Name: establishment, maintenance, differentiation, genetic manipulation, and transplantation of mouse and human lacrimal gland organoids
Uploaded: 2023-02-03T14:15:00
Duration: 10 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Establishment, Maintenance, Differentiation, Genetic Manipulation, and Transplantation of Mouse and Human Lacrimal Gland Organoids at JoVE.com

Vi tackar Yorick Post för den inledande utvecklingen av protokollet. Detta arbete stöddes delvis av en utmärkelse från Cancer Research UK Grand Challenge (C6307/A29058) och Mark Foundation for Cancer Research till SPECIFICANCER-teamet.

<ol>
	<li>Garg, A., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lacrimal+gland+development:+From+signaling+interactions+to+regenerative+medicine.">Lacrimal gland development: From signaling interactions to regenerative medicine.</a> Developmental Dynamics. 246 (12), 970-980 (2017).</li><li>Selinger, D. S., Selinger, R. C., Reed, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resistance+to+infection+of+the+external+eye:+The+role+of+tears.">Resistance to infection of the external eye: The role of tears.</a> Survey of Ophthalmology. 24 (1), 33-38 (1979).</li><li>Messmer, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathophysiology,+diagnosis,+and+treatment+of+dry+eye+disease.">The pathophysiology, diagnosis, and treatment of dry eye disease.</a> Deutsches Arzteblatt International. 112 (5), 71-81 (2015).</li><li>Massie, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+lacrimal+gland+spheroids+for+lacrimal+gland+tissue+regeneration.">Development of lacrimal gland spheroids for lacrimal gland tissue regeneration.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (4), 2001-2009 (2018).</li><li>Tiwari, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+human+lacrimal+gland+cultures+with+secretory+function.">Establishing human lacrimal gland cultures with secretory function.</a> PloS One. 7 (1), 29458 (2012).</li><li>Nguyen, D. H., Beuerman, R. W., Halbert, C. L., Ma, Q., Sun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+immortalized+rabbit+lacrimal+gland+epithelial+cells.">Characterization of immortalized rabbit lacrimal gland epithelial cells.</a> In Vitro Cellular &amp; Developmental Biology. Animal. 35 (4), 198-204 (1999).</li><li>Bannier-H&#233;laou&#235;t, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+human+lacrimal+gland+using+organoids+and+single-cell+sequencing.">Exploring the human lacrimal gland using organoids and single-cell sequencing.</a> Cell Stem Cell. 28 (7), 1221-1232 (2021).</li><li>Hayashi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+3D+lacrimal+gland+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells.">Generation of 3D lacrimal gland organoids from human pluripotent stem cells.</a> Nature. 605 (7908), 126-131 (2022).</li><li>Jeong, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+functional+epithelial+organoids+from+human+lacrimal+glands.">Establishment of functional epithelial organoids from human lacrimal glands.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 12 (1), 247 (2021).</li><li>Hofer, M., Lutolf, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+organoids.">Engineering organoids.</a> Nature Reviews Materials. 6 (5), 402-420 (2021).</li><li>Meyenberg, M., Ferreira da Silva, J., Loizou, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+specific+DNA+repair+outcomes+shape+the+landscape+of+genome+editing.">Tissue specific DNA repair outcomes shape the landscape of genome editing.</a> Frontiers in Genetics. 12, 728520 (2021).</li><li>Geurts, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-based+adenine+editors+correct+nonsense+mutations+in+a+cystic+fibrosis+organoid+biobank.">CRISPR-based adenine editors correct nonsense mutations in a cystic fibrosis organoid biobank.</a> Cell Stem Cell. 26 (4), 503-510 (2020).</li><li>Overmyer, K. A., Thonusin, C., Qi, N. R., Burant, C. F., Evans, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+anesthesia+and+euthanasia+on+metabolomics+of+mammalian+tissues:+Studies+in+a+C57BL/6J+mouse+model.">Impact of anesthesia and euthanasia on metabolomics of mammalian tissues: Studies in a C57BL/6J mouse model.</a> PLoS One. 10 (2), 0117232 (2015).</li><li>Driehuis, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+mucosal+organoids+as+a+potential+platform+for+personalized+cancer+therapy.">Oral mucosal organoids as a potential platform for personalized cancer therapy.</a> Cancer Discovery. 9 (7), 852-871 (2019).</li><li>Froger, A., Hall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+plasmid+DNA+into+E.+coli+using+the+heat+shock+method.">Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method.</a> Journal of Visualized Experiments. (6), e253 (2007).</li><li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li><li>Lian, J., Meng, X., Zhang, X., Hu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+genetic+manipulation+of+murine+hepatocyte+organoids.">Establishment and genetic manipulation of murine hepatocyte organoids.</a> Journal of Visualized Experiments. (180), e62438 (2022).</li><li>L&#245;hmussaar, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+organoids+model+cervical+tissue+dynamics+and+viral+oncogenesis+in+cervical+cancer.">Patient-derived organoids model cervical tissue dynamics and viral oncogenesis in cervical cancer.</a> Cell Stem Cell. 28 (8), 1380-1396 (2021).</li><li>Bloh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deconvolution+of+complex+DNA+repair+(DECODR):+Establishing+a+novel+deconvolution+algorithm+for+comprehensive+analysis+of+CRISPR-edited+Sanger+sequencing+data.">Deconvolution of complex DNA repair (DECODR): Establishing a novel deconvolution algorithm for comprehensive analysis of CRISPR-edited Sanger sequencing data.</a> The CRISPR Journal. 4 (1), 120-131 (2021).</li><li>Latta, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiology+of+aniridia-associated+keratopathy:+Developmental+aspects+and+unanswered+questions.">Pathophysiology of aniridia-associated keratopathy: Developmental aspects and unanswered questions.</a> The Ocular Surface. 22, 245-266 (2021).</li><li>Veernala, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lacrimal+gland+regeneration:+The+unmet+challenges+and+promise+for+dry+eye+therapy.">Lacrimal gland regeneration: The unmet challenges and promise for dry eye therapy.</a> The Ocular Surface. 25, 129-141 (2022).</li><li>Hayashi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+3D+lacrimal+gland+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells.">Generation of 3D lacrimal gland organoids from human pluripotent stem cells.</a> Nature. 605 (7908), 126-131 (2022).</li></ol>

Hans Clevers är chef för Pharma Research and Early Development vid Roche, Basel, och innehar flera patent relaterade till organoidteknologi.

Detta protokoll beskriver etablering och användning av tårkörtelorganoider för funktionella analyser, mutationsmodellering och transplantation. Vid etablering av mus- och humana lacrimalkörtelorganoider är vävnadsdissociation avgörande. Om vävnaden inte smälts tillräckligt kommer organoidutbytet att vara lågt. Om vävnaden översmälts kommer cellerna att dö och inte växa ut som organoider. Varje vävnad bör smälta med ett specifikt enzym under en viss tid för att säkerställa optimal organoid utväxt14,17,18. Lacrimalkörteln är en ganska mjuk vävnad för vilken en kollagenasuppslutning på 5-10 min i kombination med pipetterbaserad mekanisk dissociation är tillräcklig för att isolera små bitar av vävnad. Om enskilda celler behöver erhållas för tillämpningar såsom encells-RNA-sekvensering kan dissociationen utföras längre tills encellsstadiet uppnås, men dissociationen bör stoppas så snart enskilda celler erhålls för att begränsa eventuell minskning av livsdugligheten. Eftersom vävnadsdissociation är så avgörande är över-digestion den mest troliga orsaken till misslyckandet av lacrimal körtel organoid etablering.
Lämpligt underhåll av lacrimal körtelorganoider är viktigt för deras användning. Långsiktigt underhåll är ett kännetecken för vuxna tårkörtelorganoider som härrör från stamceller, jämfört med inducerade pluripotenta stamcellsderiverade organoider 7,17. För att uppnå långsiktigt underhåll bör regelbunden organoiddelning och medieförändringar utföras. Utan detta börjar organoider differentiera och utveckla minskad stamcellspotential, vilket hindrar deras långsiktiga underhåll7. Vid detta steg igen kan övermatsmältning döda stamcellerna och försämra organoidunderhållet. För regelbundet underhåll krävs inte organoiddissociation i enskilda celler. Men för att generera klonala knock-out organoidlinjer är det viktigt att börja med enstaka celler. Om inte, kommer organoiderna att bestå av en mosaik av celler med olika genetisk bakgrund, vilket gör det omöjligt att analysera effekten av en enda, definierad mutation. Här beskriver vi användningen av en C- > T-basredigerare för att generera stoppkodoner. Denna genomredigerare förlitar sig på närvaron av arginin-, glutamin- eller tryptofankodon inom 12-18 baser från en NGG PAM. När dessa villkor inte är uppfyllda vid utformningen av ett gRNA kan konventionella Cas9- eller C >T-basredigerare med alternativa PAMs användas 7,18. Konventionell Cas9 introducerar dock dubbelsträngade brott som resulterar i indels vid reparation11. Eftersom båda allelerna kan ha olika indels, kräver klongenotypning ytterligare försiktighet. Dekonvolution av de införda modifieringarna bör utföras för att säkerställa att båda allelerna innehåller indels utanför ramen och därmed att organoidklonerna slås ut för den riktade genen19. Fördelen med C> T-basredigerare ligger i det faktum att de kan användas för att modellera punktmutationer som inte nödvändigtvis resulterar i stoppkodoner. De kan till exempel användas för att modellera specifika Pax6-mutationer som finns hos patienter med aniridi för att studera deras inverkan på tårkörtelns fysiologi20.
Lacrimalkörteln utsöndrar den vattenhaltiga delen av tårfilmen1. Tårsekretion kan rekapituleras i humana organoider efter differentiering medierad av tillväxtfaktoruttag och NOTCH-hämning. Under dessa förhållanden genomgår organoider terminal differentiering och kan inte bibehållas ytterligare. Ändå kan differentierade lacrimal körtelorganoider styra utvecklingen av rivinducerande läkemedel i samband med torra ögonsjukdomar, potentiellt i skärmar med hög genomströmning. Den rivningsanalys som presenteras i detta protokoll är den som för närvarande ger den största förändringen i organoidstorlek på kort tid, vilket gör det lättare att kvantifiera i samband med en läkemedelsskärm 7,9,17.
Stamcellsterapi är mycket lovande för tårkörtelregenerering vid torra ögonsjukdomar21. Vuxna stamcellshärledda tårkörtelorganoider kan vara ett källmaterial för sådana tillämpningar. Protokollet som presenteras här resulterar i mänsklig lacrimal körtelorganoid engraftment, mestadels som cystor. Låg organoidgravering kan uppstå på grund av att organoider injiceras på fel plats. Träning av injektionsproceduren med ett färgämne möjliggör spårning av injektionsstället och förbättrar i slutändan injektionsnoggrannheten. Alternativt kan musepidermis skäras för att ha direkt tillgång till tårkörteln, vilket görs hos råttor före22. Den här metoden tar längre tid men kan vara mer exakt. Å andra sidan, med det nuvarande protokollet, integrerades organoiderna inte funktionellt i musens lacrimalkörtel. Liknande resultat har observerats för iPSC-härledd tårkörtelgravering22. Transplantationsmetoden kan förbättras ytterligare genom att skada tårkörteln i förväg, med hjälp av en musmodell med torra ögon, och/eller injicera organoiderna som enstaka celler eller små klumpar. Ändå kan vuxna stamcellshärledda tårkörtelorganoider och den relaterade verktygslådan ligga till grund för framtida tillämpningar inom tårkörtelforskning och regenerativ medicin.

Lacrimalkörteln är det glandulära epitelet som är ansvarigt för att producera det mesta av det vattenhaltiga skiktet i tårfilmen1. Tårfilmens vattenhaltiga skikt innehåller inte bara vatten för att smörja ögonytan utan också en stor repertoar av antimikrobiella komponenter som skyddar ögonytan från infektioner2. När tårkörteln är skadad eller inflammerad uppstår torr ögonsjukdom, vilket resulterar i obehag för patienter och kan så småningom leda till synförlust3. Under årens lopp har modellsystem för att studera tårkörteln, särskilt den mänskliga körteln, begränsats 4,5,6. Detta har bidragit till en kunskapslucka om tårkörtelns funktion under fysiologiska och patologiska tillstånd.
Nyligen har in vitro-modeller utvecklats för att studera tårkörteln i en maträtt 7,8,9. Dessa tårkörtelorganoider härrör från vuxna stamceller odlade som tredimensionella strukturer i en extracellulär matris kompletterad med en cocktail av tillväxtfaktorer som upprätthåller deras regenerativa kapacitet in vitro7. Fördelen med vuxna stamceller (ASC)-härledda organoider är att de kan bibehållas under mycket lång tid samtidigt som friska vävnadsegenskaper rekapituleras. Denna typ av organoid består enbart av epitelceller, till skillnad från inducerade pluripotenta stamceller (iPSC)-härledda organoider, som också kan innehålla stromaceller, till exempel. Till skillnad från pluripotenta stamcellsbaserade organoider etableras ASC-organoider direkt från vuxen vävnad och kräver inga genetiska modifieringar för att expanderas. ASC-organoider uttrycker vuxna egenskaper10.
Detta protokoll innehåller en verktygslåda för att härleda tårkörtelorganoider från mus och mänsklig primärvävnad. Protokollet beskriver hur man ytterligare förbättrar organoidernas funktionalitet genom enkel tillbakadragande av tillväxtfaktor och hur man provocerar organoiderna att utsöndra tårvätska genom att utföra en svullnadsanalys. Detta protokoll innehåller dessutom en elektroporeringsbaserad transfektionsmetod för att genetiskt manipulera musorganoider med hjälp av CRISPR-härledda basredigerare. Till skillnad från konventionella Cas9 tillåter användningen av basredigerare modifiering av enstaka baser i genomet utan att generera en dubbelsträngad brytning11,12. Slutligen beskrivs ortotopisk transplantation av humana tårkörtelorganoider till immunbristfälliga möss och den efterföljande histologiska bedömningen av engraftmentet. Denna lacrimal gland organoid toolkit kan användas i forskning om lacrimal körtel regenerering och funktion och för genetisk och inflammatorisk sjukdom modellering.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL safe-lock centrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>EP0030 120.094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,3&#8242;-Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrate (DAB)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5637</td>
			<td>CAS: 868272-85-9 , CAUTION, 6 g/L solution can be stored aliquotted at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5x green GoTaq Flexi buffer</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M891A</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A83-01</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2939</td>
			<td>Store at -20 &#176;C, stock at 30 mM, 10000x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12634-010</td>
			<td>store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar plates containing Ampicillin</td>
			<td>Hubrecht Institute</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave VAPOUR-Line lite</td>
			<td>VWR chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>Store at -20 &#176;C, 50x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Micro-Fine insulin needle 1 mL</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>324825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop microscope DMI1</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumine (BSA)</td>
			<td>MP biomedicals</td>
			<td>160069</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BTXpress</td>
			<td>BTX</td>
			<td>MDS450805</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 mice</td>
			<td>Hubrecht Institute</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cassettes</td>
			<td>Klinipath</td>
			<td>410-02S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellBanker 1</td>
			<td>amsbio</td>
			<td>11910</td>
			<td>Cryopreservation medium, adhere to instructions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid monohydrate</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>0088</td>
			<td>CAS: 5949-29-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase I</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C9407</td>
			<td>Aliquots at 20 mg/mL, 20x, store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes 15 mL</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>5618-8271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes 50 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS430828-500EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips 24 mm x 50 mm</td>
			<td>Menzel-Gl&#228;zer</td>
			<td>BB024050S1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex Basement Membrane Extract (BME), Growth Factor Reduced, Type 2 - extracellular matrix</td>
			<td>R&#38;D Systems, Bio-Techne</td>
			<td>3533-001-02</td>
			<td>Store at -20 &#176;C, keep at 4 &#176;C for up to 1 month</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPT</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D5942</td>
			<td>Store at -20 &#176;C, stock at 10 mM, 1000x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium hydrogen phosphate anhydrous</td>
			<td>VWR chemicals</td>
			<td>28026.292</td>
			<td>CAS: 7558-79-4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Di-sodiumhydrogenphosphate dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71643</td>
			<td>CAS:10028-24-7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>17105-041</td>
			<td>Aliquots at 50 U/mL, store at -20 &#176;C until use, 400x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Scalpel Sterile N&#176; 10</td>
			<td>Swann Morton</td>
			<td>3033838</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DM4000 microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTPs 25 mM</td>
			<td>Promega</td>
			<td>U1420</td>
			<td>Mix all 4 nucleotides together, Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dpn1</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate-bufferd Saline (DPBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190144</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Easy strainers 70 &#181;m</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>542170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation cuvette</td>
			<td>Nepagene</td>
			<td>EC002S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EnVision+/HRP mouse</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>K400111-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 100%</td>
			<td>BOOM</td>
			<td>84045206;5000</td>
			<td>CAUTION, Use to prepare other Ethanol dilutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 70%</td>
			<td>BOOM</td>
			<td>84010059.5000</td>
			<td>CAUTION</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 96%</td>
			<td>BOOM</td>
			<td>84050065.5000</td>
			<td>CAUTION</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS FL Auto 2 Cell Imaging System</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Live-imaging brightfield microscrope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF10</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-26</td>
			<td>Store at -20 &#176;C, stock at 100 mg/mL in base medium, 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td>NIH, Fiji developers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution 4%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1.00496</td>
			<td>CAS: 50-00-0, CAUTION</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1099</td>
			<td>Store at -20 &#176;C, stock at 10 mM, 10000x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GoTaq G2 Flexi DNA Polymerase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M7805</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Haematoxylin</td>
			<td>VWR chemicals</td>
			<td>10047105</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td>Store at 4 &#176;C, 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histocore H and C, Tissue embedding machine</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate</td>
			<td>Meidax</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human nucleolar antigen antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab-190710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid 5 N</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10605882</td>
			<td>CAS: 7647-01-0, CAUTION</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxyde 30%</td>
			<td>Chem-lab</td>
			<td>CL00.2308.1000</td>
			<td>CAS: 7722-84-1, CAUTION</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygromycin B-gold</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ant-hg</td>
			<td>Stock at 100 mg/&#181;L, 1000x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygromycin resistance cassette-containing plasmid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Andersson-Rolf et al, Nature Methods, 2017. doi: 10.1038/nmeth.4156</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IsoFlo 100%</td>
			<td>Mecan</td>
			<td>5960501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB medium</td>
			<td>Hubrecht Institute</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 25 mM</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A351H</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome RM2235</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Midiprep DNA isolation kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>K210005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniprep DNA isolation kit</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>K210003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetylcysteine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9165</td>
			<td>Store at -20 &#176;C, stock at 500 mM, 400x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEPA21 electroporator</td>
			<td>Nepagene</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>N0636</td>
			<td>Store at -20 &#176;C, stock at 1M, 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOD Scid Gamma (NSG) mice</td>
			<td>Hubrecht Institute colony</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noggin conditioned medium</td>
			<td>U-Protein Express</td>
			<td>Custom order</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noradrenaline</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A7257</td>
			<td>Store at -20 &#176;C, stock at 100 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Memmert</td>
			<td></td>
			<td>Set at 58 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P20, P200 and P1000 pipettes</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin</td>
			<td>VWR chemicals</td>
			<td>10048502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipettes, glass plugged</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>1150-6973</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pax6_C&#62;T_F: AGACTGTTCCAGGATGGCTG&#160;</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pax6_C&#62;T_R: TCTCCTAGGTACTGGAAGCC&#160;</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCMV_ABEmax_P2A_GFP</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>112101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pertex</td>
			<td>Klinipath</td>
			<td>AM-08010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pFYF1320&#160;</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>47511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ant-pm-1</td>
			<td>1000X, store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prostaglandin E2 (PGE2)</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2296</td>
			<td>Store at -20 &#176;C, stock at 10 mM, 10000x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish, 10 cm</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>633102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B9027S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 high-fidelity DNA polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0491S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuickExtract DNA Extraction Solution</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>QE09050</td>
			<td>Store aliquots at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-spondin 3 conditioned medium</td>
			<td>U-Protein Express</td>
			<td>Custom order</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sgRNA Reverse Primer: TCTGCGCCCATCTGTTGCTT CGGTGTTTCGTCCTTTCCACAAG</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides</td>
			<td>StarFrost</td>
			<td>MBB-0302-55A</td>
			<td>Adhesive, ground</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8.22335.1000</td>
			<td>CAS: 26628-22-8, CAUTION</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium cytrate dihydrate</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>0280</td>
			<td>CAS: 6132-04-3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Forward Primer: &#8220;/5phos/ GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG 
			TTAAAATAAGGC</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Subcloning efficiency competent cells DH5alpha</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18265-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suspension cell culture plates (24-well)</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>662102</td>
			<td>24-well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suspension cell culture plates (12-well)</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>665102</td>
			<td>12-well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAE buffer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>B49</td>
			<td>Stock at 50x, dilute to 1x with ultrapure water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transposase-containing plasmid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Andersson-Rolf et al, Nature Methods, 2017. doi: 10.1038/nmeth.4156</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express Enzyme</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12605-028</td>
			<td>store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U6_Forward primer: GGGCAGGAAGAGGGCCTAT</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Agarose 1000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Tulabo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Klinipath</td>
			<td>4055-9005</td>
			<td>CAS: 1330-20-7, CAUTION</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Abmole Bioscience</td>
			<td>Y-27632 dihydrochloride</td>
			<td>Store at -20 &#176;C, stock at 10 mM, 1000x</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishment, maintenance, differentiation, genetic manipulation, and transplantation of mouse and human lacrimal gland organoids

Lacrimalkörteln är ett viktigt organ för okulär ythomeostas. Genom att producera den vattenhaltiga delen av tårfilmen skyddar den ögat från uttorkningsstress och yttre förolämpningar. Lite är känt om tårkörtelns (pato)fysiologi på grund av bristen på adekvata in vitro-modeller . Organoidteknik har visat sig vara en användbar experimentell plattform för flera organ. Här delar vi ett protokoll för att upprätta och underhålla mus- och humana lacrimal körtelorganoider från lacrimal körtelbiopsier. Genom att modifiera odlingsförhållandena förbättrar vi tårkörtelorganoidfunktionaliteten. Organoid funktionalitet kan undersökas genom en "gråt" analys, vilket innebär att lacrimal körtelorganoider exponeras för utvalda neurotransmittorer för att utlösa tårfrisättning i deras lumen. Vi förklarar hur man avbildar och kvantifierar detta fenomen. För att undersöka rollen av gener av intresse för tårkörtelhomeostas kan dessa modifieras genetiskt. Vi beskriver grundligt hur man genetiskt modifierar tårkörtelorganoider med hjälp av basredigerare - från guide RNA-design till organoid klongenotypning. Slutligen visar vi hur man undersöker den regenerativa potentialen hos humana lacrimal körtelorganoider genom ortotopisk implantation i musen. Tillsammans ger denna omfattande verktygssats resurser för att använda mus- och humana tårkörtelorganoider för att studera tårkörtelfysiologi.

Efter dissektion av muskrackkörteln (figur 2A) genererade den enzymatiska och mekaniska nedbrytningen små vävnadsfragment, bland vilka acini och kanalerna kunde särskiljas (figur 2B). De återstående stora vävnadsbitarna skulle destabilisera ECM, vilket skulle minska initial organoid utväxt. Muskrackkörtelorganoidhärledningen lyckades när cystiska organoider med ~ 500 μm diameter hittades efter ~ 7 dagar, det stadium där organoiderna var redo att delas (figur 2C). Även om den övergripande organoidhärledningen är framgångsrik kan vissa organoider börja växa innan de slutar så småningom. Humana lacrimal körtelorganoider växte ut som cystor inom 3-4 dagar och nådde fullvuxen storlek inom 10-14 dagar efter vävnadsisolering (figur 2D). För både möss och människor misslyckades organoidhärledning ibland, med inga eller få organoider som växte ut; Detta orsakades i allmänhet av översmältning av vävnaden. Muskas lacrimal körtelorganoider kan passeras minst 40x och de mänskliga organoiderna minst 20x. Passaging gjordes var 7-10 dagar i genomsnitt, beroende på organoid tillväxt.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65040/65040fig02.jpg"> Figur 2: Etablering av tårkörtelorganoider från möss och människa. a) Fotografier av de olika stadierna av tårkörteldissektion hos möss. Pilen pekar på lacrimalkörteln under dess skyddande membran. (B) Brightfield-bilder av tårkörtelceller från möss direkt efter vävnadsuppslutning, med insatser som visar en acinus och en kanal. (C) Brightfield-bilder av en framgångsrik och en misslyckad tårkörtelorganoid härledning från musen. (D) Brightfield-bilder av utväxt av mänsklig organoid under 14 dagar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65040/65040fig02large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
Tårkörtelorganoiderna innehåller en stor andel stamceller när de odlas i expansionsmediet. För att öka deras differentieringsnivå satte vi upp en mus och ett mänskligt differentieringsmedium med reducerat tillväxtfaktorinnehåll. Efter 5 dagar respektive 7 dagar i differentieringsmediet blev mus- och humana lacrimalkörtelorganoider tätare (figur 3A-B). Denna morfologiska förändring korrelerade med ökade funktionella egenskaper. Applicering av den cykliska AMP-aktivatorn forskolin eller signalsubstansen noradrenalin resulterade i organoid svullnad (dvs apikal vattensekretion) inom mindre än 3 timmar (figur 3C). När svullnaden tog längre tid än 3-4 timmar föreslog detta att organoiderna inte var tillräckligt differentierade och / eller inte uttryckte funktionella markörer, såsom receptorer för neurotransmittorer.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65040/65040fig03.jpg"> Figur 3: Differentiering av tårkörtelorganoider hos mus och människa och funktionell svullnadsanalys i humana organoider. (A) Brightfield-bilder av tårkörtelorganoider från möss odlade i expansionsmedium i 7 dagar och i differentieringsmedium i 5 dagar efter 2 dagar i expansionsmedium. (B) Brightfield-bilder av humana tårkörtelorganoider odlade i expansionsmedium i 11 dagar och i differentieringsmedium i 9 dagar efter 2 dagar i expansionsmedium. (C) Brightfield-bilder av differentierade humana tårkörtelorganoider exponerade för färskt differentieringsmedium (kontroll), till 1 μM forskolin och till 100 μM noradrenalin under loppet av 3 timmar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65040/65040fig03large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
För att slå ut Pax6 i tårkörtelorganoider hos möss genererades en plasmid innehållande det valda Pax6-riktade gRNA genom PCR och ligering (figur 4A). Denna gRNA-innehållande plasmid elektroporerades tillsammans med Piggy-Bac-plasmiderna (hygromycinresistenstransposoninnehållande och transposasinnehållande plasmider) och C> T-basredigeraren Cas9 i tårkörtelorganoider hos möss dissocierade i enskilda celler. Efter 3 dagar, när organoiderna hade återhämtat sig, exponerades de för hygromycin för att välja kloner som hade införlivat hygromycinresistenskassetten. I framgångsrika elektroporationer växte organoider resistenta mot hygromycin ut (figur 4B). De växande organoidklonerna som var större än ~ 300 μm plockades, helst innan de började spontant differentiera (figur 4C). DNA extraherades från en del av organoiden medan resten hölls i odling. PCR-amplifieringen av Pax6-lokus riktad mot gRNA gav ett 367 bp-band för var och en av de valda klonerna (figur 4D). Efter sekvensering av den förstärkta platsen behölls kloner som var homozygously C > T redigerade (n = 1). Å andra sidan kasserades kloner som inte redigerades (n = 4), redigerades heterozygt eller felaktigt redigerades (n = 1) (figur 4E). Sammantaget, med användning av detta gRNA riktat mot Pax6, erhölls en homozygot knock-out mus lacrimal körtelklon av sex sekvenserade. Vissa kloner växte ut bra, men vissa organoidkloner förlorades efter plockning eller började differentiera (figur 4F). Av de 10 organoidkloner som valdes växte 7 ut bra.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65040/65040fig04.jpg"> Figur 4: Basredigeringsmedierad knock-out av Pax6 i tårkörtelorganoider hos möss. (A) Sanger-sekvenseringsspår av pFYF1320 efter korrekt integration av gRNA som riktar sig mot Pax6-lokusen. (B) Brightfield-bilder av tårkörtelorganoider hos möss 5 dagar efter exponering för hygromycin efter elektroporering. Organoiderna odlades i musexpansionsmedium. Till vänster är ett exempel på en misslyckad elektroporering, utan klon resistent mot hygromycin som växer ut. Till höger är ett exempel på en framgångsrik elektroporering, med flera hygromycinresistenta organoidkloner överlevande. (C) Brightfield-bilder av kloner som bör plockas och kloner som inte bör plockas. (D) Agarosgel som visar amplifieringen av Pax6-lokus riktad mot gRNA. I grönt markeras bandet med den förväntade storleken 367 bp. (E) Sangersekvenseringsspår av tre organoidkloner som var resistenta mot hygromycin. Den översta klonen är oredigerad. Den mellersta klonen är en homozygot C- > T-utgåva och därmed en homozygot knock-out. Den nedre klonen presenterar två heterozygota punktmutationer och är antingen en heterozygot knock-out eller en blandad klon och har felaktigt redigerats. (F) Brightfield-bilder av de plockade organoidklonerna med olika nivåer av utväxt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65040/65040fig04large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
Slutligen, för att utföra human lacrimal körtel organoid ortotopisk transplantation hos möss, användes organoider som delades 3 dagar i förväg (< 100 μm i diameter). Organoidgravering bekräftades 1 månad efter injektion av organoiderna i tårkörteln hos möss genom färgning för en humanspecifik markör, det humana nukleolära antigenet (figur 5). Frånvaron av punkterad färgning från alla delar av musens lacrimal körtel innebar brist på mänsklig organoid engraftment.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65040/65040fig05.jpg"> Figur 5: Transplantation av humana tårkörtelorganoider i tårkörteln hos möss. Färgning av transplanterade muskrackkörtlar för den humana nukleolära markören för att övervaka engraftment 1 månad efter transplantation. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65040/65040fig05large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
Kompletterande tabell 1: Mediernas och buffertarnas sammansättning. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65040/Supplementary%20Table%201.xlsx" target="_blank">Klicka här för att ladda ner denna tabell.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Establishment, Maintenance, Differentiation, Genetic Manipulation, and Transplantation of Mouse and Human Lacrimal Gland Organoids at JoVE.com

Establishment, Maintenance, Differentiation, Genetic Manipulation, and Transplantation of Mouse and Human Lacrimal Gland Organoids

Detta protokoll beskriver hur man etablerar, underhåller, genetiskt modifierar, differentierar, funktionellt karakteriserar och transplanterar tårkörtelorganoider härrörande från primär mus- och humanvävnad.

Etablering, underhåll, differentiering, genetisk manipulation och transplantation av tårkörtelorganoider från möss och människa

The lacrimal gland is an essential organ for ocular surface homeostasis. By producing the aqueous part of the tear film, it protects the eye from ...

Med lacrimal körtelorganoider kan man undersöka hur vissa gener styr tårkörtelhomeostas. Dessutom kan organoiderna användas för regenerativ medicin. Den största fördelen med vuxen stamcellshärledd lacrimal körtelorganoidteknik är att den möjliggör tillväxt och studier av friska och icke-transformerade lacrimal körtelepitelceller.Dessa organoider kan så småningom användas för att behandla patienter med torra ögonsjukdomar. Börja med att förbereda mediet och materialet som krävs för experimentet, följt av att kombinera alla komponenter i matsmältningsmediet före experimentet. Förblöt skalpellerna i detta medium för att undvika att vävnadsbitar fastnar på dem.Hämta musens tårkörtelvävnad från mediet, placera den i petriskålen och hacka den med förfuktade skalpeller. När vävnadsbitarna är mindre än 0,5 kubikmillimeter, skrapa dem från petriskålen med skalpellen och överför dem till ett 15-milliliter rör som innehåller matsmältningsmediet. För en mycket liten mänsklig biopsi, placera den direkt i matsmältningsmediet utan att haka.Inkubera 15-milliliterröret med vävnadsbitar i upp till 15 minuter i ett 37-graders Celsius vattenbad. Under tiden smalnar du en Pasteur-pipettspets i en låga och förblöter den i basmediet. För att underlätta dissociationsprocessen, pipettera den malet blandningen upp och ner var femte minut med den förfuktade, smalare Pasteurpipetten.När många enskilda celler och små klumpar är synliga under mikroskopet, stoppa dissociationen genom att tillsätta 10 ml av basmediet. Efter att ha snurrat ner vid 400 g i fem minuter, ta bort supernatanten och återsuspendera pelleten i 10 ml av basmediet för att upprepa tvätten och pelleten ner i cellerna. Ta bort de stora, osmälta vävnadsbitarna och återstående kollagenfibrer genom att filtrera den malet blandningen genom en sil på 70 mikrometer.Snurra eluatet vid 400 g i fem minuter. Efter avlägsnande av supernatanten, resuspendera cellpelleten i 100 mikroliter kall extracellulär matris, eller ECM, för en enda muskrackkörtel och 50 mikroliter kall ECM för en human biopsi, utan att skapa bubblorna. Frö upp till 100 mikroliter celler per brunn av en 12-brunns suspensionsplatta med en P200 för att göra cirka 20 mikroliter droppar i brunnen.Placera plattan upp och ner i en fuktad inkubator vid 37 grader Celsius i 20 till 30 minuter för att tillåta ECM-stelning. När ECM har stelnat, tillsätt ungefär en milliliter rumstemperatur musexpansionsmedium per brunn på en 12-brunnsplatta. Förbered nyligen en milliliter humant differentieringsmedium innehållande enskilda komponenter som inducerar utsöndring av lacrimalkörtelorganoiderna.Vid ett automatiserat ljusfältstidsfördröjningsmikroskop ställer du in positionerna som ska avbildas i plattan, tidsintervallet på fem minuter och varaktigheten på fyra timmar. Se till att en hel ECM-droppe är synlig vid varje position. Innan du börjar avbilda, ta bort odlingsmediet från brunnarna som ska avbildas utan att flytta plattan från mikroskopet och ersätt det med det nyberedda, väl återsuspenderade humana differentieringsmediet som innehåller föreningar, inklusive forskolin och noradrenalin.Som en negativ kontroll, inkludera en brunn med uppdaterat differentieringsmedium. Klicka på körknappen på mikroskopet och analysera resultaten efter fyra timmar. Efter att ha dissocierat organoiderna som nämns i texten, kassera supernatanten.Resuspendera cellerna i 80 mikroliter av elektroporationsbufferten. I ett 1,5 ml rör, förbered plasmiderna som krävs för experimentet. Tillsätt plasmiderna till cellerna och blanda väl genom pipettering upp och ner.Ställ in elektroporatorn med parametrarna för poreringspuls och överföringspuls. Placera cellerna med plasmiderna i en elektroporeringskyvett. Mät omedelbart motståndet, som bör vara mellan 0,3 ampère och 0,55 ampère, och elektroporat omedelbart.När du är klar, överför cellerna till ett 1,5-milliliter rör och tillsätt 400 mikroliter elektroporeringsbuffert kompletterad med en Rho-kinashämmare. Låt cellerna återhämta sig vid rumstemperatur i 30 minuter. Därefter pellet cellerna vid 500g i fem minuter.Efter kassering av supernatanten, platta cellerna i 200 mikroliter ECM. Efter stelning, tillsätt musens expansionsmedium. För organoidberedning, dela de humana lacrimalkörtelorganoiderna ungefär tre dagar före transplantationsdagen.För att extrahera organoiderna från ECM, tillsätt dispase till odlingsmediet för att nå en slutlig koncentration av 0,125 enheter per milliliter och resuspendera ECM-dropparna noggrant för att störa dem med en P1000. Sätt tillbaka plattan i 37-graders Celsius-inkubatorn i 30 minuter. Resuspendera organoiderna i 10 ml basmedium för att tvätta ut enzymet.Efter pelletering av cellerna vid 400 g i fem minuter, suspendera dem igen i 50 mikroliter kallt humant expansionsmedium kompletterat med 5% ECM. Placera organoidsuspensionen på is och fortsätt omedelbart till transplantationen. För ortotopisk transplantation hos möss, aspirera organoidsuspensionen i en insulinnål.När musen sover, placera den snabbt på sin sida med huvudtårkörteln tillgänglig. Injicera fem mikroliter av organoidsuspensionen direkt genom huden in i tårkörteln. Låt musen återhämta sig och bedöma förekomsten av transplantationsrelaterat obehag dagligen, särskilt i ögat.Efter dissektion av muskrackkörteln genererade den enzymatiska och mekaniska matsmältningen små vävnadsfragment, inklusive acini och kanalerna. I den framgångsrika muskrackkörtelorganoidhärledningen hittades cystiska organoider med cirka 500 mikrometers diameter efter sju dagar. Mänskliga lacrimal körtelorganoider växte som cystor inom tre till fyra dagar och nådde en fullvuxen storlek i 10 till 14 dagar efter vävnadsisolering.Efter fem dagar respektive sju dagar i differentieringsmediet blev mus- och humana lacrimalkörtelorganoider tätare. Tillämpning av den cykliska AMP-aktivatorn forskolin eller signalsubstansen noradrenalin resulterade i organoid svullnad inom mindre än tre timmar. Vid framgångsrik elektroporering växte organoider resistenta mot hygromycin ut.De växande organoidklonerna större än 300 mikrometer plockades före deras differentiering. PCR-amplifiering av Pax6-lokus riktad mot guide-RNA gav ett 367-basparband för alla utvalda kloner. En homozygot knockoutmus-tårkörtelklon av sex sekvenserade erhölls med hjälp av guide-RNA riktat mot Pax6.Vissa kloner växte ut bra, men vissa organoidkloner förlorades efter plockning eller började differentiera. Av de 10 organoidkloner som valdes växte sju ut bra. Organoidgravering bekräftades en månad efter injektion av organoiderna i tårkörteln hos möss genom färgning för en humanspecifik markör, det humana nukleolära antigenet.En sak att vara uppmärksam på är att inte översmälta vävnaden eller organoiderna. Annars kan cellerna dö, och detta skulle minska organoidetableringshastigheten. Lacrimal körtel organoider kan analyseras med histologi.Genom att göra det kan man få insikt i deras cellulära sammansättning.

Research

JoVE Journal

Biology

Generation of Human CD40-activated B cells

Generering av Human CD40-aktiverade B-celler

CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been identified as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cancer ...

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells  

Kultur och underhåll av mänskliga embryonala stamcellslinjer

Human embryonic stem (hES) cells must be monitored and cared for in order to maintain healthy, undifferentiated cultures. At minimum, the cultures must be ...

Isolation and Genetic Manipulation of Adult Cardiac Myocytes for Confocal Imaging

Isolering och genetisk manipulation av vuxen Cardiac myocyter för Confocal Imaging

Cardiac myocytes isolated from adult hearts are widely accepted as a model somewhere half way between embryonic and neonatal muscle cells on one side and ...

Genetic Modification and Recombination of Salivary Gland Organ Cultures

Genetisk modifiering och rekombination av saliv kulturer Gland Organ

Branching  morphogenesis occurs during the development of many organs, and the embryonic  mouse submandibular gland (SMG) is a classical model for the ...

Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells

Generering av Human Cardiomyocytes: differentiering protokoll från Feeder-fria mänskliga inducerade pluripotenta stamceller

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is ...

Alternative Cultures for Human Pluripotent Stem Cell Production, Maintenance, and Genetic Analysis

Alternativa kulturer för Human pluripotenta stamceller Produktion, underhåll, samt genetisk analys

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and ...

Manipulating the Murine Lacrimal Gland

Manipulera Murin tårkörteln

The lacrimal gland (LG) secretes aqueous tears necessary for maintaining the structure and function of the cornea, a transparent tissue essential for ...

Establishment and Maintenance of Gnotobiotic American Cockroaches (Periplaneta americana)

Establishment and Maintenance of Gnotobiotic American Cockroaches Periplaneta americana

Etablering och underhåll av Gnotobiotic American Cockroaches (Periplaneta americana)

Gnotobiotic animals are a powerful tool for the study of controls on microbiome structure and function. Presented here is a protocol for the establishment ...

Establishment and Genetic Manipulation of Murine Hepatocyte Organoids

Etablering och genetisk manipulering av Murine Hepatocyte Organoids

The liver is the largest organ in mammals. It plays an important role in glucose storage, protein secretion, metabolism and detoxification. As the ...

Three-Dimensional, Serum-Free Culture System for Lacrimal Gland Stem Cells

Tredimensionellt, serumfritt odlingssystem för lacrimalkörtelstamceller

Lacrimal gland (LG) stem cell-based therapy is a promising strategy for lacrimal gland diseases. However, the lack of a reliable, serum-free culture ...