Name: establishment, maintenance, differentiation, genetic manipulation, and transplantation of mouse and human lacrimal gland organoids
Uploaded: 2023-02-03T14:15:00
Duration: 10 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Establishment, Maintenance, Differentiation, Genetic Manipulation, and Transplantation of Mouse and Human Lacrimal Gland Organoids at JoVE.com

Agradecemos a Yorick Post pelo desenvolvimento inicial do protocolo. Este trabalho foi em parte apoiado por um prêmio da Cancer Research UK Grand Challenge (C6307/A29058) e da Mark Foundation for Cancer Research para a equipe SPECIFICANCER.

<ol>
	<li>Garg, A., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lacrimal+gland+development:+From+signaling+interactions+to+regenerative+medicine.">Lacrimal gland development: From signaling interactions to regenerative medicine.</a> Developmental Dynamics. 246 (12), 970-980 (2017).</li><li>Selinger, D. S., Selinger, R. C., Reed, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resistance+to+infection+of+the+external+eye:+The+role+of+tears.">Resistance to infection of the external eye: The role of tears.</a> Survey of Ophthalmology. 24 (1), 33-38 (1979).</li><li>Messmer, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathophysiology,+diagnosis,+and+treatment+of+dry+eye+disease.">The pathophysiology, diagnosis, and treatment of dry eye disease.</a> Deutsches Arzteblatt International. 112 (5), 71-81 (2015).</li><li>Massie, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+lacrimal+gland+spheroids+for+lacrimal+gland+tissue+regeneration.">Development of lacrimal gland spheroids for lacrimal gland tissue regeneration.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (4), 2001-2009 (2018).</li><li>Tiwari, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+human+lacrimal+gland+cultures+with+secretory+function.">Establishing human lacrimal gland cultures with secretory function.</a> PloS One. 7 (1), 29458 (2012).</li><li>Nguyen, D. H., Beuerman, R. W., Halbert, C. L., Ma, Q., Sun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+immortalized+rabbit+lacrimal+gland+epithelial+cells.">Characterization of immortalized rabbit lacrimal gland epithelial cells.</a> In Vitro Cellular &amp; Developmental Biology. Animal. 35 (4), 198-204 (1999).</li><li>Bannier-H&#233;laou&#235;t, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+human+lacrimal+gland+using+organoids+and+single-cell+sequencing.">Exploring the human lacrimal gland using organoids and single-cell sequencing.</a> Cell Stem Cell. 28 (7), 1221-1232 (2021).</li><li>Hayashi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+3D+lacrimal+gland+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells.">Generation of 3D lacrimal gland organoids from human pluripotent stem cells.</a> Nature. 605 (7908), 126-131 (2022).</li><li>Jeong, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+functional+epithelial+organoids+from+human+lacrimal+glands.">Establishment of functional epithelial organoids from human lacrimal glands.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 12 (1), 247 (2021).</li><li>Hofer, M., Lutolf, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+organoids.">Engineering organoids.</a> Nature Reviews Materials. 6 (5), 402-420 (2021).</li><li>Meyenberg, M., Ferreira da Silva, J., Loizou, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+specific+DNA+repair+outcomes+shape+the+landscape+of+genome+editing.">Tissue specific DNA repair outcomes shape the landscape of genome editing.</a> Frontiers in Genetics. 12, 728520 (2021).</li><li>Geurts, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-based+adenine+editors+correct+nonsense+mutations+in+a+cystic+fibrosis+organoid+biobank.">CRISPR-based adenine editors correct nonsense mutations in a cystic fibrosis organoid biobank.</a> Cell Stem Cell. 26 (4), 503-510 (2020).</li><li>Overmyer, K. A., Thonusin, C., Qi, N. R., Burant, C. F., Evans, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+anesthesia+and+euthanasia+on+metabolomics+of+mammalian+tissues:+Studies+in+a+C57BL/6J+mouse+model.">Impact of anesthesia and euthanasia on metabolomics of mammalian tissues: Studies in a C57BL/6J mouse model.</a> PLoS One. 10 (2), 0117232 (2015).</li><li>Driehuis, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+mucosal+organoids+as+a+potential+platform+for+personalized+cancer+therapy.">Oral mucosal organoids as a potential platform for personalized cancer therapy.</a> Cancer Discovery. 9 (7), 852-871 (2019).</li><li>Froger, A., Hall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+plasmid+DNA+into+E.+coli+using+the+heat+shock+method.">Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method.</a> Journal of Visualized Experiments. (6), e253 (2007).</li><li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li><li>Lian, J., Meng, X., Zhang, X., Hu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+genetic+manipulation+of+murine+hepatocyte+organoids.">Establishment and genetic manipulation of murine hepatocyte organoids.</a> Journal of Visualized Experiments. (180), e62438 (2022).</li><li>L&#245;hmussaar, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+organoids+model+cervical+tissue+dynamics+and+viral+oncogenesis+in+cervical+cancer.">Patient-derived organoids model cervical tissue dynamics and viral oncogenesis in cervical cancer.</a> Cell Stem Cell. 28 (8), 1380-1396 (2021).</li><li>Bloh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deconvolution+of+complex+DNA+repair+(DECODR):+Establishing+a+novel+deconvolution+algorithm+for+comprehensive+analysis+of+CRISPR-edited+Sanger+sequencing+data.">Deconvolution of complex DNA repair (DECODR): Establishing a novel deconvolution algorithm for comprehensive analysis of CRISPR-edited Sanger sequencing data.</a> The CRISPR Journal. 4 (1), 120-131 (2021).</li><li>Latta, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiology+of+aniridia-associated+keratopathy:+Developmental+aspects+and+unanswered+questions.">Pathophysiology of aniridia-associated keratopathy: Developmental aspects and unanswered questions.</a> The Ocular Surface. 22, 245-266 (2021).</li><li>Veernala, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lacrimal+gland+regeneration:+The+unmet+challenges+and+promise+for+dry+eye+therapy.">Lacrimal gland regeneration: The unmet challenges and promise for dry eye therapy.</a> The Ocular Surface. 25, 129-141 (2022).</li><li>Hayashi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+3D+lacrimal+gland+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells.">Generation of 3D lacrimal gland organoids from human pluripotent stem cells.</a> Nature. 605 (7908), 126-131 (2022).</li></ol>

Hans Clevers é o chefe de Pesquisa Farmacêutica e Desenvolvimento Inicial na Roche, Basileia, e detém várias patentes relacionadas à tecnologia de organoides.

Este protocolo descreve o estabelecimento e o uso de organoides da glândula lacrimal para ensaios funcionais, modelagem de mutações e transplante. Ao estabelecer organoides da glândula lacrimal humana e de camundongos, a dissociação tecidual é crucial. Se o tecido não for suficientemente digerido, o rendimento organoide será baixo. Se o tecido for superdigerido, as células morrerão e não crescerão como organoides. Cada tecido deve ser digerido com uma enzima específica por um tempo específico para garantir o crescimento ideal dos organoides14,17,18. A glândula lacrimal é um tecido bastante mole para o qual uma digestão de colagenase de 5-10 min combinada com dissociação mecânica baseada em pipetagem é suficiente para isolar pequenos pedaços de tecido. Se células únicas precisarem ser obtidas para aplicações como o sequenciamento de RNA de célula única, a dissociação pode ser realizada por mais tempo até que o estágio de célula única seja atingido, mas a dissociação deve ser interrompida assim que células únicas forem obtidas para limitar qualquer diminuição na viabilidade. Como a dissociação tecidual é tão crucial, a digestão excessiva é a razão mais provável para a falha no estabelecimento organoide da glândula lacrimal.
A manutenção adequada dos organoides da glândula lacrimal é importante para o seu uso. A manutenção em longo prazo é uma característica dos organoides das glândulas lacrimais derivadas de células-tronco adultas, em comparação com organoides derivados de células-tronco pluripotentes induzidas 7,17. Para alcançar a manutenção a longo prazo, a divisão regular dos organoides e as mudanças médias devem ser realizadas. Sem isso, os organoides começam a se diferenciar e desenvolver diminuição do potencial das células-tronco, o que dificulta sua manutenção a longo prazo7. Nesta etapa novamente, a digestão excessiva pode matar as células-tronco e prejudicar a manutenção dos organoides. Para manutenção regular, a dissociação do organoide em células únicas não é necessária. No entanto, para gerar linhagens organoides nocaute clonal, é fundamental começar com células únicas. Caso contrário, os organoides serão constituídos por um mosaico de células com diferentes origens genéticas, impossibilitando a análise do efeito de uma única mutação definida. Aqui, descrevemos o uso de um editor de base C > T para gerar códons de parada. Este editor do genoma baseia-se na presença de arginina, glutamina, ou códons de triptofano dentro de 12-18 bases de um PAM NGG. Quando essas condições não são atendidas no projeto de um gRNA, editores convencionais de base Cas9 ou C>T com PAMs alternativos podem ser usados 7,18. No entanto, o Cas9 convencional introduz quebras de fita dupla que resultam em indels após o reparo11. Como ambos os alelos podem abrigar indéis diferentes, a genotipagem de clones requer cuidados adicionais. A deconvolução das modificações introduzidas deve ser realizada para garantir que ambos os alelos contenham indéis fora de quadro e, assim, que os clones organoides sejam nocauteados para o gene alvo19. A vantagem dos editores de base C > T reside no fato de que eles podem ser usados para modelar mutações pontuais que não resultam necessariamente em códons de parada. Por exemplo, eles podem ser usados para modelar mutações específicas da Pax6 encontradas em pacientes com aniridia para estudar seu impacto na fisiologia da glândula lacrimal20.
A glândula lacrimal secreta a parte aquosa do filme lacrimal1. A secreção lacrimal pode ser recapitulada em organoides humanos após diferenciação mediada pela retirada do fator de crescimento e inibição da NOTCH. Nessas condições, os organoides sofrem diferenciação terminal e não podem ser mantidos. No entanto, organoides diferenciados da glândula lacrimal podem guiar o desenvolvimento de drogas indutoras de lacrimejamento no contexto da doença do olho seco, potencialmente em telas de alto rendimento. O ensaio de lacrimejamento apresentado neste protocolo é o que atualmente proporciona a maior alteração no tamanho dos organoides em um curto espaço de tempo, o que facilita a quantificação no contexto de uma triagem de drogas 7,9,17.
A terapia com células-tronco é uma grande promessa para a regeneração da glândula lacrimal na doença do olho seco21. Organoides da glândula lacrimal derivados de células-tronco adultas podem ser um material fonte para tais aplicações. O protocolo aqui apresentado resulta na enxertia organoide da glândula lacrimal humana, principalmente na forma de cistos. Baixo enxerto organoide pode surgir devido a organoides sendo injetados no local errado. Treinar o procedimento de injeção com um corante permite o rastreamento do local de injeção e, em última análise, melhora a precisão da injeção. Alternativamente, a epiderme de camundongos pode ser incisada para ter acesso direto à glândula lacrimal, como feito em ratos antes de22. Este método leva mais tempo, mas pode ser mais preciso. Por outro lado, com o presente protocolo, os organoides não se integraram funcionalmente à glândula lacrimal de camundongos. Resultados semelhantes foram observados para o enxerto de glândula lacrimal derivado da iPSC22. O método de transplante poderia ser melhorado ferindo a glândula lacrimal com antecedência, usando um modelo de camundongo de olho seco e/ou injetando os organoides como células únicas ou pequenos aglomerados. No entanto, organoides da glândula lacrimal derivados de células-tronco adultas e o kit de ferramentas relacionado podem ser a base de futuras aplicações na pesquisa da glândula lacrimal e na medicina regenerativa.

A glândula lacrimal é o epitélio glandular responsável pela produção da maior parte da camada aquosa do filme lacrimal1. A camada aquosa do filme lacrimal não contém apenas água para lubrificar a superfície ocular, mas também um grande repertório de componentes antimicrobianos que protegem a superfície ocular deinfecções2. Quando a glândula lacrimal está danificada ou inflamada, ocorre a doença do olho seco, que resulta em desconforto para o paciente e pode, eventualmente, levar à perda da visão3. Ao longo dos anos, sistemas-modelo para estudar a glândula lacrimal, em particular a glândula humana, têm sido limitados 4,5,6. Isso tem contribuído para uma lacuna de conhecimento sobre a função da glândula lacrimal em condições fisiológicas e patológicas.
Recentemente, modelos in vitro têm sido desenvolvidos para estudar a glândula lacrimal em uma placa 7,8,9. Esses organoides da glândula lacrimal são derivados de células-tronco adultas cultivadas como estruturas tridimensionais em uma matriz extracelular suplementada com um coquetel de fatores de crescimento que sustenta suas capacidades regenerativas in vitro7. A vantagem dos organoides derivados de células-tronco adultas (ASC) é que eles podem ser mantidos por muito tempo enquanto recapitulam as características do tecido saudável. Esse tipo de organoide é composto exclusivamente por células epiteliais, ao contrário dos organoides derivados de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC), que também podem conter células estromais, por exemplo. Ao contrário dos organoides derivados de células-tronco pluripotentes (PSC), os organoides ASC são estabelecidos diretamente do tecido adulto e não requerem modificações genéticas para serem expandidos. Os organoides ASC expressam características do adulto10.
Este protocolo contém uma caixa de ferramentas para derivar organoides da glândula lacrimal do tecido primário humano e de camundongo. O protocolo descreve como melhorar ainda mais a funcionalidade dos organoides pela simples retirada do fator de crescimento e como provocar os organoides a secretar fluido lacrimal realizando um ensaio de inchaço. Este protocolo inclui adicionalmente um método de transfecção baseado em eletroporação para engenharia genética de organoides de camundongos usando editores de base derivados de CRISPR. Ao contrário do Cas9 convencional, o uso de editores de base permite a modificação de bases simples no genoma sem gerar uma quebra de fitadupla11,12. Finalmente, descreve-se o transplante ortotópico de organoides da glândula lacrimal humana em camundongos imunodeficientes e a subsequente avaliação histológica do enxerto. Esta ferramenta organoide da glândula lacrimal pode ser usada em pesquisas sobre regeneração e função da glândula lacrimal e para modelagem de doenças genéticas e inflamatórias.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL safe-lock centrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>EP0030 120.094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,3&#8242;-Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrate (DAB)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5637</td>
			<td>CAS: 868272-85-9 , CAUTION, 6 g/L solution can be stored aliquotted at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5x green GoTaq Flexi buffer</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M891A</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A83-01</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2939</td>
			<td>Store at -20 &#176;C, stock at 30 mM, 10000x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12634-010</td>
			<td>store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar plates containing Ampicillin</td>
			<td>Hubrecht Institute</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave VAPOUR-Line lite</td>
			<td>VWR chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>Store at -20 &#176;C, 50x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Micro-Fine insulin needle 1 mL</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>324825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop microscope DMI1</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumine (BSA)</td>
			<td>MP biomedicals</td>
			<td>160069</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BTXpress</td>
			<td>BTX</td>
			<td>MDS450805</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 mice</td>
			<td>Hubrecht Institute</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cassettes</td>
			<td>Klinipath</td>
			<td>410-02S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellBanker 1</td>
			<td>amsbio</td>
			<td>11910</td>
			<td>Cryopreservation medium, adhere to instructions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid monohydrate</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>0088</td>
			<td>CAS: 5949-29-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase I</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C9407</td>
			<td>Aliquots at 20 mg/mL, 20x, store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes 15 mL</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>5618-8271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes 50 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS430828-500EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips 24 mm x 50 mm</td>
			<td>Menzel-Gl&#228;zer</td>
			<td>BB024050S1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex Basement Membrane Extract (BME), Growth Factor Reduced, Type 2 - extracellular matrix</td>
			<td>R&#38;D Systems, Bio-Techne</td>
			<td>3533-001-02</td>
			<td>Store at -20 &#176;C, keep at 4 &#176;C for up to 1 month</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPT</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D5942</td>
			<td>Store at -20 &#176;C, stock at 10 mM, 1000x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium hydrogen phosphate anhydrous</td>
			<td>VWR chemicals</td>
			<td>28026.292</td>
			<td>CAS: 7558-79-4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Di-sodiumhydrogenphosphate dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71643</td>
			<td>CAS:10028-24-7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>17105-041</td>
			<td>Aliquots at 50 U/mL, store at -20 &#176;C until use, 400x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Scalpel Sterile N&#176; 10</td>
			<td>Swann Morton</td>
			<td>3033838</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DM4000 microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTPs 25 mM</td>
			<td>Promega</td>
			<td>U1420</td>
			<td>Mix all 4 nucleotides together, Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dpn1</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate-bufferd Saline (DPBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190144</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Easy strainers 70 &#181;m</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>542170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation cuvette</td>
			<td>Nepagene</td>
			<td>EC002S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EnVision+/HRP mouse</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>K400111-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 100%</td>
			<td>BOOM</td>
			<td>84045206;5000</td>
			<td>CAUTION, Use to prepare other Ethanol dilutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 70%</td>
			<td>BOOM</td>
			<td>84010059.5000</td>
			<td>CAUTION</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 96%</td>
			<td>BOOM</td>
			<td>84050065.5000</td>
			<td>CAUTION</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS FL Auto 2 Cell Imaging System</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Live-imaging brightfield microscrope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF10</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-26</td>
			<td>Store at -20 &#176;C, stock at 100 mg/mL in base medium, 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td>NIH, Fiji developers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution 4%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1.00496</td>
			<td>CAS: 50-00-0, CAUTION</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1099</td>
			<td>Store at -20 &#176;C, stock at 10 mM, 10000x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GoTaq G2 Flexi DNA Polymerase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M7805</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Haematoxylin</td>
			<td>VWR chemicals</td>
			<td>10047105</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td>Store at 4 &#176;C, 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histocore H and C, Tissue embedding machine</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate</td>
			<td>Meidax</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human nucleolar antigen antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab-190710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid 5 N</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10605882</td>
			<td>CAS: 7647-01-0, CAUTION</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxyde 30%</td>
			<td>Chem-lab</td>
			<td>CL00.2308.1000</td>
			<td>CAS: 7722-84-1, CAUTION</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygromycin B-gold</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ant-hg</td>
			<td>Stock at 100 mg/&#181;L, 1000x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygromycin resistance cassette-containing plasmid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Andersson-Rolf et al, Nature Methods, 2017. doi: 10.1038/nmeth.4156</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IsoFlo 100%</td>
			<td>Mecan</td>
			<td>5960501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB medium</td>
			<td>Hubrecht Institute</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 25 mM</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A351H</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome RM2235</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Midiprep DNA isolation kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>K210005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniprep DNA isolation kit</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>K210003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetylcysteine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9165</td>
			<td>Store at -20 &#176;C, stock at 500 mM, 400x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEPA21 electroporator</td>
			<td>Nepagene</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>N0636</td>
			<td>Store at -20 &#176;C, stock at 1M, 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOD Scid Gamma (NSG) mice</td>
			<td>Hubrecht Institute colony</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noggin conditioned medium</td>
			<td>U-Protein Express</td>
			<td>Custom order</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noradrenaline</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A7257</td>
			<td>Store at -20 &#176;C, stock at 100 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Memmert</td>
			<td></td>
			<td>Set at 58 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P20, P200 and P1000 pipettes</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin</td>
			<td>VWR chemicals</td>
			<td>10048502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipettes, glass plugged</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>1150-6973</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pax6_C&#62;T_F: AGACTGTTCCAGGATGGCTG&#160;</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pax6_C&#62;T_R: TCTCCTAGGTACTGGAAGCC&#160;</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCMV_ABEmax_P2A_GFP</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>112101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pertex</td>
			<td>Klinipath</td>
			<td>AM-08010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pFYF1320&#160;</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>47511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ant-pm-1</td>
			<td>1000X, store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prostaglandin E2 (PGE2)</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2296</td>
			<td>Store at -20 &#176;C, stock at 10 mM, 10000x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish, 10 cm</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>633102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B9027S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 high-fidelity DNA polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0491S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuickExtract DNA Extraction Solution</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>QE09050</td>
			<td>Store aliquots at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-spondin 3 conditioned medium</td>
			<td>U-Protein Express</td>
			<td>Custom order</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sgRNA Reverse Primer: TCTGCGCCCATCTGTTGCTT CGGTGTTTCGTCCTTTCCACAAG</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides</td>
			<td>StarFrost</td>
			<td>MBB-0302-55A</td>
			<td>Adhesive, ground</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8.22335.1000</td>
			<td>CAS: 26628-22-8, CAUTION</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium cytrate dihydrate</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>0280</td>
			<td>CAS: 6132-04-3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Forward Primer: &#8220;/5phos/ GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG 
			TTAAAATAAGGC</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Subcloning efficiency competent cells DH5alpha</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18265-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suspension cell culture plates (24-well)</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>662102</td>
			<td>24-well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suspension cell culture plates (12-well)</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>665102</td>
			<td>12-well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAE buffer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>B49</td>
			<td>Stock at 50x, dilute to 1x with ultrapure water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transposase-containing plasmid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Andersson-Rolf et al, Nature Methods, 2017. doi: 10.1038/nmeth.4156</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express Enzyme</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12605-028</td>
			<td>store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U6_Forward primer: GGGCAGGAAGAGGGCCTAT</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Agarose 1000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Tulabo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Klinipath</td>
			<td>4055-9005</td>
			<td>CAS: 1330-20-7, CAUTION</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Abmole Bioscience</td>
			<td>Y-27632 dihydrochloride</td>
			<td>Store at -20 &#176;C, stock at 10 mM, 1000x</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishment, maintenance, differentiation, genetic manipulation, and transplantation of mouse and human lacrimal gland organoids

A glândula lacrimal é um órgão essencial para a homeostase da superfície ocular. Ao produzir a parte aquosa do filme lacrimal, protege o olho do estresse de dessecação e insultos externos. Pouco se sabe sobre a (pato)fisiologia das glândulas lacrimais devido à falta de modelos in vitro adequados. A tecnologia organoide provou ser uma plataforma experimental útil para múltiplos órgãos. Aqui, compartilhamos um protocolo para estabelecer e manter organoides de glândulas lacrimais de camundongos e humanos a partir de biópsias de glândulas lacrimais. Ao modificar as condições de cultura, aumentamos a funcionalidade organoide da glândula lacrimal. A funcionalidade organoide pode ser investigada através de um ensaio de "choro", que envolve a exposição dos organoides da glândula lacrimal a neurotransmissores selecionados para desencadear a liberação de lágrimas em seu lúmen. Explicamos como imaginar e quantificar esse fenômeno. Para investigar o papel de genes de interesse na homeostase da glândula lacrimal, estes podem ser geneticamente modificados. Descrevemos detalhadamente como modificar geneticamente organoides da glândula lacrimal usando editores de base - desde o design de RNA guia até a genotipagem de clones organoides. Por fim, mostramos como sondar o potencial regenerativo de organoides da glândula lacrimal humana por implante ortotópico em camundongos. Juntos, este conjunto de ferramentas abrangente fornece recursos para usar organoides da glândula lacrimal humana e de camundongos para estudar a (pato)fisiologia da glândula lacrimal.

Após a dissecção da glândula lacrimal de camundongos (Figura 2A), a digestão enzimática e mecânica gerou pequenos fragmentos de tecido, entre os quais foi possível distinguir os ácinos e ductos (Figura 2B). Os grandes pedaços de tecido remanescentes desestabilizariam a MEC, o que reduziria o crescimento organoide inicial. A derivação organoide da glândula lacrimal de camundongo foi bem sucedida quando organoides císticos de ~500 μm de diâmetro foram encontrados após ~7 dias, estágio em que os organoides estavam prontos para serem divididos (Figura 2C). Mesmo que a derivação organoide geral seja bem-sucedida, alguns organoides podem começar a crescer antes de parar eventualmente. Os organoides da glândula lacrimal humana cresceram como cistos dentro de 3-4 dias e atingiram o tamanho completo em 10-14 dias após o isolamento do tecido (Figura 2D). Tanto para camundongos quanto para humanos, a derivação organoide às vezes falhava, com nenhum ou poucos organoides crescendo; Isso foi geralmente causado pela digestão excessiva do tecido. Os organoides da glândula lacrimal de camundongo poderiam ser passados pelo menos 40x e os organoides humanos pelo menos 20x. A passagem foi feita a cada 7-10 dias, em média, dependendo do crescimento organoide.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65040/65040fig02.jpg"> Figura 2: Estabelecimento dos organoides das glândulas lacrimais de camundongos e humanos. (A) Fotografias dos diferentes estágios da dissecção da glândula lacrimal de camundongos. A seta aponta para a glândula lacrimal sob sua membrana protetora. (B) Imagens de campo claro de células da glândula lacrimal de camundongos logo após a digestão do tecido, com inserções mostrando um ácino e um ducto. (C) Imagens de campo brilhante de uma derivação organoide da glândula lacrimal de camundongo bem-sucedida e malsucedida. (D) Imagens de campo claro do crescimento organoide humano ao longo de 14 dias. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65040/65040fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Os organoides da glândula lacrimal contêm uma grande proporção de células-tronco quando cultivadas no meio de expansão. Para aumentar seu nível de diferenciação, montamos um camundongo e um meio de diferenciação humano com reduzido teor de fator de crescimento. Após 5 e 7 dias, respectivamente, no meio de diferenciação, os organoides das glândulas lacrimais de camundongo e humano tornaram-se mais densos (Figura 3A-B). Essa alteração morfológica correlacionou-se com o aumento das propriedades funcionais. A aplicação do ativador cíclico de AMP forskolina ou do neurotransmissor noradrenalina resultou em inchaço organoide (isto é, secreção de água apical) em menos de 3 h (Figura 3C). Quando o inchaço demorava mais de 3-4 h, isso sugeria que os organoides não eram suficientemente diferenciados e/ou não expressavam marcadores funcionais, como receptores para neurotransmissores.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65040/65040fig03.jpg"> Figura 3: Diferenciação dos organoides das glândulas lacrimais de camundongos e humanos e ensaio de inchamento funcional em organoides humanos. (A) Imagens de campo claro de organoides da glândula lacrimal de camundongos cultivados em meio de expansão por 7 dias e em meio de diferenciação por 5 dias após 2 dias em meio de expansão. (B) Imagens de campo claro de organoides da glândula lacrimal humana cultivados em meio de expansão por 11 dias e em meio de diferenciação por 9 dias após 2 dias em meio de expansão. (C) Imagens de campo claro de organoides diferenciados da glândula lacrimal humana expostos a meio de diferenciação fresco (controle), a forskolina a 1 μM e a noradrenalina a 100 μM ao longo de 3 h. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65040/65040fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Para nocautear a Pax6 em organoides da glândula lacrimal de camundongos, um plasmídeo contendo o gRNA direcionado para Pax6 escolhido foi gerado por PCR e ligadura (Figura 4A). Este plasmídeo contendo gRNA foi eletroporado juntamente com os plasmídeos Piggy-Bac (plasmídeos contendo e contendo transposase de resistência à higromicina) e o editor de base C > T Cas9 em organoides da glândula lacrimal de camundongos dissociados em células únicas. Após 3 dias, quando os organoides se recuperaram, eles foram expostos à higromicina para selecionar clones que incorporaram o de resistência à higromicina. Em eletroporações bem-sucedidas, organoides resistentes à higromicina cresceram (Figura 4B). Os clones organoides em crescimento maiores que ~300 μm foram colhidos, idealmente antes de começarem a se diferenciar espontaneamente (Figura 4C). O DNA foi extraído de parte do organoide, mantendo-se o restante em cultura. A amplificação por PCR do locus Pax6 alvo do gRNA produziu uma banda de 367 pb para cada um dos clones escolhidos (Figura 4D). Após o sequenciamento do locus amplificado, clones homozigicamente editados em C > T (n = 1) foram mantidos. Por outro lado, clones não editados (n = 4), heterozigicamente editados ou editados incorretamente (n = 1) foram descartados (Figura 4E). Em geral, usando este gRNA visando Pax6, um clone homozigoto knock-out da glândula lacrimal de camundongo de seis sequenciados foi obtido. Alguns clones cresceram bem, mas alguns clones organoides foram perdidos após a colheita ou começaram a se diferenciar (Figura 4F). Dos 10 clones organoides colhidos, 7 cresceram bem.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65040/65040fig04.jpg"> Figura 4: Knock-out mediado por edição de base da Pax6 em organoides da glândula lacrimal de camundongos. (A) Traço de sequenciamento de Sanger do pFYF1320 após a integração correta do gRNA visando o locus Pax6. (B) Imagens de campo claro de organoides da glândula lacrimal de camundongos 5 dias após exposição à higromicina após eletroporação. Os organoides foram cultivados em meio de expansão de camundongos. À esquerda está um exemplo de eletroporação falhada, sem clone resistente à higromicina crescendo. À direita está um exemplo de eletroporação bem-sucedida, com vários clones organoides resistentes à higromicina sobrevivendo. (C) Imagens de campo brilhante de clones que devem ser escolhidos e clones que não devem ser selecionados. (D) Gel de agarose mostrando a amplificação do locus Pax6 alvo com o gRNA. Em verde, destaca-se a faixa do tamanho esperado de 367 pb. (E) Sequenciamento de Sanger de três clones organoides resistentes à higromicina. O clone superior não é editado. O clone do meio é uma edição C > T homozigótica e, portanto, um nocaute homozigoto. O clone de fundo apresenta duas mutações pontuais heterozigotas e é um knock-out heterozigoto ou um clone misto e foi editado erroneamente. (F) Imagens de campo brilhante dos clones organoides colhidos com vários níveis de crescimento. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65040/65040fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Por fim, para a realização do transplante ortotópico organoide da glândula lacrimal humana em camundongos, foram utilizados organoides com 3 dias de antecedência (< de 100 μm de diâmetro). O enxerto organoide foi confirmado 1 mês após a injeção dos organoides na glândula lacrimal de camundongos pela coloração para um marcador humano-específico, o antígeno nucleolar humano (Figura 5). A ausência de coloração puntiforme em todos os cortes da glândula lacrimal de camundongos significou a ausência de enxerto organoide humano.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65040/65040fig05.jpg"> Figura 5: Transplante de organoides da glândula lacrimal humana para a glândula lacrimal de camundongo. Coloração de glândulas lacrimais de camundongos transplantados para o marcador nucleolar humano para monitorar o enxerto 1 mês após o transplante. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65040/65040fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Tabela suplementar 1: Composição dos meios e buffers. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65040/Supplementary%20Table%201.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar esta tabela.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Establishment, Maintenance, Differentiation, Genetic Manipulation, and Transplantation of Mouse and Human Lacrimal Gland Organoids at JoVE.com

Establishment, Maintenance, Differentiation, Genetic Manipulation, and Transplantation of Mouse and Human Lacrimal Gland Organoids

Este protocolo descreve como estabelecer, manter, modificar geneticamente, diferenciar, caracterizar funcionalmente e transplantar organoides da glândula lacrimal derivados de tecido primário de camundongo e humano.

Estabelecimento, Manutenção, Diferenciação, Manipulação Genética e Transplante de Organoides de Glândulas Lacrimais de Camundongos e Humanos

The lacrimal gland is an essential organ for ocular surface homeostasis. By producing the aqueous part of the tear film, it protects the eye from ...

Com organoides da glândula lacrimal, pode-se olhar para como certos genes controlam a homeostase da glândula lacrimal. Além disso, os organoides podem ser usados para medicina regenerativa. A principal vantagem da tecnologia organoide da glândula lacrimal derivada de células-tronco adultas é que ela permite o crescimento e o estudo de células epiteliais saudáveis e não transformadas da glândula lacrimal.Esses organoides poderiam eventualmente ser usados para tratar pacientes com doença do olho seco. Comece preparando o meio e o material necessários para o experimento, seguido pela combinação de todos os componentes do meio de digestão antes do experimento. Pré-molhe os bisturis neste meio para evitar que pedaços de tecido grudem neles.Recupere o tecido da glândula lacrimal do camundongo do meio, coloque-o na placa de Petri e pique-o usando bisturis pré-molhados. Quando os pedaços de tecido tiverem menos de 0,5 milímetros cúbicos, raspe-os da placa de Petri com o bisturi e transfira-os para um tubo de 15 mililitros contendo o meio de digestão. Para uma biópsia humana muito pequena, coloque-o diretamente no meio de digestão sem picar.Incube o tubo de 15 mililitros com pedaços de tecido por até 15 minutos em banho-maria de 37 graus Celsius. Enquanto isso, reduza uma ponta de pipeta Pasteur em uma chama e pré-molhe-a no meio de base. Para facilitar o processo de dissociação, pipetar a mistura picada para cima e para baixo a cada cinco minutos com a pipeta Pasteur pré-molhada e estreitada.Quando muitas células únicas e pequenos aglomerados são visíveis sob o microscópio, pare a dissociação adicionando 10 mililitros do meio base. Depois de girar a 400g por cinco minutos, remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 10 mililitros do meio base para repetir a lavagem e pellet para baixo das células. Remova os pedaços de tecido grandes e não digeridos e as fibras de colágeno remanescentes filtrando a mistura picada através de um filtro de 70 micrômetros.Gire o eluato a 400g por cinco minutos. Após a remoção do sobrenadante, ressuspender o pellet de células em 100 microlitros de matriz extracelular fria, ou MEC, para uma única glândula lacrimal de camundongo e 50 microlitros de MEC fria para biópsia humana, sem criar as bolhas. Seme até 100 microlitros de células por poço de uma placa de suspensão de 12 poços usando um P200 para fazer gotículas de aproximadamente 20 microlitros no poço.Coloque a placa de cabeça para baixo em uma incubadora umidificada a 37 graus Celsius por 20 a 30 minutos para permitir a solidificação da MEC. Uma vez que o ECM esteja solidificado, adicione aproximadamente um mililitro de meio de expansão do mouse à temperatura ambiente por poço de uma placa de 12 poços. Preparar na hora um mililitro de meio de diferenciação humana contendo componentes individuais que induzem a secreção pelos organoides da glândula lacrimal.Em um microscópio automatizado de time-lapse de campo claro, defina as posições a serem fotografadas na placa, o intervalo de tempo de cinco minutos e a duração de quatro horas. Certifique-se de que uma gotícula ECM inteira esteja visível em cada posição. Antes de iniciar a obtenção de imagens, remova o meio de cultura dos poços a serem fotografados sem mover a placa do microscópio e substitua-o pelo meio de diferenciação humana recém-preparado e bem ressuspenso contendo compostos, incluindo forskolina e noradrenalina.Como controle negativo, inclua um poço com meio de diferenciação atualizado. Clique no botão Executar no microscópio e analise os resultados após quatro horas. Após dissociar os organoides mencionados no texto, descarte o sobrenadante.Ressuspender as células em 80 microlitros de tampão de eletroporação. Em um tubo de 1,5 mililitro, prepare os plasmídeos necessários para o experimento. Adicione os plasmídeos às células e misture bem, pipetando para cima e para baixo.Configure o eletroporador com os parâmetros para o pulso de poring e o pulso de transferência. Coloque as células com os plasmídeos em uma cubeta de eletroporação. Meça imediatamente a resistência, que deve estar entre 0,3 amperes e 0,55 amperes, e eletropore imediatamente.Uma vez feito, transfira as células para um tubo de 1,5 mililitro e adicione 400 microlitros de tampão de eletroporação suplementado com um inibidor de Rho-quinase. Deixe que as células se recuperem à temperatura ambiente por 30 minutos. Em seguida, pastilha as células a 500g por cinco minutos.Após o descarte do sobrenadante, plaquear as células em 200 microlitros de MEC. Após a solidificação, adicione o meio de expansão do mouse. Para a preparação de organoides, dividir os organoides da glândula lacrimal humana aproximadamente três dias antes do dia do transplante.Para extrair os organoides da MEC, adicione dispase ao meio de cultura para atingir uma concentração final de 0,125 unidades por mililitro e ressuspenda completamente as gotículas da MEC para interrompê-las usando um P1000. Coloque a placa de volta na incubadora de 37 graus Celsius por 30 minutos. Ressuspenda os organoides em 10 mililitros de meio base para lavar a enzima.Após peletização das células a 400g por cinco minutos, ressuspendê-las em 50 microlitros de meio de expansão humano a frio suplementado com 5% de MEC. Coloque a suspensão organoide no gelo e proceda imediatamente ao transplante. Para transplante ortotópico em camundongos, aspirar a suspensão organoide em uma agulha de insulina.Quando o rato estiver dormindo, coloque-o rapidamente de lado com a glândula lacrimal principal acessível. Injetar cinco microlitros da suspensão organoide diretamente através da pele na glândula lacrimal. Permita que o mouse se recupere e avalie a presença de qualquer desconforto relacionado ao transplante diariamente, especialmente no olho.Após a dissecção da glândula lacrimal de camundongos, a digestão enzimática e mecânica gerou pequenos fragmentos de tecido, incluindo os ácinos e os ductos. Na derivação organoide da glândula lacrimal de camundongo com sucesso, organoides císticos de aproximadamente 500 micrômetros de diâmetro foram encontrados após sete dias. Os organoides da glândula lacrimal humana cresceram como cistos dentro de três a quatro dias e atingiram um tamanho completo em 10 a 14 dias após o isolamento do tecido.Após cinco dias e sete dias, respectivamente, no meio de diferenciação, os organoides das glândulas lacrimais de camundongos e humanos tornaram-se mais densos. A aplicação do ativador cíclico AMP forskolina ou o neurotransmissor noradrenalina resultou em inchaço organoide em menos de três horas. Na eletroporação bem-sucedida, organoides resistentes à higromicina cresceram.Os clones organoides em crescimento maiores que 300 micrômetros foram colhidos antes de sua diferenciação. A amplificação por PCR do locus Pax6 alvo de RNA-guia produziu uma banda de 367 pares de bases para todos os clones selecionados. Um clone homozigoto knockout da glândula lacrimal de camundongos de seis sequenciados foi obtido usando o RNA guia direcionado para Pax6.Alguns clones cresceram bem, mas alguns clones organoides foram perdidos após a colheita ou começaram a se diferenciar. Dos 10 clones organoides colhidos, sete cresceram bem. O enxerto organoide foi confirmado um mês após a injeção dos organoides na glândula lacrimal de camundongos pela coloração para um marcador humano-específico, o antígeno nucleolar humano.Uma coisa a prestar atenção é não digerir excessivamente o tecido, nem os organoides. Caso contrário, as células poderiam morrer, e isso reduziria a taxa de estabelecimento de organoides. Os organoides das glândulas lacrimais podem ser analisados por histologia.Ao fazer isso, pode-se obter informações sobre sua composição celular.

Research

JoVE Journal

Biology

Generation of Human CD40-activated B cells

Geração de humanos CD40-activated células B

CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been identified as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cancer ...

Biologia

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells  

Cultura e Manutenção de células estaminais embrionárias humanas

Human embryonic stem (hES) cells must be monitored and cared for in order to maintain healthy, undifferentiated cultures. At minimum, the cultures must be ...

Isolation and Genetic Manipulation of Adult Cardiac Myocytes for Confocal Imaging

Isolamento e manipulação genética de adultos miócitos cardíacos for Imaging Confocal

Cardiac myocytes isolated from adult hearts are widely accepted as a model somewhere half way between embryonic and neonatal muscle cells on one side and ...

Genetic Modification and Recombination of Salivary Gland Organ Cultures

Modificação genética e recombinação de culturas de órgãos de glândula salivar

Branching  morphogenesis occurs during the development of many organs, and the embryonic  mouse submandibular gland (SMG) is a classical model for the ...

Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells

Geração de cardiomiócitos Humanos: Um Protocolo de Diferenciação de Feeder livres Humanos células-tronco pluripotentes induzidas

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is ...

Alternative Cultures for Human Pluripotent Stem Cell Production, Maintenance, and Genetic Analysis

Culturas alternativas para produção, manutenção e análise genética de células-tronco pluripotentes humanas

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and ...

Manipulating the Murine Lacrimal Gland

Manipulando o Murino lacrimais Gland

The lacrimal gland (LG) secretes aqueous tears necessary for maintaining the structure and function of the cornea, a transparent tissue essential for ...

Establishment and Maintenance of Gnotobiotic American Cockroaches (Periplaneta americana)

Establishment and Maintenance of Gnotobiotic American Cockroaches Periplaneta americana

Estabelecimento e Manutenção de Baratas Gnotobióticas Americanas (Periplaneta americana)

Gnotobiotic animals are a powerful tool for the study of controls on microbiome structure and function. Presented here is a protocol for the establishment ...

Establishment and Genetic Manipulation of Murine Hepatocyte Organoids

Estabelecimento e Manipulação Genética de Organoides Hepatocitos De Murine

The liver is the largest organ in mammals. It plays an important role in glucose storage, protein secretion, metabolism and detoxification. As the ...

Three-Dimensional, Serum-Free Culture System for Lacrimal Gland Stem Cells

Sistema de cultura tridimensional e livre de soro para células-tronco da glândula lacrimal

Lacrimal gland (LG) stem cell-based therapy is a promising strategy for lacrimal gland diseases. However, the lack of a reliable, serum-free culture ...