Name: establishment, maintenance, differentiation, genetic manipulation, and transplantation of mouse and human lacrimal gland organoids
Uploaded: 2023-02-03T14:15:00
Duration: 10 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Establishment, Maintenance, Differentiation, Genetic Manipulation, and Transplantation of Mouse and Human Lacrimal Gland Organoids at JoVE.com

Vi takker Yorick Post for den første utviklingen av protokollen. Dette arbeidet ble delvis støttet av en pris fra Cancer Research UK Grand Challenge (C6307 / A29058) og Foundation for Cancer Research til SPECIFICANCER-teamet.

<ol>
	<li>Garg, A., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lacrimal+gland+development:+From+signaling+interactions+to+regenerative+medicine.">Lacrimal gland development: From signaling interactions to regenerative medicine.</a> Developmental Dynamics. 246 (12), 970-980 (2017).</li><li>Selinger, D. S., Selinger, R. C., Reed, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resistance+to+infection+of+the+external+eye:+The+role+of+tears.">Resistance to infection of the external eye: The role of tears.</a> Survey of Ophthalmology. 24 (1), 33-38 (1979).</li><li>Messmer, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathophysiology,+diagnosis,+and+treatment+of+dry+eye+disease.">The pathophysiology, diagnosis, and treatment of dry eye disease.</a> Deutsches Arzteblatt International. 112 (5), 71-81 (2015).</li><li>Massie, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+lacrimal+gland+spheroids+for+lacrimal+gland+tissue+regeneration.">Development of lacrimal gland spheroids for lacrimal gland tissue regeneration.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (4), 2001-2009 (2018).</li><li>Tiwari, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+human+lacrimal+gland+cultures+with+secretory+function.">Establishing human lacrimal gland cultures with secretory function.</a> PloS One. 7 (1), 29458 (2012).</li><li>Nguyen, D. H., Beuerman, R. W., Halbert, C. L., Ma, Q., Sun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+immortalized+rabbit+lacrimal+gland+epithelial+cells.">Characterization of immortalized rabbit lacrimal gland epithelial cells.</a> In Vitro Cellular &amp; Developmental Biology. Animal. 35 (4), 198-204 (1999).</li><li>Bannier-H&#233;laou&#235;t, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+human+lacrimal+gland+using+organoids+and+single-cell+sequencing.">Exploring the human lacrimal gland using organoids and single-cell sequencing.</a> Cell Stem Cell. 28 (7), 1221-1232 (2021).</li><li>Hayashi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+3D+lacrimal+gland+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells.">Generation of 3D lacrimal gland organoids from human pluripotent stem cells.</a> Nature. 605 (7908), 126-131 (2022).</li><li>Jeong, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+functional+epithelial+organoids+from+human+lacrimal+glands.">Establishment of functional epithelial organoids from human lacrimal glands.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 12 (1), 247 (2021).</li><li>Hofer, M., Lutolf, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+organoids.">Engineering organoids.</a> Nature Reviews Materials. 6 (5), 402-420 (2021).</li><li>Meyenberg, M., Ferreira da Silva, J., Loizou, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+specific+DNA+repair+outcomes+shape+the+landscape+of+genome+editing.">Tissue specific DNA repair outcomes shape the landscape of genome editing.</a> Frontiers in Genetics. 12, 728520 (2021).</li><li>Geurts, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-based+adenine+editors+correct+nonsense+mutations+in+a+cystic+fibrosis+organoid+biobank.">CRISPR-based adenine editors correct nonsense mutations in a cystic fibrosis organoid biobank.</a> Cell Stem Cell. 26 (4), 503-510 (2020).</li><li>Overmyer, K. A., Thonusin, C., Qi, N. R., Burant, C. F., Evans, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+anesthesia+and+euthanasia+on+metabolomics+of+mammalian+tissues:+Studies+in+a+C57BL/6J+mouse+model.">Impact of anesthesia and euthanasia on metabolomics of mammalian tissues: Studies in a C57BL/6J mouse model.</a> PLoS One. 10 (2), 0117232 (2015).</li><li>Driehuis, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+mucosal+organoids+as+a+potential+platform+for+personalized+cancer+therapy.">Oral mucosal organoids as a potential platform for personalized cancer therapy.</a> Cancer Discovery. 9 (7), 852-871 (2019).</li><li>Froger, A., Hall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+plasmid+DNA+into+E.+coli+using+the+heat+shock+method.">Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method.</a> Journal of Visualized Experiments. (6), e253 (2007).</li><li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li><li>Lian, J., Meng, X., Zhang, X., Hu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+genetic+manipulation+of+murine+hepatocyte+organoids.">Establishment and genetic manipulation of murine hepatocyte organoids.</a> Journal of Visualized Experiments. (180), e62438 (2022).</li><li>L&#245;hmussaar, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+organoids+model+cervical+tissue+dynamics+and+viral+oncogenesis+in+cervical+cancer.">Patient-derived organoids model cervical tissue dynamics and viral oncogenesis in cervical cancer.</a> Cell Stem Cell. 28 (8), 1380-1396 (2021).</li><li>Bloh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deconvolution+of+complex+DNA+repair+(DECODR):+Establishing+a+novel+deconvolution+algorithm+for+comprehensive+analysis+of+CRISPR-edited+Sanger+sequencing+data.">Deconvolution of complex DNA repair (DECODR): Establishing a novel deconvolution algorithm for comprehensive analysis of CRISPR-edited Sanger sequencing data.</a> The CRISPR Journal. 4 (1), 120-131 (2021).</li><li>Latta, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiology+of+aniridia-associated+keratopathy:+Developmental+aspects+and+unanswered+questions.">Pathophysiology of aniridia-associated keratopathy: Developmental aspects and unanswered questions.</a> The Ocular Surface. 22, 245-266 (2021).</li><li>Veernala, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lacrimal+gland+regeneration:+The+unmet+challenges+and+promise+for+dry+eye+therapy.">Lacrimal gland regeneration: The unmet challenges and promise for dry eye therapy.</a> The Ocular Surface. 25, 129-141 (2022).</li><li>Hayashi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+3D+lacrimal+gland+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells.">Generation of 3D lacrimal gland organoids from human pluripotent stem cells.</a> Nature. 605 (7908), 126-131 (2022).</li></ol>

Hans Clevers er leder for farmasøytisk forskning og tidlig utvikling hos Roche, Basel, og har flere patenter knyttet til organoidteknologi.

Denne protokollen beskriver etablering og bruk av lacrimal kjertelorganoider for funksjonelle analyser, mutasjonsmodellering og transplantasjon. Når du etablerer mus og humane lacrimal kjertelorganoider, er vevsdissosiasjon avgjørende. Hvis vevet ikke er tilstrekkelig fordøyd, vil organoidutbyttet være lavt. Hvis vevet er overfordøyd, vil cellene dø og ikke vokse ut som organoider. Hvert vev skal fordøyes med et spesifikt enzym i en bestemt tid for å sikre optimal organoid utvekst14,17,18. Lakrimalkjertelen er et ganske mykt vev for hvilket en kollagenasefordøyelse på 5-10 minutter kombinert med pipetteringsbasert mekanisk dissosiasjon er tilstrekkelig til å isolere små biter av vev. Hvis enkeltceller må oppnås for applikasjoner som enkeltcelle RNA-sekvensering, kan dissosiasjonen utføres lenger til enkeltcellestadiet er nådd, men dissosiasjon bør stoppes så snart enkeltceller er oppnådd for å begrense enhver reduksjon i levedyktighet. Siden vevsdissosiasjon er så avgjørende, er overfordøyelse den mest sannsynlige årsaken til svikt i lacrimal kjertelorganoid etablering.
Riktig vedlikehold av lacrimal kjertelorganoider er viktig for deres bruk. Langsiktig vedlikehold er et kjennetegn på voksne stamcelleavledede lacrimal kjertelorganoider, sammenlignet med induserte pluripotente stamcelleavledede organoider 7,17. For å oppnå langsiktig vedlikehold bør regelmessig organoidsplitting og middels endringer utføres. Uten dette begynner organoider å differensiere og utvikle redusert stamcellepotensial, noe som hemmer deres langsiktige vedlikehold7. På dette trinnet igjen, kan over-fordøyelsen drepe stamceller og svekke organoid vedlikehold. For regelmessig vedlikehold er det ikke nødvendig med organoid dissosiasjon i enkeltceller. For å generere klonale knock-out organoide linjer er det imidlertid viktig å begynne med enkeltceller. Hvis ikke, vil organoidene bestå av en mosaikk av celler med forskjellig genetisk bakgrunn, noe som gjør det umulig å analysere effekten av en enkelt, definert mutasjon. Her beskriver vi bruken av en C- > T-baseeditor for å generere stoppkodoner. Denne genomeditoren er avhengig av tilstedeværelsen av arginin-, glutamin- eller tryptofankodoner innen 12-18 baser fra en NGG PAM. Når disse betingelsene ikke er oppfylt ved utforming av et gRNA, kan konvensjonelle Cas9- eller C >T-baseredigerere med alternative PAM-er brukes 7,18. Imidlertid introduserer konvensjonell Cas9 dobbeltstrengede brudd som resulterer i indels ved reparasjon11. Siden begge allelene kan ha forskjellige indels, krever klonegenotyping ekstra forsiktighet. Dekonvolusjon av de innførte modifikasjonene bør utføres for å sikre at begge allelene inneholder indels utenfor rammen, og dermed at organoidklonene blir slått ut for genet som er målrettet19. Fordelen med C- > T-baseredaktører ligger i det faktum at de kan brukes til å modellere punktmutasjoner som ikke nødvendigvis resulterer i stoppkodoner. For eksempel kan de brukes til å modellere spesifikke Pax6-mutasjoner funnet hos pasienter med aniridia for å studere deres innvirkning på lacrimal kjertelfysiologi20.
Lakrimalkjertelen utskiller den vandige delen av tårfilmen1. Tåresekresjon kan rekapituleres i humane organoider etter differensiering mediert av vekstfaktoruttak og NOTCH-hemming. Under disse forholdene gjennomgår organoider terminal differensiering og kan ikke opprettholdes ytterligere. Likevel kan differensierte lacrimal kjertelorganoider lede utviklingen av tårefremkallende stoffer i sammenheng med tørr øyesykdom, potensielt i skjermbilder med høy gjennomstrømning. Riveanalysen som presenteres i denne protokollen er den som for tiden gir den største endringen i organoidstørrelse på kort tid, noe som gjør det lettere å kvantifisere i sammenheng med en narkotikaskjerm 7,9,17.
Stamcellebehandling har stort løfte om lacrimal kjertel regenerering i tørr øyesykdom21. Voksne stamcelleavledede lacrimal kjertelorganoider kan være et kildemateriale for slike applikasjoner. Protokollen som presenteres her resulterer i human lacrimal gland organoid engraftment, hovedsakelig som cyster. Lav organoid engraftment kan oppstå på grunn av organoider som injiseres på feil sted. Trening av injeksjonsprosedyren med et fargestoff gjør det mulig å spore injeksjonsstedet og til slutt forbedre injeksjonsnøyaktigheten. Alternativt kan musepidermis snittes til å ha direkte tilgang til tårekjertelen, slik det gjøres hos rotter før22. Denne metoden tar lengre tid, men kan være mer nøyaktig. På den annen side, med den nåværende protokollen, ble organoidene ikke funksjonelt integrert i musens lacrimal kjertel. Lignende resultater er observert for iPSC-derivert tårekjerteltransplantasjon22. Transplantasjonsmetoden kan forbedres ytterligere ved å skade tårekjertelen på forhånd, ved hjelp av en tørr øyemusemodell og / eller injisere organoider som enkeltceller eller små klumper. Likevel kan voksne stamcelleavledede lacrimal kjertelorganoider og tilhørende verktøykasse være grunnlaget for fremtidige anvendelser i lacrimal kjertelforskning og regenerativ medisin.

Lakrimalkjertelen er kjertelepitelet som er ansvarlig for å produsere det meste av det vandige laget av tårfilmen1. Det vandige laget av tårefilmen inneholder ikke bare vann for å smøre den okulære overflaten, men også et stort repertoar av antimikrobielle komponenter som beskytter den okulære overflaten mot infeksjoner2. Når lacrimal kjertelen er skadet eller betent, oppstår tørr øyesykdom, noe som resulterer i ubehag for pasienter og kan til slutt føre til tap av syn3. Gjennom årene har modellsystemer for å studere tårekjertelen, spesielt den menneskelige kjertelen, vært begrenset 4,5,6. Dette har bidratt til et kunnskapshull om tårekjertelfunksjon under fysiologiske og patologiske forhold.
Nylig har in vitro-modeller blitt utviklet for å studere lacrimal kjertelen i en tallerken 7,8,9. Disse lacrimal kjertelorganoider er avledet fra voksne stamceller dyrket som tredimensjonale strukturer i en ekstracellulær matrise supplert med en cocktail av vekstfaktorer som opprettholder deres regenerative kapasiteter in vitro7. Fordelen med voksne stamcelle (ASC) -avledede organoider er at de kan opprettholdes i svært lang tid mens de rekapitulerer sunne vevsfunksjoner. Denne typen organoid består utelukkende av epitelceller, i motsetning til induserte pluripotente stamceller (iPSC) -avledede organoider, som også kan inneholde stromale celler, for eksempel. I motsetning til pluripotente stamceller (PSC)-avledede organoider, etableres ASC-organoider direkte fra voksent vev og krever ingen genetiske modifikasjoner for å bli utvidet. ASC-organoider uttrykker voksne egenskaper10.
Denne protokollen inneholder en verktøykasse for å utlede lacrimal kjertelorganoider fra mus og humant primærvev. Protokollen beskriver hvordan man ytterligere kan forbedre organoidenes funksjonalitet ved enkel tilbaketrekking av vekstfaktor og hvordan man provoserer organoidene til å utskille tårevæske ved å utføre en hevelsesanalyse. Denne protokollen inkluderer i tillegg en elektroporasjonsbasert transfeksjonsmetode for genetisk manipulering av museorganoider ved hjelp av CRISPR-avledede baseredigerere. I motsetning til konvensjonell Cas9 tillater bruk av baseredigerere modifisering av enkeltbaser i genomet uten å generere et dobbeltstrenget brudd11,12. Til slutt beskrives ortotopisk transplantasjon av humane tårekjertelorganoider til immundefekte mus og den påfølgende histologiske vurderingen av transplantasjonen. Dette lacrimal kjertel organoid verktøykasse kan brukes i forskning på lacrimal kjertel regenerering og funksjon og for genetisk og inflammatorisk sykdom modellering.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL safe-lock centrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>EP0030 120.094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,3&#8242;-Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrate (DAB)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5637</td>
			<td>CAS: 868272-85-9 , CAUTION, 6 g/L solution can be stored aliquotted at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5x green GoTaq Flexi buffer</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M891A</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A83-01</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2939</td>
			<td>Store at -20 &#176;C, stock at 30 mM, 10000x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12634-010</td>
			<td>store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar plates containing Ampicillin</td>
			<td>Hubrecht Institute</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave VAPOUR-Line lite</td>
			<td>VWR chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>Store at -20 &#176;C, 50x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Micro-Fine insulin needle 1 mL</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>324825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop microscope DMI1</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumine (BSA)</td>
			<td>MP biomedicals</td>
			<td>160069</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BTXpress</td>
			<td>BTX</td>
			<td>MDS450805</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 mice</td>
			<td>Hubrecht Institute</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cassettes</td>
			<td>Klinipath</td>
			<td>410-02S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellBanker 1</td>
			<td>amsbio</td>
			<td>11910</td>
			<td>Cryopreservation medium, adhere to instructions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid monohydrate</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>0088</td>
			<td>CAS: 5949-29-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase I</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C9407</td>
			<td>Aliquots at 20 mg/mL, 20x, store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes 15 mL</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>5618-8271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes 50 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS430828-500EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips 24 mm x 50 mm</td>
			<td>Menzel-Gl&#228;zer</td>
			<td>BB024050S1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex Basement Membrane Extract (BME), Growth Factor Reduced, Type 2 - extracellular matrix</td>
			<td>R&#38;D Systems, Bio-Techne</td>
			<td>3533-001-02</td>
			<td>Store at -20 &#176;C, keep at 4 &#176;C for up to 1 month</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPT</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D5942</td>
			<td>Store at -20 &#176;C, stock at 10 mM, 1000x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium hydrogen phosphate anhydrous</td>
			<td>VWR chemicals</td>
			<td>28026.292</td>
			<td>CAS: 7558-79-4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Di-sodiumhydrogenphosphate dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71643</td>
			<td>CAS:10028-24-7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>17105-041</td>
			<td>Aliquots at 50 U/mL, store at -20 &#176;C until use, 400x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Scalpel Sterile N&#176; 10</td>
			<td>Swann Morton</td>
			<td>3033838</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DM4000 microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTPs 25 mM</td>
			<td>Promega</td>
			<td>U1420</td>
			<td>Mix all 4 nucleotides together, Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dpn1</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate-bufferd Saline (DPBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190144</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Easy strainers 70 &#181;m</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>542170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation cuvette</td>
			<td>Nepagene</td>
			<td>EC002S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EnVision+/HRP mouse</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>K400111-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 100%</td>
			<td>BOOM</td>
			<td>84045206;5000</td>
			<td>CAUTION, Use to prepare other Ethanol dilutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 70%</td>
			<td>BOOM</td>
			<td>84010059.5000</td>
			<td>CAUTION</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 96%</td>
			<td>BOOM</td>
			<td>84050065.5000</td>
			<td>CAUTION</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS FL Auto 2 Cell Imaging System</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Live-imaging brightfield microscrope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF10</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-26</td>
			<td>Store at -20 &#176;C, stock at 100 mg/mL in base medium, 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td>NIH, Fiji developers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution 4%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1.00496</td>
			<td>CAS: 50-00-0, CAUTION</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1099</td>
			<td>Store at -20 &#176;C, stock at 10 mM, 10000x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GoTaq G2 Flexi DNA Polymerase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M7805</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Haematoxylin</td>
			<td>VWR chemicals</td>
			<td>10047105</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td>Store at 4 &#176;C, 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histocore H and C, Tissue embedding machine</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate</td>
			<td>Meidax</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human nucleolar antigen antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab-190710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid 5 N</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10605882</td>
			<td>CAS: 7647-01-0, CAUTION</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxyde 30%</td>
			<td>Chem-lab</td>
			<td>CL00.2308.1000</td>
			<td>CAS: 7722-84-1, CAUTION</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygromycin B-gold</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ant-hg</td>
			<td>Stock at 100 mg/&#181;L, 1000x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygromycin resistance cassette-containing plasmid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Andersson-Rolf et al, Nature Methods, 2017. doi: 10.1038/nmeth.4156</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IsoFlo 100%</td>
			<td>Mecan</td>
			<td>5960501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB medium</td>
			<td>Hubrecht Institute</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 25 mM</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A351H</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome RM2235</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Midiprep DNA isolation kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>K210005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniprep DNA isolation kit</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>K210003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetylcysteine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9165</td>
			<td>Store at -20 &#176;C, stock at 500 mM, 400x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEPA21 electroporator</td>
			<td>Nepagene</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>N0636</td>
			<td>Store at -20 &#176;C, stock at 1M, 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOD Scid Gamma (NSG) mice</td>
			<td>Hubrecht Institute colony</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noggin conditioned medium</td>
			<td>U-Protein Express</td>
			<td>Custom order</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noradrenaline</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A7257</td>
			<td>Store at -20 &#176;C, stock at 100 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Memmert</td>
			<td></td>
			<td>Set at 58 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P20, P200 and P1000 pipettes</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin</td>
			<td>VWR chemicals</td>
			<td>10048502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipettes, glass plugged</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>1150-6973</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pax6_C&#62;T_F: AGACTGTTCCAGGATGGCTG&#160;</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pax6_C&#62;T_R: TCTCCTAGGTACTGGAAGCC&#160;</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCMV_ABEmax_P2A_GFP</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>112101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pertex</td>
			<td>Klinipath</td>
			<td>AM-08010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pFYF1320&#160;</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>47511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ant-pm-1</td>
			<td>1000X, store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prostaglandin E2 (PGE2)</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2296</td>
			<td>Store at -20 &#176;C, stock at 10 mM, 10000x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish, 10 cm</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>633102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B9027S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 high-fidelity DNA polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0491S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuickExtract DNA Extraction Solution</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>QE09050</td>
			<td>Store aliquots at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-spondin 3 conditioned medium</td>
			<td>U-Protein Express</td>
			<td>Custom order</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sgRNA Reverse Primer: TCTGCGCCCATCTGTTGCTT CGGTGTTTCGTCCTTTCCACAAG</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides</td>
			<td>StarFrost</td>
			<td>MBB-0302-55A</td>
			<td>Adhesive, ground</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8.22335.1000</td>
			<td>CAS: 26628-22-8, CAUTION</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium cytrate dihydrate</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>0280</td>
			<td>CAS: 6132-04-3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Forward Primer: &#8220;/5phos/ GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG 
			TTAAAATAAGGC</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Subcloning efficiency competent cells DH5alpha</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18265-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suspension cell culture plates (24-well)</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>662102</td>
			<td>24-well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suspension cell culture plates (12-well)</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>665102</td>
			<td>12-well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAE buffer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>B49</td>
			<td>Stock at 50x, dilute to 1x with ultrapure water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transposase-containing plasmid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Andersson-Rolf et al, Nature Methods, 2017. doi: 10.1038/nmeth.4156</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express Enzyme</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12605-028</td>
			<td>store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U6_Forward primer: GGGCAGGAAGAGGGCCTAT</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Agarose 1000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Tulabo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Klinipath</td>
			<td>4055-9005</td>
			<td>CAS: 1330-20-7, CAUTION</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Abmole Bioscience</td>
			<td>Y-27632 dihydrochloride</td>
			<td>Store at -20 &#176;C, stock at 10 mM, 1000x</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishment, maintenance, differentiation, genetic manipulation, and transplantation of mouse and human lacrimal gland organoids

Lakrimalkjertelen er et viktig organ for okulær overflatehomeostase. Ved å produsere den vandige delen av tårefilmen, beskytter den øyet mot uttørkingsstress og eksterne fornærmelser. Lite er kjent om tårekjertelen (pato)fysiologi på grunn av mangel på tilstrekkelige in vitro-modeller . Organoidteknologi har vist seg som en nyttig eksperimentell plattform for flere organer. Her deler vi en protokoll for å etablere og vedlikeholde mus og humane lacrimal kjertelorganoider som starter fra lacrimal kjertelbiopsier. Ved å endre kulturforholdene, forbedrer vi lacrimal kjertelorganoid funksjonalitet. Organoid funksjonalitet kan undersøkes gjennom en "gråtende" analyse, som innebærer å utsette lacrimal kjertelorganoider til utvalgte nevrotransmittere for å utløse tårefrigjøring i lumen. Vi forklarer hvordan vi kan avbilde og kvantifisere dette fenomenet. For å undersøke rollen som gener av interesse i lacrimal kjertel homeostase, kan disse bli genetisk modifisert. Vi beskriver grundig hvordan man genetisk modifiserer lacrimal kjertelorganoider ved hjelp av base redaktører - fra guide RNA design til organoid klon genotyping. Til slutt viser vi hvordan man kan undersøke det regenerative potensialet til humane lacrimal kjertelorganoider ved ortotopisk implantasjon i musen. Sammen gir dette omfattende verktøysettet ressurser til å bruke mus og humane lacrimal kjertelorganoider for å studere lacrimal kjertel (pato) fysiologi.

Etter disseksjon av musens tårekjertelen (figur 2A) genererte den enzymatiske og mekaniske fordøyelsen små vevsfragmenter, blant hvilke acini og kanaler kunne skilles (figur 2B). De resterende store vevsbitene ville destabilisere ECM, noe som ville redusere den første organoidutveksten. Musens lacrimal kjertelorganoidavledning var vellykket når cystiske organoider med ~ 500 μm diameter ble funnet etter ~ 7 dager, stadiet der organoidene var klare til å bli delt (figur 2C). Selv om den samlede organoidavledningen er vellykket, kan noen organoider begynne å vokse før de til slutt stopper. Humane lacrimal kjertelorganoider vokste ut som cyster innen 3-4 dager og nådde fullvoksen størrelse i 10-14 dager etter vevsisolering (figur 2D). For både mus og mennesker mislyktes organoid derivasjon noen ganger, med ingen eller få organoider som vokste ut; Dette var vanligvis forårsaket av overfordøyelse av vevet. Musens lacrimal kjertelorganoider kan passeres minst 40x og de menneskelige organoider minst 20x. Passasje ble gjort hver 7-10 dager i gjennomsnitt, avhengig av organoid vekst.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65040/65040fig02.jpg"> Figur 2 Etablering av organoider i tårekjertelen hos mus og mennesker. (A) Fotografier av de forskjellige stadier av mus lacrimal kjertel disseksjon. Pilen peker på lacrimal kjertelen under sin beskyttende membran. (B) Brightfield bilder av mus lacrimal kjertel celler rett etter vev fordøyelse, med innsatser som viser en acinus og en kanal. (C) Brightfield bilder av en vellykket og en mislykket mus lacrimal kjertel organoid derivasjon. (D) Brightfield-bilder av menneskelig organoidutvekst i løpet av 14 dager. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65040/65040fig02large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
Lakrimalkjertelorganoidene inneholder en stor andel stamceller når de dyrkes i ekspansjonsmediet. For å øke differensieringsnivået satte vi opp en mus og et menneskelig differensieringsmedium med redusert vekstfaktorinnhold. Etter henholdsvis 5 dager og 7 dager, i differensieringsmediet, ble musen og humane lacrimal kjertelorganoider tettere (figur 3A-B). Denne morfologiske endringen korrelerte med økte funksjonelle egenskaper. Bruk av den sykliske AMP-aktivatoren forskolin eller nevrotransmitteren noradrenalin resulterte i organoid hevelse (dvs. apikal vannsekresjon) innen mindre enn 3 timer (figur 3C). Når hevelsen tok lengre tid enn 3-4 timer, tydet dette på at organoidene ikke var differensiert nok og/eller ikke uttrykte funksjonelle markører, slik som reseptorer for nevrotransmittere.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65040/65040fig03.jpg"> Figur 3: Differensiering av mus og humane lacrimal kjertelorganoider og funksjonell hevelsesanalyse i humane organoider. (A) Brightfield-bilder av mus lacrimal kjertelorganoider dyrket i ekspansjonsmedium i 7 dager og i differensieringsmedium i 5 dager etter 2 dager i ekspansjonsmedium. (B) Brightfield-bilder av humane lacrimal kjertelorganoider dyrket i ekspansjonsmedium i 11 dager og i differensieringsmedium i 9 dager etter 2 dager i ekspansjonsmedium. (C) Brightfield-bilder av differensierte humane tårekjertelorganoider utsatt for ferskt differensieringsmedium (kontroll), til 1 μM forskolin og til 100 μM noradrenalin i løpet av 3 timer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65040/65040fig03large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
For å slå ut Pax6 i musens lacrimal kjertelorganoider, ble et plasmid som inneholdt det valgte Pax6-målrettede gRNA generert ved PCR og ligering (figur 4A). Dette gRNA-holdige plasmidet ble elektroporert sammen med Piggy-Bac-plasmidene (hygromycinresistens transposonholdige og transposaseholdige plasmider) og C > T-baseredaktøren Cas9 i musens lacrimal kjertelorganoider dissosiert til enkeltceller. Etter 3 dager, da organoidene hadde gjenopprettet, ble de utsatt for hygromycin for å velge kloner som hadde innlemmet hygromycinresistenskassetten. I vellykkede elektroporasjoner vokste organoider som var resistente mot hygromycin ut (figur 4B). De voksende organoidklonene som var større enn ~ 300 μm ble plukket, ideelt sett før de begynte å spontant differensiere (figur 4C). DNA ble ekstrahert fra en del av organoiden mens resten ble holdt i kultur. PCR-amplifiseringen av Pax6-lokuset målrettet av gRNA ga et 367 bp-bånd for hver av klonene som ble valgt (figur 4D). Etter sekvensering av det forsterkede locus ble kloner som var homozygt C > T redigert (n = 1) beholdt. På den annen side ble kloner som ikke var redigert (n = 4), heterozygt redigert eller feilredigert (n = 1) kassert (figur 4E). Samlet sett, ved hjelp av dette gRNA rettet mot Pax6, ble det oppnådd en homozygot knock-out mus lacrimal kjertel klon av seks sekvenserte. Noen kloner vokste godt ut, men noen organoide kloner gikk tapt etter plukking eller begynte å differensiere (figur 4F). Av de 10 organoidklonene som ble plukket ut, vokste 7 godt ut.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65040/65040fig04.jpg"> Figur 4: Base editing-mediert knock-out av Pax6 i mus lacrimal kjertel organoider. (A) Sanger-sekvenseringsspor av pFYF1320 etter korrekt integrering av gRNA rettet mot Pax6-lokuset. (B) Brightfield-bilder av musens tårekjertelorganoider 5 dager etter eksponering for hygromycin etter elektroporering. Organoidene ble dyrket i museekspansjonsmedium. Til venstre er et eksempel på en mislykket elektroporering, uten klon som er resistent mot hygromycin som vokser ut. Til høyre er et eksempel på en vellykket elektroporering, med flere hygromycinresistente organoide kloner som overlever. (C) Brightfield-bilder av kloner som bør velges og kloner som ikke skal velges. (D) Agarosegel som viser forsterkningen av Pax6-lokuset målrettet med gRNA. I grønt er båndet med forventet størrelse på 367 bp uthevet. (E) Sanger-sekvenseringsspor av tre organoide kloner som var resistente mot hygromycin. Den øverste klonen er uredigert. Den midterste klonen er en homozygot C > T-utgave og dermed en homozygot knock-out. Den nederste klonen presenterer to heterozygote punktmutasjoner og er enten en heterozygot knock-out eller en blandet klone og har blitt feilredigert. (F) Brightfield-bilder av de plukkede organoidklonene med forskjellige nivåer av utvekst. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65040/65040fig04large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
Til slutt, for å utføre human lacrimal kjertel organoid ortotopisk transplantasjon hos mus, ble organoider som ble delt 3 dager i forveien (< 100 μm i diameter) brukt. Organoid transplantasjon ble bekreftet 1 måned etter injeksjon av organoidene i musens lacrimal kjertel ved farging for en humanspesifikk markør, det humane nukleolære antigenet (figur 5). Fraværet av punktert farging fra alle delene av musens lacrimal kjertel betydde mangel på menneskelig organoid engraftment.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65040/65040fig05.jpg"> Figur 5: Transplantasjon av humane lakrimalkjertelorganoider i musens tårekjertel. Farging av transplanterte mus lacrimal kjertler for den humane nukleolære markøren for å overvåke engraftment 1 måned etter transplantasjon. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65040/65040fig05large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
Tilleggstabell 1: Mediesammensetning og buffere. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65040/Supplementary%20Table%201.xlsx" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne tabellen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Establishment, Maintenance, Differentiation, Genetic Manipulation, and Transplantation of Mouse and Human Lacrimal Gland Organoids at JoVE.com

Establishment, Maintenance, Differentiation, Genetic Manipulation, and Transplantation of Mouse and Human Lacrimal Gland Organoids

Denne protokollen beskriver hvordan man etablerer, vedlikeholder, genetisk modifiserer, differensierer, funksjonelt karakteriserer og transplanterer lacrimal kjertelorganoider avledet fra primærmus og humant vev.

Etablering, vedlikehold, differensiering, genetisk manipulasjon og transplantasjon av mus og humane lakrimale kjertelorganoider

The lacrimal gland is an essential organ for ocular surface homeostasis. By producing the aqueous part of the tear film, it protects the eye from ...

Med lacrimal kjertel organoider, kan man se på hvordan visse gener kontroll lacrimal kjertel homeostase. I tillegg kan organoidene brukes til regenerativ medisin. Den største fordelen med voksen stamcelleavledet lacrimal gland organoid teknologi er at den tillater vekst og studier av sunne og ikke-transformerte lacrimal kjertel epitelceller.Disse organoider kan til slutt brukes til å behandle pasienter med tørr øyesykdom. Begynn med å forberede mediet og materialet som kreves for forsøket, etterfulgt av å kombinere alle komponentene i fordøyelsesmediet før forsøket. Forvåt skalpellene i dette mediet for å unngå at vevbiter fester seg til dem.Hent musens lacrimal kjertelvev fra mediet, legg det i petriskålen og hakk det med forfuktede skalpeller. Når vevstykkene er mindre enn 0,5 kubikkmillimeter, skrap dem av petriskålen med skalpellen og overfør dem til et 15 milliliter rør som inneholder fordøyelsesmediet. For en svært liten menneskelig biopsi, plasser den direkte i fordøyelsesmediet uten hakking.Inkuber 15 milliliters røret med vevstykker i opptil 15 minutter i et 37 grader Celsius vannbad. I mellomtiden smalner du en Pasteur-pipettespiss i en flamme og forvåt den i basismediet. For å lette dissosiasjonsprosessen, pipetter den hakkede blandingen opp og ned hvert femte minutt med den forfuktede, innsnevrede Pasteur-pipetten.Når mange enkeltceller og små klumper er synlige under mikroskopet, stopp dissosiasjonen ved å legge til 10 ml av basismediet. Etter å ha spinnet ned ved 400g i fem minutter, fjern supernatanten, og resuspender pelleten i 10 ml av basemediet for å gjenta vask og pellet ned cellene. Fjern de store, ufordøyde vevsbitene og gjenværende kollagenfibrene ved å filtrere hakket blanding gjennom en 70 mikrometer sil.Spinn eluatet på 400g i fem minutter. Etter å ha fjernet supernatanten, resuspender cellepelleten i 100 mikroliter kald ekstracellulær matriks, eller ECM, for en enkelt mus lacrimal kjertel og 50 mikroliter kald ECM for en human biopsi, uten å skape boblene. Frø opptil 100 mikroliter celler per brønn av en 12-brønns suspensjonsplate ved hjelp av en P200 for å lage ca. 20 mikroliter dråper i brønnen.Plasser platen opp ned i en fuktet inkubator ved 37 grader Celsius i 20 til 30 minutter for å tillate ECM-størkning. Når ECM er størknet, tilsett omtrent en milliliter romtemperatur museekspansjonsmedium per brønn på en 12-brønnsplate. Tilbered nylig en milliliter humant differensieringsmedium som inneholder individuelle komponenter som induserer sekresjon av lacrimal kjertelorganoider.På et automatisert brightfield time-lapse-mikroskop, sett opp posisjonene som skal avbildes i platen, tidsintervallet på fem minutter og varigheten på fire timer. Sørg for at en hel ECM-dråpe er synlig i hver posisjon. Før du begynner å avbilde, fjern kulturmediet fra brønnene som skal avbildes uten å flytte platen fra mikroskopet, og erstatt det med det tilberedte, godt resuspenderte humane differensieringsmediet som inneholder forbindelser, inkludert forskolin og noradrenalin.Som en negativ kontroll, inkluder en brønn med oppdatert differensieringsmedium. Klikk på kjør-knappen på mikroskopet, og analyser resultatene etter fire timer. Etter å ha dissosiert organoidene som nevnt i teksten, kast supernatanten.Resuspender cellene i 80 mikroliter av elektroporasjonsbufferen. I et 1,5 milliliter rør, klargjør plasmidene som kreves for forsøket. Legg plasmidene til cellene, og bland godt ved å pipettere opp og ned.Sett opp elektroporatoren med parametrene for poringpuls og overføringspuls. Plasser cellene med plasmidene i en elektroporeringskuvett. Mål umiddelbart motstanden, som skal være mellom 0,3 ampere og 0,55 ampere, og elektroporer umiddelbart.Når du er ferdig, overfør cellene til et 1, 5 milliliter rør, og tilsett 400 mikroliter elektroporasjonsbuffer supplert med en Rho-kinasehemmer. La cellene komme seg ved romtemperatur i 30 minutter. Deretter pellet cellene ved 500g i fem minutter.Etter å ha kastet supernatanten, plate cellene i 200 mikroliter ECM. Etter størkning, legg til museutvidelsesmediet. For organoid forberedelse, splitt humane lacrimal kjertelorganoider omtrent tre dager før transplantasjonsdagen.For å trekke ut organoider fra ECM, tilsett dispase til kulturmediet for å nå en endelig konsentrasjon på 0,125 enheter per milliliter, og resuspender ECM-dråpene grundig for å forstyrre dem ved hjelp av en P1000. Plasser platen tilbake i 37-graders Celsius-inkubatoren i 30 minutter. Resuspender organoider i 10 ml basemedium for å vaske ut enzymet.Etter pelletering av cellene ved 400g i fem minutter, resuspender dem i 50 mikroliter kaldt humant ekspansjonsmedium supplert med 5% ECM. Plasser organoidsuspensjonen på is, og fortsett umiddelbart til transplantasjonen. For ortotopisk transplantasjon hos mus, aspirer organoidsuspensjonen i en insulinnål.Når musen sover, legg den raskt på siden med hoved lacrimal kjertelen tilgjengelig. Injiser fem mikroliter av organoidsuspensjonen direkte gjennom huden inn i lacrimal kjertelen. La musen komme seg, og vurder tilstedeværelsen av transplantasjonsrelatert ubehag daglig, spesielt i øyet.Etter disseksjon av musens lacrimal kjertel genererte den enzymatiske og mekaniske fordøyelsen små vevfragmenter, inkludert acini og kanalene. I den vellykkede musens lacrimal kjertelorganoidavledning ble cystiske organoider med ca. 500 mikrometer diameter funnet etter syv dager. Humane lacrimal kjertelorganoider vokste som cyster innen tre til fire dager og nådde en fullvoksen størrelse i 10 til 14 dager etter vevsisolering.Etter henholdsvis fem dager og syv dager, i differensieringsmediet, ble musen og humane lacrimal kjertelorganoider tettere. Bruk av den sykliske AMP-aktivatoren forskolin eller nevrotransmitteren noradrenalin resulterte i organoid hevelse innen mindre enn tre timer. Ved vellykket elektroporering vokste organoider som var resistente mot hygromycin ut.De voksende organoidklonene større enn 300 mikrometer ble plukket før differensieringen. PCR-forsterkning av Pax6-lokuset målrettet av guide-RNA ga et 367 baseparbånd for alle de valgte klonene. En homozygot knockout mus lacrimal kjertel klon ut av seks sekvenserte ble oppnådd ved hjelp av guiden RNA rettet mot Pax6.Noen kloner vokste godt ut, men noen organoide kloner gikk tapt etter plukking eller begynte å differensiere. Av de 10 organoidklonene som ble plukket ut, vokste syv godt ut. Organoid engraftment ble bekreftet en måned etter injeksjon av organoider i musens lacrimal kjertel ved farging for en human-spesifikk markør, det humane nukleolære antigenet.En ting å være oppmerksom på er ikke å fordøye vevet eller organoidene. Ellers kan cellene dø, og dette vil redusere organoidetableringshastigheten. Lakrimale kjertelorganoider kan analyseres ved histologi.Ved å gjøre det, kan man få innsikt i deres cellulære sammensetning.

Research

JoVE Journal

Biology

Generation of Human CD40-activated B cells

CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been identified as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cancer ...

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells  

Human embryonic stem (hES) cells must be monitored and cared for in order to maintain healthy, undifferentiated cultures. At minimum, the cultures must be ...

Isolation and Genetic Manipulation of Adult Cardiac Myocytes for Confocal Imaging

Cardiac myocytes isolated from adult hearts are widely accepted as a model somewhere half way between embryonic and neonatal muscle cells on one side and ...

Genetic Modification and Recombination of Salivary Gland Organ Cultures

Genmodifisering og Rekombinasjon av spyttkjertel Organ kulturer

Branching  morphogenesis occurs during the development of many organs, and the embryonic  mouse submandibular gland (SMG) is a classical model for the ...

Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells

Generation of Human Cardiomyocytes: En Differensiering Protokoll fra mater-frie menneskeskapte pluripotent stamceller

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is ...

Alternative Cultures for Human Pluripotent Stem Cell Production, Maintenance, and Genetic Analysis

Alternative Kulturer til human pluripotent Stem Cell produksjon, vedlikehold, og Genetic Analysis

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and ...

Manipulating the Murine Lacrimal Gland

Manipulere Murine Lacrimal Gland

The lacrimal gland (LG) secretes aqueous tears necessary for maintaining the structure and function of the cornea, a transparent tissue essential for ...

Establishment and Maintenance of Gnotobiotic American Cockroaches (Periplaneta americana)

Establishment and Maintenance of Gnotobiotic American Cockroaches Periplaneta americana

Etablering og vedlikehold av Gnotobiotic American Cockroaches (Periplaneta americana)

Gnotobiotic animals are a powerful tool for the study of controls on microbiome structure and function. Presented here is a protocol for the establishment ...

Establishment and Genetic Manipulation of Murine Hepatocyte Organoids

Etablering og genetisk manipulering av murin hepatocytt organoider

The liver is the largest organ in mammals. It plays an important role in glucose storage, protein secretion, metabolism and detoxification. As the ...

Three-Dimensional, Serum-Free Culture System for Lacrimal Gland Stem Cells

Tredimensjonalt, serumfritt kultursystem for stamceller med lacrimal kjertel

Lacrimal gland (LG) stem cell-based therapy is a promising strategy for lacrimal gland diseases. However, the lack of a reliable, serum-free culture ...