המידה, התאים ימותו ולא יגדלו כאורגנואידים. כל רקמה צריכה להיות מעוכלת עם אנזים מסוים לזמן מסוים כדי להבטיח צמיחה אופטימלית של אורגנואידים14,17,18. בלוטת הדמעות היא רקמה רכה למדי שעיכול collagenase של 5-10 דקות בשילוב עם דיסוציאציה מכנית מבוססת פיפטינג מספיק כדי לבודד חתיכות קטנות של רקמה. אם יש צורך להשיג תאים בודדים עבור יישומים כגון ריצוף RNA של תא בודד, הדיסוציאציה יכולה להתבצע למשך זמן רב יותר עד שמגיעים לשלב התא הבודד, אך יש להפסיק את הדיסוציאציה ברגע שמתקבלים תאים בודדים כדי להגביל כל ירידה בכדאיות. מכיוון שדסוציאציה של רקמות היא כה חיונית, עיכול יתר הוא הסיבה הסבירה ביותר לכישלון של הקמת אורגנואידים של בלוטת הדמעות.
תחזוקה מתאימה של אורגנואידים בלוטת הדמעות חשוב לשימוש בהם. תחזוקה לטווח ארוך היא סימן ההיכר של אורגנואידים של בלוטת הדמעות שמקורם בתאי גזע בוגרים, בהשוואה לאורגנואידים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים 7,17. כדי להשיג תחזוקה לטווח ארוך, יש לבצע פיצול אורגנואידים קבוע ושינויים בינוניים. ללא זאת, אורגנואידים מתחילים להתמיין ולפתח פוטנציאל תאי גזע מופחת, מה שפוגע בתחזוקתם לטווח ארוך7. בשלב זה שוב, עיכול יתר עלול להרוג את תאי הגזע ולפגוע בתחזוקת האורגנואידים. לתחזוקה שוטפת, אין צורך בדיסוציאציה אורגנואידית לתאים בודדים. עם זאת, כדי ליצור קווי אורגנואיד נוק-אאוט משובטים, חיוני להתחיל עם תאים בודדים. אם לא, האורגנואידים יהיו מורכבים מפסיפס של תאים בעלי רקע גנטי שונה, מה שהופך את ניתוח ההשפעה של מוטציה אחת מוגדרת לבלתי אפשרית. כאן, אנו מתארים את השימוש בעורך בסיס C > T כדי ליצור קודוני עצירה. עורך גנום זה מסתמך על נוכחות קודונים של ארגינין, גלוטמין או טריפטופן בטווח של 12-18 בסיסים מ-NGG PAM. כאשר תנאים אלה אינם מתקיימים בתכנון gRNA,ניתן להשתמש בעורכי בסיס Cas9 או C >T קונבנציונליים עם PAMs חלופיים 7,18. עם זאת, Cas9 קונבנציונאלי מציג הפסקות דו-גדיליות הגורמות לאינדלים עם תיקון11. מכיוון ששני האללים עשויים להכיל אינדל שונה, גנוטיפ שיבוט דורש זהירות נוספת. יש לבצע דה-קונבולוציה של השינויים שהוכנסו כדי להבטיח ששני האללים יכילו אינדלים מחוץ למסגרת, ומכאן, ששיבוטי האורגנואידים ייעלמו עבור הגן הממוקד19. היתרון של עורכי בסיס C > T טמון בעובדה שניתן להשתמש בהם כדי למדל מוטציות נקודתיות שאינן בהכרח גורמות לקודוני עצירה. לדוגמה, ניתן להשתמש בהם כדי למדל מוטציות Pax6 ספציפיות שנמצאו בחולים עם אנירידיה כדי לחקור את השפעתן על הפיזיולוגיה של בלוטת הדמעות20.
בלוטת הדמעות מפרישה את החלק המימי של סרט הדמעות1. הפרשת דמעות יכולה להיות reapitulated באורגנואידים אנושיים לאחר התמיינות בתיווך נסיגה גורם גדילה עיכוב NOTCH. בתנאים אלה, אורגנואידים עוברים התמיינות סופנית ולא ניתן להמשיך ולתחזק אותם. עם זאת, אורגנואידים מובחנים של בלוטת הדמעות יכולים להנחות את הפיתוח של תרופות הגורמות לקריעה בהקשר של מחלת העין היבשה, באופן פוטנציאלי במסכים בעלי תפוקה גבוהה. בדיקת הקריעה המוצגת בפרוטוקול זה היא זו שנותנת כרגע את השינוי הגדול ביותר בגודל האורגנואידים בזמן קצר, מה שמקל על הכימות בהקשר של מסך סמים 7,9,17.
טיפול בתאי גזע טומן בחובו הבטחה גדולה להתחדשות בלוטת הדמעות במחלת העין היבשה21. אורגנואידים של בלוטת הדמעות שמקורם בתאי גזע בוגרים יכולים להיות חומר מקור ליישומים כאלה. הפרוטוקול המוצג כאן גורם לקליטת אורגנואידים של בלוטת הדמעות האנושית, בעיקר כציסטות. קליטת אורגנואידים נמוכה יכולה להיווצר עקב הזרקת אורגנואידים לאתר הלא נכון. אימון הליך ההזרקה עם צבע מאפשר מעקב אחר אתר ההזרקה, ובסופו של דבר, משפר את דיוק ההזרקה. לחלופין, ניתן לחרוט את האפידרמיס של העכבר כך שתהיה לו גישה ישירה לבלוטת הדמעות, כפי שנעשה בחולדות לפניגיל 22. שיטה זו אורכת זמן רב יותר אך עשויה להיות מדויקת יותר. מצד שני, בפרוטוקול הנוכחי, האורגנואידים לא השתלבו באופן פונקציונלי בבלוטת הדמעות של העכבר. תוצאות דומות נצפו עבור השתלת בלוטת הדמעות שמקורה ב- iPSC22. ניתן לשפר עוד יותר את שיטת ההשתלה על ידי פציעה מראש של בלוטת הדמעות, שימוש במודל עכבר עין יבשה, ו / או הזרקת האורגנואידים כתאים בודדים או גושים קטנים. עם זאת, אורגנואידים של בלוטת הדמעות שמקורם בתאי גזע בוגרים וערכת הכלים הקשורה אליהם יכולים להיות הבסיס ליישומים עתידיים במחקר בלוטת הדמעות וברפואה רגנרטיבית.

בלוטת הדמעות היא אפיתל הבלוטות האחראי לייצור רוב השכבה המימית של סרט הדמעות1. השכבה המימית של סרט הדמעות מכילה לא רק מים כדי לשמן את פני השטח של העין, אלא גם רפרטואר גדול של רכיבים מיקרוביאליים המגנים על פני השטח של העין מפני זיהומים2. כאשר בלוטת הדמעות ניזוקה או דלקתית, מתרחשת מחלת עין יבשה, אשר גורמת לאי נוחות לחולים ויכולה בסופו של דבר להוביל לאובדן ראייה3. במהלך השנים, מערכות מודל לחקר בלוטת הדמעות, במיוחד בלוטת האדם, היו מוגבלות 4,5,6. זה תרם לפער ידע לגבי תפקוד בלוטת הדמעות בתנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים.
לאחרונה, מודלים במבחנה פותחו כדי לחקור את בלוטת הדמעות בצלחת 7,8,9. אורגנואידים אלה של בלוטת הדמעות נגזרים מתאי גזע בוגרים הגדלים כמבנים תלת-ממדיים במטריצה חוץ-תאית בתוספת קוקטייל של גורמי גדילה המקיימים את יכולות ההתחדשות שלהם במבחנה7. היתרון של אורגנואידים שמקורם בתאי גזע בוגרים (ASC) הוא שניתן לשמור עליהם במשך זמן רב מאוד תוך שחזור תכונות רקמות בריאות. סוג זה של אורגנואיד מורכב אך ורק מתאי אפיתל, בניגוד לאורגנואידים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSC), אשר עשויים להכיל גם תאי סטרומה, למשל. שלא כמו אורגנואידים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים (PSC), אורגנואידים של ASC נוצרים ישירות מרקמה בוגרת ואינם דורשים שינויים גנטיים כלשהם כדי להיות מורחבים. אורגנואידים ASC מבטאים מאפיינים בוגרים10.
פרוטוקול זה מכיל ארגז כלים להפקת אורגנואידים של בלוטת הדמעות מרקמה ראשונית של עכבר ואדם. הפרוטוקול מתאר כיצד לשפר עוד יותר את הפונקציונליות של האורגנואידים על ידי נסיגה פשוטה של גורם גדילה וכיצד לעורר את האורגנואידים להפריש נוזל דמעות על ידי ביצוע בדיקת נפיחות. פרוטוקול זה כולל בנוסף שיטת טרנספקציה מבוססת אלקטרופורציה להנדסה גנטית של אורגנואידים עכבריים באמצעות עורכי בסיס הנגזרים מקריספר. שלא כמו Cas9 קונבנציונאלי, השימוש בעורכי בסיסים מאפשר שינוי של בסיסים בודדים בגנום מבלי ליצור שבר דו-גדילי11,12. לבסוף, מתוארת השתלה אורתוטופית של אורגנואידים של בלוטת הדמעות האנושית בעכברים מדוכאי חיסון וההערכה ההיסטולוגית שלאחר מכן של ההשתלה. ערכת כלים זו לאורגנואיד בלוטת הדמעות יכולה לשמש במחקר על התחדשות ותפקוד בלוטת הדמעות ולמידול מחלות גנטיות ודלקתיות.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL safe-lock centrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>EP0030 120.094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,3&#8242;-Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrate (DAB)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5637</td>
			<td>CAS: 868272-85-9 , CAUTION, 6 g/L solution can be stored aliquotted at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5x green GoTaq Flexi buffer</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M891A</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A83-01</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2939</td>
			<td>Store at -20 &#176;C, stock at 30 mM, 10000x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12634-010</td>
			<td>store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar plates containing Ampicillin</td>
			<td>Hubrecht Institute</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave VAPOUR-Line lite</td>
			<td>VWR chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>Store at -20 &#176;C, 50x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Micro-Fine insulin needle 1 mL</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>324825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop microscope DMI1</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumine (BSA)</td>
			<td>MP biomedicals</td>
			<td>160069</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BTXpress</td>
			<td>BTX</td>
			<td>MDS450805</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 mice</td>
			<td>Hubrecht Institute</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cassettes</td>
			<td>Klinipath</td>
			<td>410-02S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellBanker 1</td>
			<td>amsbio</td>
			<td>11910</td>
			<td>Cryopreservation medium, adhere to instructions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid monohydrate</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>0088</td>
			<td>CAS: 5949-29-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase I</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C9407</td>
			<td>Aliquots at 20 mg/mL, 20x, store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes 15 mL</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>5618-8271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes 50 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS430828-500EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips 24 mm x 50 mm</td>
			<td>Menzel-Gl&#228;zer</td>
			<td>BB024050S1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex Basement Membrane Extract (BME), Growth Factor Reduced, Type 2 - extracellular matrix</td>
			<td>R&#38;D Systems, Bio-Techne</td>
			<td>3533-001-02</td>
			<td>Store at -20 &#176;C, keep at 4 &#176;C for up to 1 month</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPT</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D5942</td>
			<td>Store at -20 &#176;C, stock at 10 mM, 1000x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium hydrogen phosphate anhydrous</td>
			<td>VWR chemicals</td>
			<td>28026.292</td>
			<td>CAS: 7558-79-4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Di-sodiumhydrogenphosphate dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71643</td>
			<td>CAS:10028-24-7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>17105-041</td>
			<td>Aliquots at 50 U/mL, store at -20 &#176;C until use, 400x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Scalpel Sterile N&#176; 10</td>
			<td>Swann Morton</td>
			<td>3033838</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DM4000 microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTPs 25 mM</td>
			<td>Promega</td>
			<td>U1420</td>
			<td>Mix all 4 nucleotides together, Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dpn1</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate-bufferd Saline (DPBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190144</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Easy strainers 70 &#181;m</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>542170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation cuvette</td>
			<td>Nepagene</td>
			<td>EC002S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EnVision+/HRP mouse</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>K400111-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 100%</td>
			<td>BOOM</td>
			<td>84045206;5000</td>
			<td>CAUTION, Use to prepare other Ethanol dilutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 70%</td>
			<td>BOOM</td>
			<td>84010059.5000</td>
			<td>CAUTION</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 96%</td>
			<td>BOOM</td>
			<td>84050065.5000</td>
			<td>CAUTION</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS FL Auto 2 Cell Imaging System</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Live-imaging brightfield microscrope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF10</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-26</td>
			<td>Store at -20 &#176;C, stock at 100 mg/mL in base medium, 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td>NIH, Fiji developers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution 4%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1.00496</td>
			<td>CAS: 50-00-0, CAUTION</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1099</td>
			<td>Store at -20 &#176;C, stock at 10 mM, 10000x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GoTaq G2 Flexi DNA Polymerase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M7805</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Haematoxylin</td>
			<td>VWR chemicals</td>
			<td>10047105</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td>Store at 4 &#176;C, 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histocore H and C, Tissue embedding machine</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate</td>
			<td>Meidax</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human nucleolar antigen antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab-190710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid 5 N</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10605882</td>
			<td>CAS: 7647-01-0, CAUTION</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxyde 30%</td>
			<td>Chem-lab</td>
			<td>CL00.2308.1000</td>
			<td>CAS: 7722-84-1, CAUTION</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygromycin B-gold</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ant-hg</td>
			<td>Stock at 100 mg/&#181;L, 1000x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygromycin resistance cassette-containing plasmid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Andersson-Rolf et al, Nature Methods, 2017. doi: 10.1038/nmeth.4156</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IsoFlo 100%</td>
			<td>Mecan</td>
			<td>5960501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB medium</td>
			<td>Hubrecht Institute</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 25 mM</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A351H</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome RM2235</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Midiprep DNA isolation kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>K210005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniprep DNA isolation kit</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>K210003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetylcysteine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9165</td>
			<td>Store at -20 &#176;C, stock at 500 mM, 400x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEPA21 electroporator</td>
			<td>Nepagene</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>N0636</td>
			<td>Store at -20 &#176;C, stock at 1M, 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOD Scid Gamma (NSG) mice</td>
			<td>Hubrecht Institute colony</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noggin conditioned medium</td>
			<td>U-Protein Express</td>
			<td>Custom order</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noradrenaline</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A7257</td>
			<td>Store at -20 &#176;C, stock at 100 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Memmert</td>
			<td></td>
			<td>Set at 58 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P20, P200 and P1000 pipettes</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin</td>
			<td>VWR chemicals</td>
			<td>10048502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipettes, glass plugged</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>1150-6973</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pax6_C&#62;T_F: AGACTGTTCCAGGATGGCTG&#160;</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pax6_C&#62;T_R: TCTCCTAGGTACTGGAAGCC&#160;</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCMV_ABEmax_P2A_GFP</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>112101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pertex</td>
			<td>Klinipath</td>
			<td>AM-08010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pFYF1320&#160;</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>47511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ant-pm-1</td>
			<td>1000X, store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prostaglandin E2 (PGE2)</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2296</td>
			<td>Store at -20 &#176;C, stock at 10 mM, 10000x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish, 10 cm</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>633102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B9027S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 high-fidelity DNA polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0491S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuickExtract DNA Extraction Solution</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>QE09050</td>
			<td>Store aliquots at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-spondin 3 conditioned medium</td>
			<td>U-Protein Express</td>
			<td>Custom order</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sgRNA Reverse Primer: TCTGCGCCCATCTGTTGCTT CGGTGTTTCGTCCTTTCCACAAG</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides</td>
			<td>StarFrost</td>
			<td>MBB-0302-55A</td>
			<td>Adhesive, ground</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8.22335.1000</td>
			<td>CAS: 26628-22-8, CAUTION</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium cytrate dihydrate</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>0280</td>
			<td>CAS: 6132-04-3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Forward Primer: &#8220;/5phos/ GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG 
			TTAAAATAAGGC</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Subcloning efficiency competent cells DH5alpha</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18265-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suspension cell culture plates (24-well)</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>662102</td>
			<td>24-well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suspension cell culture plates (12-well)</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>665102</td>
			<td>12-well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAE buffer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>B49</td>
			<td>Stock at 50x, dilute to 1x with ultrapure water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transposase-containing plasmid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Andersson-Rolf et al, Nature Methods, 2017. doi: 10.1038/nmeth.4156</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express Enzyme</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12605-028</td>
			<td>store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U6_Forward primer: GGGCAGGAAGAGGGCCTAT</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Agarose 1000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Tulabo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Klinipath</td>
			<td>4055-9005</td>
			<td>CAS: 1330-20-7, CAUTION</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Abmole Bioscience</td>
			<td>Y-27632 dihydrochloride</td>
			<td>Store at -20 &#176;C, stock at 10 mM, 1000x</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishment, maintenance, differentiation, genetic manipulation, and transplantation of mouse and human lacrimal gland organoids

בלוטת הדמעות היא איבר חיוני להומאוסטזיס פני העין. על ידי ייצור החלק המימי של סרט הדמעות, הוא מגן על העין מפני לחץ התייבשות ועלבונות חיצוניים. מעט ידוע על פיזיולוגיה של בלוטת הדמעות (פתו) בגלל היעדר מודלים מתאימים במבחנה . טכנולוגיית אורגנואיד הוכיחה את עצמה כפלטפורמה ניסיונית שימושית עבור איברים מרובים. כאן, אנו חולקים פרוטוקול כדי לקבוע ולתחזק אורגנואידים של בלוטת הדמעות של עכברים ובני אדם החל מביופסיות של בלוטת הדמעות. על ידי שינוי תנאי התרבית, אנו משפרים את פונקציונליות האורגנואידים של בלוטת הדמעות. ניתן לחקור את הפונקציונליות של אורגנואידים באמצעות בדיקת "בכי", הכוללת חשיפת אורגנואידים של בלוטת הדמעות למוליכים עצביים נבחרים כדי לגרום לשחרור דמעות בלומן שלהם. אנו מסבירים כיצד לדמיין ולכמת את התופעה. כדי לחקור את תפקידם של גנים מעניינים בהומאוסטזיס של בלוטת הדמעות, אלה יכולים להיות מהונדסים גנטית. אנו מתארים ביסודיות כיצד לשנות גנטית אורגנואידים של בלוטת הדמעות באמצעות עורכי בסיס - החל מתכנון RNA מנחה ועד גנוטיפ שיבוט אורגנואידים. לבסוף, אנו מראים כיצד לחקור את פוטנציאל ההתחדשות של אורגנואידים של בלוטת הדמעות האנושית על ידי השתלה אורתוטופית בעכבר. יחד, ערכת כלים מקיפה זו מספקת משאבים לשימוש באורגנואידים של עכבר ובלוטת הדמעות האנושית כדי לחקור פיזיולוגיה של בלוטת הדמעות (פתו).

בעקבות הדיסקציה של בלוטת הדמעות של העכבר (איור 2A), העיכול האנזימטי והמכני יצר שברי רקמות קטנים, שביניהם ניתן היה להבחין בין האסיני לתעלות (איור 2B). חתיכות הרקמה הגדולות הנותרות יערערו את יציבות ה- ECM, מה שיפחית את צמיחת האורגנואידים הראשונית. הפקת אורגנואיד בלוטת הדמעות של העכבר הייתה מוצלחת כאשר אורגנואידים ציסטיים בקוטר ~500 מיקרומטר נמצאו לאחר ~7 ימים, השלב שבו האורגנואידים היו מוכנים לפיצול (איור 2C). אפילו אם הנגזרת הכוללת של אורגנואידים מוצלחת, חלק מהאורגנואידים עשויים להתחיל לגדול לפני שיפסיקו בסופו של דבר. אורגנואידים של בלוטת הדמעות האנושית גדלו כציסטות תוך 3-4 ימים והגיעו לגודל מלא תוך 10-14 יום לאחר בידוד רקמות (איור 2D). הן עבור עכברים והן עבור בני אדם, גזירת אורגנואידים נכשלה לעתים, ללא אורגנואידים או מעטים שצמחו החוצה; זה נגרם בדרך כלל על ידי עיכול יתר של הרקמה. אורגנואידים של בלוטת הדמעות של העכבר יכולים לעבור לפחות פי 40 והאורגנואידים האנושיים לפחות פי 20. המעבר נעשה כל 7-10 ימים בממוצע, בהתאם לגידול האורגנואידים.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65040/65040fig02.jpg"> איור 2: התבססות אורגנואידים של עכבר ובלוטת הדמעות האנושית. (A) תצלומים של השלבים השונים של דיסקציה של בלוטת הדמעות בעכבר. החץ מצביע על בלוטת הדמעות שמתחת לקרום המגן שלה. (B) תמונות ברייטפילד של תאי בלוטת הדמעות של עכבר מיד לאחר עיכול הרקמות, עם כניסות המציגות אסינוס וצינור. (C) תמונות ברייטפילד של נגזרת אורגנואיד מוצלחת ולא מוצלחת של בלוטת הדמעות של עכבר. (D) תמונות ברייטפילד של צמיחת אורגנואידים אנושיים במשך 14 יום. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65040/65040fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
אורגנואידים בלוטת הדמעות מכילים חלק גדול של תאי גזע כאשר הם מתורבתים בתווך ההתפשטות. כדי להגדיל את רמת הבידול שלהם, הקמנו עכבר ומדיום בידול אנושי עם תוכן מופחת של גורם גדילה. לאחר 5 ימים ו-7 ימים, בהתאמה, במדיום ההתמיינות, אורגנואידים של העכבר ובלוטת הדמעות האנושית נעשו צפופים יותר (איור 3A-B). שינוי מורפולוגי זה היה בקורלציה עם תכונות פונקציונליות מוגברות. הפעלת AMP מחזורית פורסקולין או המוליך העצבי נוראפינפרין גרמה לנפיחות אורגנואידים (כלומר, הפרשת מים אפיים) תוך פחות מ-3 שעות (איור 3C). כאשר הנפיחות נמשכה יותר מ 3-4 שעות, זה הציע כי האורגנואידים לא היו מובחנים מספיק ו / או לא ביטאו סמנים פונקציונליים, כגון קולטנים עבור נוירוטרנסמיטורים.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65040/65040fig03.jpg"> איור 3: התמיינות בין אורגנואידים של בלוטת הדמעות של עכבר ושל בני אדם ובדיקת נפיחות תפקודית באורגנואידים אנושיים. (A) תמונות ברייטפילד של אורגנואידים של בלוטת הדמעות של עכבר שגודלו בתרבית בתווך התפשטות במשך 7 ימים ובמדיום התמיינות במשך 5 ימים לאחר יומיים בתווך התפשטות. (B) תמונות שדה בהיר של אורגנואידים של בלוטת הדמעות האנושית שגודלו בתרבית בתווך התפשטות במשך 11 יום ובתווך התמיינות במשך 9 ימים לאחר יומיים בתווך התפשטות. (C) תמונות ברייטפילד של אורגנואידים מובחנים של בלוטת הדמעות האנושית שנחשפו למדיום התמיינות טרי (בקרה), ל-1 מיקרומטר פורסקולין ול-100 מיקרומטר נוראפינפרין במשך 3 שעות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65040/65040fig03large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
כדי לחסל את Pax6 באורגנואידים של בלוטת הדמעות של עכברים, פלסמיד שהכיל את ה-gRNA המכוון ל-Pax6 שנבחר נוצר על-ידי PCR וקשירה (איור 4A). פלסמיד זה המכיל gRNA התחשמל יחד עם פלסמידים Piggy-Bac (פלסמידים המכילים טרנספוזון התנגדות היגרומיצין ופלסמידים המכילים טרנספוזאז) ועורך הבסיס C > T Cas9 באורגנואידים של בלוטת הדמעות של עכברים שנותקו לתאים בודדים. לאחר 3 ימים, כאשר האורגנואידים החלימו, הם נחשפו להיגרומיצין כדי לבחור שיבוטים ששילבו את קלטת העמידות להיגרומיצין. באלקטרופורציות מוצלחות צמחו אורגנואידים עמידים להיגרומיצין (איור 4B). השיבוטים האורגנואידים הגדלים שהיו גדולים מ~300 מיקרומטר נקטפו, באופן אידיאלי לפני שהם התחילו להתמיין באופן ספונטני (איור 4C). DNA הופק מחלק מהאורגנואיד תוך שמירה על השאר בתרבית. הגברת ה-PCR של מוקד Pax6 שאליו מכוון ה-gRNA הניבה פס של 367 bp עבור כל אחד מהשיבוטים שנבחרו (איור 4D). לאחר ריצוף הלוקוס המוגבר, נשמרו שיבוטים שהיו הומוזיגוטיים C > T ערוכים (n = 1). מצד שני, שיבוטים שלא נערכו (n = 4), נערכו באופן הטרוזיגוטי או נערכו באופן שגוי (n = 1) הושלכו (איור 4E). בסך הכל, באמצעות gRNA זה המכוון ל-Pax6, התקבל שיבוט הומוזיגוטי אחד של בלוטת הדמעות של עכבר מתוך שישה רצפים. חלק מהשיבוטים גדלו היטב, אולם חלק משיבוטי האורגנואידים אבדו לאחר שנקטפו או החלו להתמיין (איור 4F). מתוך 10 שיבוטים אורגנואידים שנבחרו, 7 צמחו היטב.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65040/65040fig04.jpg"> איור 4: נוק-אאוט בתיווך עריכה בסיסית של Pax6 באורגנואידים של בלוטת הדמעות של עכבר. (A) מעקב ריצוף סנגר של pFYF1320 לאחר אינטגרציה נכונה של ה-gRNA המכוון למוקד Pax6. (B) תמונות ברייטפילד של אורגנואידים של בלוטת הדמעות של עכבר 5 ימים לאחר החשיפה להיגרומיצין בעקבות אלקטרופורציה. האורגנואידים גודלו בתרבית במדיום התפשטות עכבר. משמאל דוגמה להתחשמלות כושלת, ללא שיבוט עמיד להיגרומיצין. מימין דוגמה להתחשמלות מוצלחת, עם כמה שיבוטים אורגנואידים עמידים להיגרומיצין ששרדו. (C) תמונות ברייטפילד של שיבוטים שיש לבחור ושיבוטים שאין לקטוף. (D) ג'ל אגרוז המראה את ההגברה של מוקד Pax6 הממוקד עם gRNA. בירוק, הרצועה בגודל הצפוי של 367 bp מודגשת. (E) מעקב אחר ריצוף סנגר של שלושה שיבוטים אורגנואידים שהיו עמידים להיגרומיצין. השיבוט העליון אינו ערוך. השיבוט האמצעי הוא מהדורת C > T הומוזיגוטית, ומכאן נוק-אאוט הומוזיגוטי. השיבוט התחתון מציג שתי מוטציות נקודתיות הטרוזיגוטיות והוא נוק-אאוט הטרוזיגוטי או שיבוט מעורב ונערך באופן שגוי. (F) תמונות ברייטפילד של שיבוטים אורגנואידים שנבחרו עם רמות שונות של גידול. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65040/65040fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
לבסוף, כדי לבצע השתלה אורתוטופית אורתוטופית של בלוטת הדמעות האנושית בעכברים, נעשה שימוש באורגנואידים שפוצלו 3 ימים מראש (< בקוטר 100 מיקרומטר). קליטת אורגנואידים אושרה חודש לאחר הזרקת האורגנואידים לבלוטת הדמעות של העכבר על-ידי צביעה של סמן ספציפי לאדם, האנטיגן הגרעין האנושי (איור 5). היעדר כתמי ניקוב מכל חלקי בלוטת הדמעות של העכבר סימל חוסר בקליטת אורגנואידים אנושיים.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65040/65040fig05.jpg"> איור 5: השתלת אורגנואידים של בלוטת הדמעות האנושית בבלוטת הדמעות של העכבר. צביעה של בלוטות דמעות עכבר מושתלות עבור סמן הגרעין האנושי כדי לפקח על קליטה 1 חודש לאחר ההשתלה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65040/65040fig05large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
טבלה משלימה 1: הרכב המדיה והחוצצים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65040/Supplementary%20Table%201.xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Establishment, Maintenance, Differentiation, Genetic Manipulation, and Transplantation of Mouse and Human Lacrimal Gland Organoids at JoVE.com

Establishment, Maintenance, Differentiation, Genetic Manipulation, and Transplantation of Mouse and Human Lacrimal Gland Organoids

פרוטוקול זה מתאר כיצד להקים, לתחזק, לשנות גנטית, להבדיל, לאפיין תפקודית ולהשתיל אורגנואידים של בלוטת הדמעות שמקורם ברקמת עכבר ראשונית ורקמה אנושית.

הקמה, תחזוקה, בידול, מניפולציה גנטית והשתלה של אורגנואידים של עכבר ובלוטת הדמעות האנושית

The lacrimal gland is an essential organ for ocular surface homeostasis. By producing the aqueous part of the tear film, it protects the eye from ...

עם אורגנואידים של בלוטת הדמעות, ניתן לבדוק כיצד גנים מסוימים שולטים בהומאוסטזיס של בלוטת הדמעות. בנוסף, ניתן להשתמש באורגנואידים לרפואה רגנרטיבית. היתרון העיקרי של טכנולוגיית אורגנואיד בלוטת הדמעות שמקורה בתאי גזע בוגרים הוא שהיא מאפשרת צמיחה ולימוד של תאי אפיתל בריאים ולא מותמרים של בלוטת הדמעות.אורגנואידים אלה יכולים לשמש בסופו של דבר לטיפול בחולים עם מחלת עין יבשה. התחל בהכנת המדיום והחומר הדרושים לניסוי, ולאחר מכן שלב את כל מרכיבי מדיום העיכול לפני הניסוי. הרטיבו מראש את האזמלים בתווך זה כדי למנוע חתיכות רקמה להידבק אליהם.שלפו את רקמת בלוטת הדמעות של העכבר מהמדיום, הניחו אותה בצלחת הפטרי וטחנו אותה בעזרת אזמלים שהורטבו מראש. ברגע שחתיכות הרקמה הן פחות מ -0.5 מילימטרים מעוקבים, מגרדים אותם מצלחת הפטרי עם האזמל, ומעבירים אותם לצינור של 15 מיליליטר המכיל את מדיום העיכול. עבור ביופסיה אנושית קטנה מאוד, מניחים אותה ישירות במדיום העיכול ללא טחינה.לדגור על צינור 15 מיליליטר שיש חתיכות רקמה עד 15 דקות באמבט מים 37 מעלות צלזיוס. בינתיים, צרים קצה פיפטה של פסטר בלהבה, והרטיבו אותו מראש בתווך הבסיס. כדי להקל על תהליך הדיסוציאציה, פיפטה את התערובת הטחונה למעלה ולמטה כל חמש דקות עם פיפטת פסטר רטובה מראש וצרה.כאשר תאים בודדים רבים וגושים קטנים נראים מתחת למיקרוסקופ, עצרו את הדיסוציאציה על ידי הוספת 10 מיליליטר של תווך הבסיס. לאחר סיבוב במשקל של 400 גרם במשך חמש דקות, מסירים את הסופרנטנט, ומרחפים מחדש את הגלולה ב-10 מיליליטר ממדיום הבסיס כדי לחזור על השטיפה והגלולה במורד התאים. הסר את חתיכות הרקמה הגדולות והלא מעוכלות ואת סיבי הקולגן הנותרים על ידי סינון התערובת הטחונה דרך מסננת של 70 מיקרומטר.סובבו את הפולט במשקל של 400 גרם למשך חמש דקות. לאחר הסרת הסופרנטנט, יש להשהות מחדש את גלולת התא ב-100 מיקרוליטר של מטריצה חוץ-תאית קרה, או ECM, עבור בלוטת דמעות עכבר בודדת ו-50 מיקרוליטר של ECM קר עבור ביופסיה אנושית, מבלי ליצור את הבועות. זרעו עד 100 מיקרוליטר תאים לכל באר של צלחת תרחיף של 12 בארות באמצעות P200 כדי ליצור טיפות של כ -20 מיקרוליטר בבאר.הניחו את הצלחת הפוכה באינקובטור לח בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 20 עד 30 דקות כדי לאפשר התמצקות ECM. לאחר מיצוק ה-ECM, הוסף כמיליליטר אחד של מדיום הרחבת עכבר בטמפרטורת החדר לכל באר של צלחת בעלת 12 בארות. מכינים טרייה מיליליטר אחד של מדיום התמיינות אנושי המכיל רכיבים בודדים הגורמים להפרשה על ידי אורגנואידים של בלוטת הדמעות.במיקרוסקופ אוטומטי של קיטועי זמן של שדה בהיר, הגדר את המיקומים לצילום בלוח, את מרווח הזמן של חמש דקות ואת משך הזמן של ארבע שעות. ודא שטיפת ECM שלמה גלויה בכל מיקום. לפני תחילת הצילום, הסר את מדיום התרבית מהבארות שיש לצלם מבלי להזיז את הצלחת מהמיקרוסקופ, והחלף אותו במדיום התמיינות אנושי טרי שהוכן מחדש היטב המכיל תרכובות, כולל פורסקולין ונוראדרנלין.כבקרה שלילית, כלול באר עם מדיום בידול רענן. לחץ על כפתור ההפעלה במיקרוסקופ, ונתח את התוצאות לאחר ארבע שעות. לאחר ניתוק האורגנואידים כפי שהוזכרו בטקסט, השליכו את הסופרנטנט.להשעות מחדש את התאים ב 80 מיקרוליטר של חיץ electroporation. בצינור של 1.5 מיליליטר, הכינו את הפלסמידים הדרושים לניסוי. מוסיפים את הפלסמידים לתאים, ומערבבים היטב על ידי פיפטינג למעלה ולמטה.הגדר את האלקטרופורטור עם הפרמטרים לדופק נקבוביות ודופק העברה. מניחים את התאים עם הפלסמידים בקובט אלקטרופורציה. מיד למדוד את ההתנגדות, אשר צריך להיות בין 0.3 אמפר ל 0.55 אמפר, אלקטרופורציה מיד.לאחר שתסיים, להעביר את התאים לצינור 1.5 מיליליטר, ולהוסיף 400 מיקרוליטר של חיץ אלקטרופורציה בתוספת מעכב Rho-kinase. אפשרו לתאים להתאושש בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. לאחר מכן, גלולה את התאים ב 500g במשך חמש דקות.לאחר השלכת supernatant, צלחת את התאים ב 200 מיקרוליטר של ECM. לאחר התמצקות, הוסף את מדיום הרחבת העכבר. להכנת אורגנואידים, יש לפצל את אורגנואידים של בלוטת הדמעות האנושית כשלושה ימים לפני יום ההשתלה.כדי לחלץ את האורגנואידים מה-ECM, הוסיפו דיספאס למדיום התרבית כדי להגיע לריכוז סופי של 0.125 יחידות למיליליטר, והשעו מחדש ביסודיות את טיפות ה-ECM כדי לשבש אותן באמצעות P1000. מחזירים את הצלחת לאינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. השהה מחדש את האורגנואידים ב -10 מיליליטר של מדיום הבסיס כדי לשטוף את האנזים.לאחר הטלת התאים על 400 גרם במשך חמש דקות, להשעות אותם מחדש 50 מיקרוליטר של מדיום התפשטות אנושי קר בתוספת 5% ECM. מניחים את תרחיף האורגנואיד על קרח, וממשיכים מיד להשתלה. להשתלה אורתוטופית בעכברים, שאפו את תרחיף האורגנואיד במחט אינסולין.כאשר העכבר ישן, מקם אותו במהירות על צדו עם בלוטת הדמעות הראשית נגישה. הזריקו חמישה מיקרוליטרים של תרחיף האורגנואיד ישירות דרך העור לתוך בלוטת הדמעות. אפשר לעכבר להתאושש, ולהעריך את נוכחותה של כל אי נוחות הקשורה להשתלה מדי יום, במיוחד בעין.בעקבות הדיסקציה של בלוטת הדמעות של העכבר, העיכול האנזימטי והמכני יצר שברי רקמות קטנים, כולל האסיני והצינורות. בגזירה המוצלחת של אורגנואיד בלוטת הדמעות בעכבר, נמצאו אורגנואידים ציסטיים בקוטר של כ-500 מיקרומטר לאחר שבעה ימים. אורגנואידים של בלוטת הדמעות האנושית גדלו כציסטות תוך שלושה עד ארבעה ימים והגיעו לגודל מלא תוך 10 עד 14 ימים לאחר בידוד הרקמות.לאחר חמישה ימים ושבעה ימים, בהתאמה, במדיום ההבחנה, אורגנואידים של העכבר ובלוטת הדמעות האנושית נעשו צפופים יותר. מריחת מפעיל AMP מחזורי פורסקולין או המוליך העצבי נוראפינפרין הביאה לנפיחות אורגנואיד תוך פחות משלוש שעות. בהתחשמלות מוצלחת צמחו אורגנואידים עמידים להיגרומיצין.שיבוטי האורגנואידים הגדלים הגדולים מ-300 מיקרומטר נקטפו לפני ההתמיינות שלהם. הגברה PCR של מוקד Pax6 הממוקד על ידי RNA מנחה הניבה רצועת זוג בסיס 367 עבור כל השיבוטים שנבחרו. שיבוט הומוזיגוטי אחד של בלוטת הדמעות של עכבר הנוקאאוט מתוך שישה רצפים התקבל באמצעות הרנ"א המנחה המכוון ל-Pax6.חלק מהשיבוטים גדלו היטב, אך חלק משיבוטי האורגנואידים אבדו לאחר הקטיף או החלו להתביין. מתוך 10 שיבוטים אורגנואידים שנבחרו, שבעה צמחו היטב. קליטת אורגנואידים אושרה חודש לאחר הזרקת האורגנואידים לבלוטת הדמעות של העכבר על ידי צביעה לסמן ספציפי לאדם, האנטיגן הגרעין האנושי.דבר אחד שיש לשים לב אליו הוא לא לעכל יתר על המידה את הרקמה, וגם לא את האורגנואידים. אחרת, התאים עלולים למות, וזה יפחית את קצב ההתבססות האורגנואידים. אורגנואידים בלוטת הדמעות ניתן לנתח על ידי היסטולוגיה.על ידי כך, ניתן לקבל תובנה בהרכב התאי שלהם.

Research

JoVE Journal

Biology

Generation of Human CD40-activated B cells

הדור של האדם CD40 בתאי B המופעל

CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been identified as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cancer ...

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells  

תרבות ותחזוקה של בתאי גזע עובריים אנושיים

Human embryonic stem (hES) cells must be monitored and cared for in order to maintain healthy, undifferentiated cultures. At minimum, the cultures must be ...

Isolation and Genetic Manipulation of Adult Cardiac Myocytes for Confocal Imaging

בידוד מניפולציה גנטית של Myocytes לב למבוגרים הדמיה confocal

Cardiac myocytes isolated from adult hearts are widely accepted as a model somewhere half way between embryonic and neonatal muscle cells on one side and ...

Genetic Modification and Recombination of Salivary Gland Organ Cultures

שינוי ורקומבינציה גנטי של תרבויות איברי בלוטות רוק

Branching  morphogenesis occurs during the development of many organs, and the embryonic  mouse submandibular gland (SMG) is a classical model for the ...

Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells

דור של cardiomyocytes אדם: פרוטוקול בידול מתאי גזע מושרה pluripotent אדם ללא מזין

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is ...

Alternative Cultures for Human Pluripotent Stem Cell Production, Maintenance, and Genetic Analysis

תרבויות אלטרנטיבי לפלוריפוטנטיים אנושיים לתאים גזע ייצור, תחזוקה וניתוח גנטי

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and ...

Manipulating the Murine Lacrimal Gland

המניפולציה Murine דמעות בלוטת

The lacrimal gland (LG) secretes aqueous tears necessary for maintaining the structure and function of the cornea, a transparent tissue essential for ...

Establishment and Maintenance of Gnotobiotic American Cockroaches (Periplaneta americana)

Establishment and Maintenance of Gnotobiotic American Cockroaches Periplaneta americana

הקמה ותחזוקה של מקקים אמריקאים גנוטוביוטיים (Periplaneta americana)

Gnotobiotic animals are a powerful tool for the study of controls on microbiome structure and function. Presented here is a protocol for the establishment ...

Establishment and Genetic Manipulation of Murine Hepatocyte Organoids

מניפולציה ממסדית וגנטית של אורגנוידים של מורין הפטוציט

The liver is the largest organ in mammals. It plays an important role in glucose storage, protein secretion, metabolism and detoxification. As the ...

Three-Dimensional, Serum-Free Culture System for Lacrimal Gland Stem Cells

מערכת תרבית תלת-ממדית, ללא סרום, לתאי גזע של בלוטת הדמעות

Lacrimal gland (LG) stem cell-based therapy is a promising strategy for lacrimal gland diseases. However, the lack of a reliable, serum-free culture ...